淫羊藿苷调控髓核来源间充质干细胞凋亡修复椎间盘退变

doi:10.12307/2023.668

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (24): 3803-3809.doi: 10.12307/2023.668

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淫羊藿苷调控髓核来源间充质干细胞凋亡修复椎间盘退变

张文捷1，张勇1，史明1，唐广军1，石鹏志2 ，王俊武2，胡满2，王平川2 ，张亮2

1International Zhuang Hospital, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Clinical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China

收稿日期:2022-05-31 接受日期:2022-09-15 出版日期:2023-08-28 发布日期:2023-01-18
通讯作者: 张勇，博士，副主任医师，广西中医药大学国际壮医医院，广西壮族自治区南宁市 530001
作者简介:张文捷，男，1969年生，江西省鹰潭市人，汉族，2003年第三军医大学外科(野战外)学毕业，博士，主任医师，主要从事骨关节与脊柱科研究。
基金资助:
广西壮族自治区中医药管理局自筹经费科研课题(GZZC2020146)，项目负责人：张勇；广西国际壮医医院重点项目(GZ2021009)，项目负责人：张勇

Icariin regulates apoptosis of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells to repair intervertebral disc degeneration

Zhang Wenjie1, Zhang Yong1, Shi Ming1, Tang Guangjun1, Shi Pengzhi2, Wang Junwu2, Hu Man2, Wang Pingchuan2, Zhang Liang2

1International Zhuang Hospital, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Clinical College of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China

Received:2022-05-31 Accepted:2022-09-15 Online:2023-08-28 Published:2023-01-18
Contact: Zhang Yong, MD, Associate Chief physician, International Zhuang Hospital, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Zhang Wenjie, MD, Chief physician, International Zhuang Hospital, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
The Traditional Chinese Medicine Administration Subject of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. GZZC2020146 (to ZY); a grant from International Zhuang Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. GZ2021009 (to ZY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

淫羊藿苷：是中国传统中药淫羊藿的主要活性成分，属于8-异戊烯基黄酮苷类化合物。由于具有诸多生物活性，如抗氧化应激、抗炎、抗抑郁和抗肿瘤等，淫羊藿苷在骨质疏松症、心血管疾病、神经系统疾病以及生殖系统疾病等诸多疾病中被广泛开展研究。
髓核来源间充质干细胞：在正常或退变椎间盘髓核组织内均存在间充质干细胞，可分化为髓核细胞来维持髓核功能。髓核来源间充质干细胞的凋亡增加可能是椎间盘退变的重要原因之一。

背景：椎间盘退变是导致腰痛的最常见原因之一，内源性髓核来源间充质干细胞的数量减少及功能减退可能是导致椎间盘退变的重要原因，一定范围内的淫羊藿苷可能通过PI3K/Akt信号通路减少间充质干细胞凋亡。
目的：探讨淫羊藿苷调控髓核来源间充质干细胞凋亡的可能机制。
方法：获取SD大鼠退变椎间盘髓核来源间充质干细胞，以不同浓度淫羊藿苷干预第3代髓核来源间充质干细胞，CCK-8法检测细胞活力及增殖情况。将第3代髓核来源间充质干细胞分为对照组、淫羊藿苷组及LY294002组，干预1周后通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，Tunel荧光检测Tunel染色阳性细胞数，RT-PCR及免疫荧光检测Caspase-3、Bcl-2、Bax、p-Akt及p53的mRNA及蛋白表达水平。将16只椎间盘退变模型SD大鼠均分为淫羊藿苷组[淫羊藿苷灌胃50 mg/(kg•d)]及对照组(等量生理盐水灌胃)，在治疗前、治疗后2周及4周时行大鼠尾椎X射线片、MRI检查及苏木精-伊红染色评估椎间盘退变。

结果与结论：①一定浓度范围内的淫羊藿苷可促进髓核间充质干细胞增殖，在0.1 μmol/L时细胞活力达到最佳(P < 0.05)；②与对照组比较，淫羊藿苷组的细胞凋亡率、Tunel染色阳性细胞数、Caspase-3、Bax及p53表达显著下降，p-Akt及Bcl-2表达显著增加(P < 0.05)；PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002干预后可以逆转淫羊藿苷的保护作用(P < 0.05)；③在动物模型水平，淫羊藿苷治疗后椎间盘退变程度得到延缓，与对照组比较，治疗4周时椎间隙高度指数及MRI评分及苏木精-伊红染色评分差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明，在一定浓度范围内，淫羊藿苷以浓度依赖性方式促进退变椎间盘来源髓核间充质干细胞增殖，可通过PI3K/Akt信号通路调节髓核间充质干细胞凋亡，进而一定程度上改善椎间盘退变程度。

https://orcid.org/0000-0001-5357-0128 (张文捷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 淫羊藿苷, 髓核间充质干细胞, 椎间盘退变, 凋亡, PI3K/Akt信号通路

Abstract: BACKGROUND: Intervertebral disc degeneration is one of the most common causes of low back pain. The decrease in the number and dysfunction of endogenous nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells may be an important cause of intervertebral disc degeneration. Icariin within a certain range may reduce the apoptosis of mesenchymal stem cells through the PI3K/Akt signaling pathway.
OBJECTIVE: To investigate the mechanisms underlying the effects of icariin on apoptosis of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: The nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells were isolated from degenerated disc of Sprague-Dawley rats. Nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells of passage 3 were treated with different concentrations of icariin. CCK-8 assay was used to detect cell viability and proliferation. Nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells of passage 3 were divided into control, icariin, and LY294002 groups. The apoptosis was detected by flow cytometry and TUNEL staining at 1 week after treatment. The mRNA and protein expression of Caspase-3, Bcl-2, Bax and PI3K/Akt signaling pathway-related proteins p-Akt and p53 was detected by real-time polymerase chain reaction and western blotting. Sixteen Sprague-Dawley rat intervertebral disc degeneration models were equally divided into icariin (icariin 50 mg/kg per day intragastrically) and control groups (equivalent normal saline intragastrically). X-ray, MRI and hematoxylin-eosin staining were performed to evaluate disc degeneration before, 2 and 4 weeks after treatment.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Icariin promoted the proliferation of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells at a certain concentration range, and the best concentration was 0.1 μmol/L (P < 0.05). (2) The apoptosis rate, the number of TUNEL-positive cells, mRNA and protein expression of Caspase-3, Bax and p53 in the icariin group were significantly decreased compared with the control group, while the expression levels of p-Akt and Bcl-2 were significantly increased (P < 0.05). LY294002 (PI3K/Akt signaling pathway inhibitor) reversed the protective effect of icariin on nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells (P < 0.05). (3) The disc degeneration was delayed after icariin treatment in the animal models. There were significant differences in the Disk Height Index, MRI scores, and hematoxylin and eosin staining scores between the icariin and control groups at 4 weeks (P < 0.05). (4) The results show that icariin can promote the proliferation of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells in a concentration-dependent manner within a certain concentration range. Furthermore, icariin can inhibit nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell apoptosis by activating PI3K/Akt signaling pathway to delay disc degeneration.

Key words: icariin, nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell, disc degeneration, apoptosis, PI3K/Akt signaling pathway

中图分类号:

张文捷, 张勇, 史明, 唐广军, 石鹏志, 王俊武, 胡满, 王平川, 张亮. 淫羊藿苷调控髓核来源间充质干细胞凋亡修复椎间盘退变[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(24): 3803-3809.

Zhang Wenjie, Zhang Yong, Shi Ming, Tang Guangjun, Shi Pengzhi, Wang Junwu, Hu Man, Wang Pingchuan, Zhang Liang. Icariin regulates apoptosis of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells to repair intervertebral disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(24): 3803-3809.

图/表（结果） 7

2.1 NPMSC形态观察及鉴定结果原代细胞接种48-72 h后开始贴壁，贴壁细胞早期均可形成葵花样细胞集落，5-7 d后贴壁细胞逐渐增多，增殖细胞从岛状的细胞集落分化而来，细胞核类圆盘状，核仁明显，胞浆较淡，见图1A。第3代细胞形态几乎均呈现为纺锤长梭形，见图1B。通过免疫荧光检测间充质干细胞相关表面抗原分子，结果发现第3代NPMSC高表达间充质干细胞阳性相关表面抗原分子CD73、CD90及CD105，低表达相关阴性抗原分子CD34及CD45，见图1C。免疫荧光结果与作者先前研究的流式细胞仪检测结果一致[7，12]。

2.2 不同浓度淫羊藿苷对NPMSC增殖的影响通过CCK-8检测细胞增殖活力，结果发现与空白组比较，含低浓度(0.01，0.1，1 μmol/L)淫羊藿苷的培养基培养后NPMSC活力增加，在0.1 μmol/L时细胞活力达到最佳；而高浓度(10 μmol/L)时细胞活力明显降低(P < 0.05)，见图2。因此0.1 μmol/L被选择为最佳干预浓度用于后续研究。

2.3 淫羊藿苷对NPMSC凋亡的影响通过流式细胞仪检测发现淫羊藿苷组细胞凋亡率较对照组明显下降，而LY294002组细胞凋亡率较淫羊藿苷组有所增加，但仍较对照组低(P < 0.05)，见图3。Tunel染色显示淫羊藿苷组凋亡细胞较对照组明显减少，而LY294002组较淫羊藿苷组有所增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.4 淫羊藿苷对相关蛋白及mRNA表达的影响通过免疫荧光及RT-PCR检测相关蛋白及mRNA表达。与对照组比较，淫羊藿苷组的促凋亡蛋白Caspase-3、Bax、p53在蛋白水平及mRNA水平均显著减少，而p-Akt及抑凋亡蛋白Bcl-2表达明显增加，差异均有显著性意义(P < 0.05)。与淫羊藿苷组比较，LY294002组促凋亡蛋白Caspase-3、Bax及p53表达明显增加，而p-Akt及抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著减少，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图5。 2.5 淫羊藿苷对椎间盘退变的影响对照组椎间隙高度进一步降低，与治疗前椎间隙高度指数比较，治疗2周及4周时，差异均有显著性意义(P < 0.05)。淫羊藿苷组治疗2周后椎间隙高度降低不明显，与治疗前比较，差异无显著性意义；但4周时与对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

对照组椎间盘退变程度进一步加重，与治疗前MRI评分比较，4周时差异有显著性意义(P < 0.05)。淫羊藿苷组治疗4周后椎间盘评分降低，然而与治疗前及对照组的MRI评分比较，治疗4周时差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

苏木精-伊红染色结果显示，对照组髓核细胞明显减少，取而代之的是软骨样细胞，髓核与纤维环界限变得模糊且排列紊乱；苏木精-伊红染色评分逐渐降低，与治疗前比较差异有显著性意义(P < 0.05)。淫羊藿苷组较对照组细胞外基质丰富，纤维环排列整齐；苏木精-伊红染色评分逐渐降低，与治疗前差异均有显著性意义(P < 0.05)；与治疗4周时的对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图8。

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引言

腰痛是近30年来全球范围内成人致残的首要病因，给社会和家庭带来极大的经济负担[1]。椎间盘退变是腰痛的最主要致病因素，但其病理机制目前尚未阐明。既往研究认为髓核细胞凋亡是椎间盘退变的重要原因[2]。2007年首次在人退变椎间盘中发现髓核来源间充质干细胞(nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cell，NPMSC)的存在，这为椎间盘退变的病因学研究提供新方向[3]。文献报道内源性NPMSC的数量减少及功能减退可能是导致椎间盘退变的重要原因[4-6]。作者前期研究发现从大鼠退变椎间盘分离提取的NPMSC存在干性基因表达下降、细胞增殖能力减退及细胞凋亡增加等问题[7]。因此，减少NPMSC凋亡将为治疗椎间盘退变性疾病寻找新的方法提供理论依据，具有极大的临床应用价值。
《本草纲目》中记载：淫羊藿具有益精气、坚筋骨、实腰膝、强心力之功效。淫羊藿苷是一种从淫羊藿中提取的异黄酮类化合物，具有补肾壮阳、延缓衰老的作用。WANG等[8]研究发现淫羊藿苷在一定浓度范围内(10-9-10-6 mol/L)以剂量依赖性方式促进羊膜间充质干细胞增殖。YAO等[9]研究则发现淫羊藿苷可以保护铁过载导致的骨髓间充质干细胞凋亡，其机制在于淫羊藿苷可通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路参与调控细胞的线粒体融合与分裂，说明在一定范围内淫羊藿苷可能通过PI3K/Akt信号通路减少间充质干细胞凋亡。DENG等[10]进一步研究则发现淫羊藿苷可能通过PI3K/Akt信号途径减轻H2O2诱导的髓核细胞凋亡。因此，淫羊藿苷可能通过PI3K/Akt信号途径减轻间充质干细胞及髓核细胞凋亡。但目前淫羊藿苷对于NPMSC的影响仍不得而知。
实验在体外分离培养椎间盘退变大鼠的NPMSC，探讨淫羊藿苷对退变椎间盘来源NPMSC凋亡及椎间盘退变的影响和可能机制。

材料方法

1.1 设计体外细胞实验和动物体内椎间盘退变模型实验。
1.2 时间及地点实验于2021年1月至2022年3月在扬州大学临床医学院骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物清洁级SD大鼠20只，3月龄，体质量250-300 g，雌雄不限，由江苏大学动物中心提供，合格证号：SYXK(苏)2018-0012，在室温、食物充足及12 h昼夜节律的条件下饲养。实验方案经扬州大学临床医学院动物实验伦理委员会批准，批准号为SBYY2020-039。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 实验试剂和仪器 0.2%Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)；标准间充质干细胞培养基、间充质干细胞专用胎牛血清(Cyagen公司)；0.25%胰蛋白酶、双抗、PBS(Hyclone公司)；CCK-8、一步法TUNEL细胞凋亡染色试剂盒、DAPI(碧云天)；TRIzol试剂(Invitrogen公司)；一抗：CD90、CD73、CD34、CD45、Caspase-3、Bax、Bcl-2(ABclonal公司)，p-Akt(Bioss公司)，CD105、p53(Proteintech公司)；二抗山羊抗兔IgG(Abcam公司)；培养瓶、6孔板、12孔板、96孔板(Corning公司)；离心机(Centrifuge公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(KeyGen公司)；电泳、电转系统(Bio-Rad公司)；荧光显微镜(Leica公司)；酶标仪(Thermo公司)；流式细胞仪(BD公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 NPMSC的分离培养采用既往方法建立20只SD大鼠椎间盘退变模型[11]，建模2周后采用既往方法获取NPMSC[12]。

取其中4只大鼠分离获取NPMSC，显微镜下将髓核切成约1 mm×1 mm×1 mm大小，0.2%Ⅱ型胶原酶消化4 h，用180目滤网过滤消化液，1 500 r/min离心5 min收集细胞，标准间充质干细胞培养基均匀重悬接种至25 cm2培养瓶。培养1周后，更换培养液，去除悬浮细胞以及组织碎片，重新加入培养基重悬后接种至培养瓶，于37 ℃、体积分数为5%CO2恒温箱中培养，每两三天换液1次，待细胞铺满瓶底80%后传代。第3代细胞用于后续实验。

1.4.2 免疫荧光检测细胞免疫表型将第3代NPMSC接种在细胞爬片上置于完全培养基中培养至50%左右融合，40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤2次后室温下用0.5%Triton X-100通透15 min，PBS洗涤3次后在37 ℃下用体积分数10%胎牛血清白蛋白封闭1 h，加入一抗CD105、CD90、CD73、CD34和CD45(1∶1 000) 4℃孵育过夜，PBS洗涤2次后在室温条件下加入荧光二抗(1∶10 000)孵育1 h，PBS洗涤后DAPI避光孵育10 min，最后使用荧光显微镜观察获取图像。
1.4.3 不同浓度淫羊藿苷对NPMSC增殖的影响第3代NPMSC以5×103/孔接种于96孔板中，分为6组，每组设 6个复孔。细胞完全贴壁后，加入含不同浓度(0，0.01，0.1，1及10 μmol/L)淫羊藿苷的间充质干细胞培养基培养2 d，PBS洗涤，加入CCK-8试剂(10 μL/孔)后37 ℃孵育2 h，酶标仪检测450 nm波长处吸光度值，同时设置空白对照组。
1.4.4 实验分组及干预第3代NPMSC分为对照组(培养基培养)、淫羊藿苷组(合适浓度淫羊藿苷+培养基)及LY294002组(PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002预处理2 h+合适浓度淫羊藿苷+培养基)，48 h后进行后续检测。
1.4.5 流式细胞仪检测细胞凋亡第3代NPMSC按6×105/孔接种在6孔板中培养至细胞融合达80%，根据分组施加不同干预后收集细胞，按Annexin-V/PI试剂盒说明书操作，PBS洗涤2次，消化离心后重悬细胞于500 μL PBS中，充分吹散细胞，加入5 μL的 Annexin-V FITC液，室温避光孵育15 min，再加入5 μL的PI染色液，室温避光反应5 min后上机检测。
1.4.6 Tunel荧光检测第3代NPMSC(5×104/孔)接种于12孔板中，根据分组施加不同干预后收集细胞，PBS洗涤1次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤后室温下0.3% Triton X-100孵育5 min，PBS洗涤3次，分别加入50 μL Tunel检测液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗涤3次，抗荧光淬灭封片液封固后荧光显微镜下观察。

1.4.7 RT-PCR测定检测相关mRNA表达按照前述方法分组干预后收集NPMSC，采用Trizol法提取细胞总RNA，酶标仪检测RNA浓度及纯度，以反转录获得的cDNA为模板，β-actin为内参进行扩增，RT-PCR检测Akt、Bax、Bcl-2、Caspase-3及p53的mRNA表达。根据2-ΔΔCt法计算靶基因的mRNA相对表达水平，每个样品重复3次。引物序列具体信息见表1。

1.4.8 免疫荧光检测相关蛋白表达按照前述方法分组干预后收集NPMSC，40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤后室温下0.5%Triton X-100通透15 min，PBS洗涤后在37 ℃下体积分数10%胎牛血清白蛋白封闭1 h，分别加入一抗(p-Akt、Bax、Bcl-2、Caspase-3及p53)(1∶1 000) 4 ℃条件下孵育过夜，PBS洗涤后加入荧光二抗(1∶10 000)室温条件下孵育1 h，PBS洗涤3次，DAPI避光孵育10 min，借助荧光显微镜观察获取图像。
1.4.9 动物模型施加相关干预及椎间盘退变程度分析模型制作成功后2周，将16只退变模型大鼠分为对照组及淫羊藿苷组，每组8只，淫羊藿苷组给予淫羊藿苷灌胃50 mg/(kg•d)，对照组给予等量生理盐水灌胃。在治疗前、治疗后2周及4周时行大鼠尾椎X射线片及MRI检查。根据X射线片计算椎间隙高度指数用以表示椎间隙高度，相对椎间隙指数(DHI%)=(穿刺后椎间隙高度指数/穿刺前椎间隙高度指数)×100%。根据矢状位T2WI像Pfirrmann进行分级评分[13]。在治疗后2周及4周时采用注射戊巴比妥过量麻醉法处死，切取对照组及淫羊藿苷组椎间盘(包含上下终板)，40 g/L多聚甲醛固定3 d，脱钙处理，石蜡包埋后切片，行苏木精-伊红染色，并按照Norcross等[14]方法评分。
1.5 主要观察指标 ①NPMSC形态及鉴定结果；②不同浓度淫羊藿苷对NPMSC增殖活力的影响；③流式细胞仪及TUNEL染色检测淫羊藿苷对NPMSC凋亡的影响；④免疫荧光及RT-PCR检测p-Akt、Bax、Bcl-2、Caspase-3及p53的蛋白及mRNA表达；⑤X射线片、MRI及苏木精-伊红染色评估淫羊藿苷对椎间盘退变的影响。
1.6 统计学分析数据采用SPSS 22.0统计学软件分析，并使用GraphPad Prism 8制作统计图。计量资料以x±s表示，组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD法，P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已经扬州大学临床医学院苏北人民医院生物统计学专家审核。

讨论

3.1 淫羊藿苷对NPMSC增殖及凋亡的影响间充质干细胞移植是椎间盘退变生物学治疗的重要方法之一，既往虽有不少动物模型研究及临床研究取得一定效果[15]，但移植后的间充质干细胞存在长期存活困难及其他问题，因此一定程度上影响了间充质干细胞的应用[16]。椎间盘内源性间充质干细胞的发现为椎间盘退变的生物学治疗提供了新思路。研究发现与其他类型间充质干细胞比较，NPMSC可以更好地耐受椎间盘退变后低氧、低糖及高渗的局部不利微环境[17-19]。然而随着年龄和椎间盘退变程度加重，NPMSC的数量及功能逐渐下降，由此导致的内源性修复失败也被认为可能是椎间盘退变的主要原因之一[7，20]。因此，如何维持NPMSC的数量及功能也逐渐成为研究热点。淫羊藿苷是8-异戊烯基黄酮苷类化合物，具有抗氧化应激、延缓衰老、抗抑郁、抗肿瘤、免疫调节、影响心血管系统等生物活性，是具有重要药用价值的中药单体[21-23]。近年来，国内已有学者对于淫羊藿苷保护椎间盘退变的作用及其机制进行一定研究。研究表明淫羊藿苷可促进退变髓核细胞增殖、蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白合成，减少白细胞介素1β 及白细胞介素6表达，延缓椎间盘退变[24]。研究还发现淫羊藿素药物可通过抑制Hedgehog信号通路活性起到保护因力学诱导而引起的终板软骨细胞退变作用，从而可能在软骨终板退变引起的椎间盘退变中发挥作用[25]。然而淫羊藿苷对NPMSC影响的研究罕有报道。该实验从SD椎间盘退变动物模型中分离培养出NPMSC并施加不同浓度淫羊藿苷干预，结果证实在适当的浓度范围内淫羊藿苷以浓度依赖性方式促进细胞增殖，其中在0.1 μmol/L时达到最佳，进一步研究还发现淫羊藿苷可以减少细胞凋亡及Tunel染色阳性细胞数，减少促凋亡相关蛋白Caspase-3、p53及Bax表达，增加抑凋亡蛋白Bcl-2表达。因此，合适浓度的淫羊藿苷能够减少退变椎间盘来源的NPMSC凋亡。
3.2 淫羊藿苷减少NPMSC凋亡的机制有研究显示，淫羊藿苷能够促进退变髓核细胞增殖、蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白合成，减少炎性递质白细胞介素1β、白细胞介素6及基质金属蛋白酶13表达，延缓椎间盘退变[26]。研究发现在众多中药复方及单体成分延缓腰椎间盘退行性病变的作用机制中，应用最多的中药单体成分主要包括淫羊藿苷等，主要分子机制包括修复椎间盘微环境及减少髓核细胞凋亡，PI3K/Akt等信号通路可能是其涉及的主要信号通路[27-28]。该研究发现0.1 μmol/L淫羊藿苷可以激活PI3K/Akt信号通路，增加抑凋亡蛋白Bcl-2表达，减少细胞凋亡及促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达，然而LY294002作为PI3K/Akt信号通路的抑制剂可以逆转淫羊藿苷的保护作用，说明淫羊藿苷可能可以通过激活PI3K/Akt信号通路，下调Bax表达，上调Bcl-2表达，激活下游Caspase-3通路，从而抑制NPMSC凋亡。
3.3 淫羊藿苷修复椎间盘退变 HUA等[29]研究发现淫羊藿苷可能通过抑制白细胞介素1β诱导的MAPK和NF-κB相关信号通路激活，从而减少髓核细胞的细胞外基质降解酶产生及细胞外基质合成。进一步研究发现淫羊藿苷还可促进移植的骨髓来源间充质干细胞增殖并分化为髓核样细胞，增加细胞基质合成，从而在椎间盘退变修复中发挥重要作用[30]。作者前期在动物模型水平研究证实可注射水凝胶复合NPMSC移植可以促进细胞外基质Ⅱ胶原及蛋白多糖的合成，并且在组织学及影像学水平均可以延缓动物模型水平椎间盘退变程度，促进退变椎间盘修复与再生[31]。在该研究体内实验中，接受淫羊藿苷治疗的大鼠椎间盘内细胞外基质及纤维环排列均较对照组保留更好，椎间隙高度指数、椎间盘退变等级及组织学评分均优于对照组。因此，淫羊藿苷能够对延缓椎间盘退变发挥积极作用。
然而，该研究也有一定的局限性。首先，使用的NPMSC来自椎间盘退变动物模型，并且在常氧条件下培养，这与人NPMSC及椎间盘退变后的低氧、低糖及高渗的实际环境不符；其次，该研究仅在动物模型水平证实淫羊藿苷可以延缓椎间盘退变，但并未做进一步的深入研究。
综上，该研究发现在一定浓度范围内淫羊藿苷以浓度依赖性方式促进退变椎间盘来源NPMSC的增殖；合适浓度的淫羊藿苷可以通过激活PI3K/Akt信号通路减少NPMSC凋亡，发挥延缓椎间盘退变进程的作用，因此淫羊藿苷可能可以用于椎间盘退变性疾病的治疗。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

淫羊藿苷调控髓核来源间充质干细胞凋亡修复椎间盘退变

Icariin regulates apoptosis of nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells to repair intervertebral disc degeneration

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