2.1  体外细胞实验结果

2.1.1  两种材料表面的细胞存活  共培养7 d后，共聚焦显微镜显示小鼠成骨细胞MC3T3-E1可在两种材料表面生长存活，生长状态良好，见图2。

2.1.2  两种材料表面的细胞黏附  共培养7 d后，扫描电镜显示小鼠成骨细胞MC3T3-E1均可在两种材料表面黏附，但在淫羊藿苷去蛋白无机牛骨复合材料表面的细胞黏附更多、分布更加均匀，见图3。

2.1.3  两种材料表面的细胞成骨性能  共培养5 d时，观察组细胞碱性磷酸酶活性虽高于对照组，但是差异无显著性意义(P > 0.05)；共培养10 d时，观察组细胞碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P < 0.05)，见图4。

2.2  动物体内实验结果

2.2.1  术后动物一般情况  30只兔无意外死亡，术后当天开始进食，前3 d进食量有所减少，术后3 d恢复正常。术后动物活动正常，切口愈合良好，未出现炎性反应，切口均一期愈合。

2.2.2  影像学检测结果  术后4周时，实验侧骨缺损区可见少量骨组织形成，骨缺损区与周围骨质界限清晰；对照侧骨缺损区呈低密度透光影。术后8周时，实验侧骨缺损区密度较术后4周时增高，骨缺损区域周围骨质界限模糊；对照侧仅骨缺损区边缘可见少量骨组织。术后12周时，实验侧缺损区充满大量骨组织生成，与周围正常骨质的密度接近；对照侧仍可见明显的骨缺损区域，见图5。

2.2.3  组织学观察结果  见图6。

术后4周时：实验侧缺损区内材料少量降解，缺损区可见纤维组织及新生骨组织填充，材料之间有网状的新生骨；对照侧缺损区材料少量降解，缺损区也可见纤维组织及新生骨组织填充，但材料之间的成骨量少于实验侧。

术后8周时：骨缺损区材料部分降解，缺损区可见纤维组织及新生骨组织填充，材料之间可见大量新生骨组织，骨量明显多于术后4周；对照侧缺损区材料部分降解，缺损区可见纤维组织及新生骨组织填充，材料之间的成骨量与实验侧术后4周时相当。

术后12周时：实验侧缺损区可见少量脂肪组织，材料大部分降解，可见大量的成熟骨组织；对照侧缺损区材料大部分降解，骨组织生成量增多，但骨量与骨成熟度均低于实验侧。

两组不同时间点的新骨生成面积百分比见表2。

2.2.4  改良Gomori染色观察结果  术后4周时，实验侧与对照侧均可见少量新生骨，新生骨成熟度较低，但是实验侧可见相对较多的骨基质，而对照侧可见较多的类骨质。术后8，12周，实验侧新骨生成量逐渐增多，骨成熟度逐渐增高；对照侧新生骨量与骨成熟度也逐渐升高，但与实验侧相比差距明显，见图7。

临床中因创伤、感染、肿瘤等原因造成的颌骨缺损较为常见，严重影响了后期义齿修复与进食等重要功能。目前临床处理骨缺损的手段主要是传统的骨移植手术，常使用的骨替代材料主要有自体骨、同种异体骨、异种骨，自体骨移植存在取骨量有限且存在二次创伤的不足，而其余骨替代材料则存在传播疾病、免疫排斥与成骨性能差等不足。因此，多种骨替代材料被研制或开发出来。

去蛋白无机牛骨是采用化学提纯法从牛骨中提取的碳酸磷灰石晶体，去除了蛋白及其他的有机成分，保留了多孔天然骨的无机机构，与人体骨的结构相似，目前已被广泛应用于口腔临床骨再生手术^[1-3]。去蛋白无机牛骨具有骨引导功能，植入人体后可为骨缺损区提供理想的支架结构，引导骨组织向内生长与沉积，是一种较好的可降解吸收的骨修复材料^[4-5]。但是去蛋白无机牛骨缺乏成骨诱导能力，限制了其成骨效果^[6]。

淫羊藿是一种具有补肾壮阳、祛风除湿功效的中药，临床多用于免疫力低下、性功能障碍与抗衰老食疗等。而淫羊藿苷是淫羊藿的有效药理成分，近年来的研究发现其具有防治骨质疏松作用^[7-8]，并且研究已证实淫羊藿苷可促进间充质干细胞、成骨细胞的成骨分化与成血管因子的表达^[9]。因此实验将淫羊藿苷负载于去蛋白无机牛骨中，对比其与去蛋白无机牛骨修复骨缺损的效果。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  体外与动物体内观察性实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年12月至2019年5月在牡丹江市医学院完成。

1.3  材料  去蛋白无机牛骨购自广州市白云区天上及品贸易商行，见表1。淫羊藿苷去蛋白无机牛骨复合材料委托黑龙江工程学院材料与化学工程学院制备，复合材料中去蛋白无机牛骨材料与淫羊藿苷的质量比为4∶1，经其测试该材料无明显毒副作用，并且具有良好的缓释性能，体外实验显示28 d时药物释放量为(50.23±3.20)%。

1.3.1  实验动物  10周龄健康新西兰大白兔30只，雌雄均可，体质量(2.3±0.1)kg，由牡丹江医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK-2017-001。实验开始前动物禁食12 h。实验获得牡丹江医学院实验动物中心伦理委员会批准。

1.3.2  实验用主要试剂与仪器  齿科打磨机购自北京图斯凯医疗器械有限公司；戊巴比妥钠购自合肥源亿达化工有限公司；光学显微镜购自重庆奥特光学显微镜有限公司；锥形束CT(PLX3000A)由安徽医科大学提供；Quantichrom^TM碱性磷酸酶检测试剂盒(北京群晓科苑生物技术有限公司)；Live/Dead染色试剂盒(艾美捷科技有限公司)；苏木  精-伊红染色试剂盒购自武汉艾米尼森生物医药有限责任公司；改良Gomori染色三色购自上海联硕生物科技有限公司；扫描电镜(EM-30 Plus)购自北京天耀科技有限公司。

1.4  方法

1.4.1  体外细胞实验

复合材料与成骨细胞共培养：将消毒的淫羊藿苷去蛋白无机牛骨复合材料(观察组)与去蛋白无机牛骨材料(对照组)置于96孔板内，将对数生长期的小鼠成骨细胞MC3T3-E1(BNN1190，上海北诺生物科技有限公司)分别接种于两种材料表面，接种细胞密度为1×10⁵/孔，每组6复孔。

材料上细胞的存活：共培养7 d后，将支架样本以PBS清洗后加入Live/Dead染色试剂，依照实试剂盒说明书操作，于共聚焦显微镜下观察细胞存活情况。

材料上细胞的黏附：共培养7 d后取支架与细胞复合物，分别经2.5%戊二醛、1%锇酸固定，脱水干燥，仔细切割成薄片，喷金后抽真空，进行扫描电镜观察。

材料上细胞的成骨分化：共培养5，10 d后，使用Quantichrom™碱性磷酸酶检测试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性。

1.4.2  动物体内实验

骨缺损模型的制备：取30只新西兰大白兔，称质量后耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉，常规消毒、铺巾，随后以2%利多卡因局部浸润麻醉，在双侧下颌体部下缘分别作一长2.5-3.0 cm的纵行切口，暴露下颌骨正中联合与咬肌前缘，利用齿科打磨机的裂钻在低速下制作  13 mm×6 mm×4 mm的全层骨缺损(图1)，一并去除骨缺损处骨膜，采用生理盐水反复冲洗缺损部位，观察创面无活动性出血后，右侧植入淫羊藿苷去蛋白无机牛骨复合材料，作为实验侧；左侧植入去蛋白无机牛骨材料，作为对照侧。分层缝合肌肉、皮下组织与皮肤切口。术后肌注青霉素40×10⁴ U，1次/d，连续注射7 d预防感染。术后定期观察动物饮食、活动与切口创伤反应。

标本采集：术后4，8，12周，每个时间点随机选10只兔，称质量后耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉，耳缘静脉空气栓塞法处死，获取双侧下颌骨标本，备用。

影像学检测：取术后4，8，12周游离的下颌骨标本，在骨缺损区进行锥形束CT检测，观察骨缺损区变化与骨质密度变化。

组织学观察：将下颌骨标本固定于40 g/L多聚甲醛中48 h，然后置入EDTA脱钙液中脱钙，脱钙完全后流水冲洗24 h，梯度乙醇脱水，放入二甲苯中透明，浸蜡、包埋、切片(切片厚度约5 µm)，常规苏木精-伊红染色，光镜下观察。采集图像，利用Photoshop软件分析新生骨面积百分比，每个标本随机选取3个部位，取平均值。

改良Gomori染色观察：将下颌骨标本固定于40 g/L多聚甲醛中48 h，然后置入EDTA脱钙液中脱钙，脱钙完全后流水冲洗24 h，梯度乙醇脱水，放入二甲苯中透明，浸蜡、包埋、切片(切片厚度约5 µm)，苏木精染核显蓝后，变色酸2R染色液染色5 min，醋酸水溶液清洗3次，亮绿复染1 min，体积分数95%与无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，镜下观察。

1.5  主要观察指标  两组材料表面成骨细胞的存活、黏附及成骨性能，以及两种材料植入兔下颌骨缺损后的促成骨性能。

1.6  统计学分析  采用SPSS 22.0统计学软件进行统计处理，计量资料以x(_)±s表达，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

体内外实验证实，淫羊藿苷可促进间充质干细胞的成骨分化，是一种良好的骨诱导因子^[10-12]。张黎声等^[11]报道淫羊藿苷能够显著促进骨形成，增加骨小梁密度及骨小梁厚度。刘天麟等^[12]研究发现淫羊藿苷能够促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化，增加钙盐沉积，降低脂质形成，进而有效防治骨质疏松的发生。以上结果提示淫羊藿苷具有明显的促成骨性能。此次实验结果显示，小鼠成骨细胞MC3T3-E1可在淫羊藿苷去蛋白无机牛骨复合材料与去蛋白无机牛骨材料表面良好的生长与黏附，并且在淫羊藿苷去蛋白无机牛骨复合材料表面的黏附情况均明显好于去蛋白无机牛骨材料，说明淫羊藿苷可促进成骨细胞的黏附；同时成骨分化实验显示淫羊藿苷去蛋白无机牛骨复合材料表面的细胞碱性磷酸酶活性高于去蛋白无机牛骨材料，说明淫羊藿苷可促进成骨细胞的分化，与以往的研究结论一致^[13-15]。

理想的骨修复材料应具备以下特点：良好的生物相容性与生物安全性；良好的骨引导与骨诱导作用；具有一定的机械强度与硬度；对人体无害，无排斥反应；良好的表面活性；良好的可降解性。去蛋白无机牛骨的化学组成与晶体结构类似于人体骨，并具有较高的亲水性与多孔结构，可引导细胞向其内部生长及营养物质的进入，具有良好的降解性能、生物安全性与骨引导作用，但是其缺乏骨诱导性能。为了克服该缺点，实验将淫羊藿苷加入去蛋白无机牛骨材料中，观察其修复骨缺损的效果。

实验将淫羊藿苷加入去蛋白无机牛骨材料中，同时以去蛋白无机牛骨材料为对照，进一步观察其体内成骨性能。苏木精-伊红染色显示，实验侧骨缺损区植入材料逐渐降解，至术后12周时材料大部分降解，被大量成熟的骨组织替代，而对照侧缺损部位材料也大部分降解，但是新骨生成量与骨成熟度均不及实验侧，提示淫羊藿苷可促进骨缺损的修复速度。改良Gomori染色进一步证实了苏木精-伊红染色结果。

锥形束CT显示，术后4周时两侧骨缺损均无明显的骨组织形成，但是随着时间的延长，两侧骨缺损均有不同程度的修复，至术后12周时，实验侧基本完成骨缺损的修复，而对照侧骨缺损未完全愈合，说明淫羊藿苷去蛋白无机牛骨复合材料具有良好的骨缺损修复效果。

研究认为淫羊藿苷可能通过以下途径促进成骨细胞的增殖与分化：①调控成骨细胞基因的表达：淫羊藿苷可促进体外培养成骨细胞增殖，可能通过促进骨形态发生蛋白2、骨保护素蛋白表达和骨形态发生蛋白2、骨保护素、碱性磷酸酶mRNA的表达完成^[16]；②调控成骨细胞信号通路：有研究发现淫羊藿苷可呈浓度依赖性的提高MC3T3-E1Subclone14前体成骨细胞株的碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素和矿化结节数量，其作用主要是通过雌激素受体与p38MAPK信号通路实现的^[17]。另外，HSIEH等^[18]研究发现，淫羊藿苷可通过NO与骨形态发生蛋白信号通路促进成骨细胞的增殖、分化及矿化结节的形成；③调控成骨细胞细胞因子：淫羊藿苷可通过促进成骨细胞内转化生长因子β1基因的表达，抑制白细胞介素6基因与肿瘤坏死因子α基因的表达来促进骨形成、抑制骨吸收。尽管如此，目前对于淫羊藿苷的最合适作用浓度与作用机制仍不是很明确，还有待进一步的研究。

实验中动物术后切口无炎性反应，均一期愈合，组织学观察也未见明显的排异反应，说明淫羊藿苷去蛋白无机牛骨复合材料具有良好的生物相容性，可较为安全的进行体内实验。

实验通过自身对照的方式证实相对于去蛋白无机牛骨材料，淫羊藿苷去蛋白无机牛骨复合材料可促进下颌骨缺损的修复，但是实验设计还存在一定的缺陷，未设置自体骨移植对照，下一步的实验将与自体骨移植进行对比，进一步分析淫羊藿苷去蛋白无机牛骨复合材料的骨缺损修复作用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

去蛋白无机牛骨：是采用化学提纯法从牛骨中提取的碳酸磷灰石晶体，去除了蛋白及其他的有机成分，而保留了多孔天然骨的无机机构，与人体骨的结构相似，目前已被广泛应用于口腔临床骨再生手术。

淫羊藿苷：是一种具有补肾壮阳、祛风除湿功效的中药，临床多用于免疫力低下、性功能障碍与抗衰老食疗等。淫羊藿苷是淫羊藿的有效药理成分，近年来的研究发现其具有防治骨质疏松，并且其可促进间充质干细胞、成骨细胞的成骨分化与成血管因子的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

淫羊藿是一种具有补肾壮阳、祛风除湿功效的中药，临床多用于免疫力低下、性功能障碍与抗衰老食疗等。而淫羊藿苷是淫羊藿的有效药理成分，近年来的研究发现其具有防治骨质疏松作用，并且研究已证实淫羊藿苷可促进间充质干细胞、成骨细胞的成骨分化与成血管因子的表达。因此实验将淫羊藿苷负载于去蛋白无机牛骨中，对比其与去蛋白无机牛骨修复骨缺损的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程#br#