静压力作用下三维培养人牙周膜干细胞促进RAW264.7细胞的破骨向分化

doi:10.12307/2023.698

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (24): 3810-3817.doi: 10.12307/2023.698

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静压力作用下三维培养人牙周膜干细胞促进RAW264.7细胞的破骨向分化

韩行，李雯雯，马文盛

河北医科大学口腔医院，河北医科大学口腔医院口腔正畸科，河北省口腔医学重点实验室，河北省口腔疾病临床医学研究中心，河北省石家庄市 050000

出版日期:2023-08-28 发布日期:2023-01-18
通讯作者: 马文盛，博士，教授，主任医师，河北医科大学口腔医院，河北医科大学口腔医院口腔正畸科，河北省口腔医学重点实验室，河北省口腔疾病临床医学研究中心，河北省石家庄市 050000
作者简介:韩行，女，1997年生，河北省保定市人，汉族，硕士，主要从事口腔正畸学及口腔基础研究(干细胞外泌体相关)。
基金资助:
河北省教育厅科学研究重点项目(ZD2017054)，项目负责人：马文盛；河北省医学适用技术跟踪项目(GZ2021038)，项目负责人：马文盛

Three-dimensional cultured periodontal ligament stem cells promote osteoclastic differentiation of RAW264.7 under static compression

Han Xing, Li Wenwen, Ma Wensheng

Stomatological Hospital of Hebei Medical University, Department of Orthodontics of Stomatological Hospital of Hebei Medical University, Key Laboratory of Stomatology in Hebei Province, Clinical Medical Research Center of Stomatology in Hebei Province, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China

Online:2023-08-28 Published:2023-01-18
Contact: Ma Wensheng, PhD, Professor, Chief physician, Stomatological Hospital of Hebei Medical University, Department of Orthodontics of Stomatological Hospital of Hebei Medical University, Key Laboratory of Stomatology in Hebei Province, Clinical Medical Research Center of Stomatology in Hebei Province, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
About author:Han Xing, Master, Stomatological Hospital of Hebei Medical University, Department of Orthodontics of Stomatological Hospital of Hebei Medical University, Key Laboratory of Stomatology in Hebei Province, Clinical Medical Research Center of Stomatology in Hebei Province, Shijiazhuang 050000, Hebei Province, China
Supported by:
Key Scientific Research Project of Hebei Provincial Department of Education, No. ZD2017054 (to MWS); Hebei Medical Applicable Technology Tracking Project, No. GZ2021038 (to MWS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

三维培养：是一种特殊的细胞培养方式，是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。某种程度上更加接近细胞在体内的生理环境，可以维持干细胞的干性，模拟细胞与细胞在空间上的交流，是目前组织工程的研究重点之一。
RAW264.7细胞：为小鼠单核巨噬细胞，是用Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠发生肿瘤后，收集小鼠腹水单核样巨噬细胞得到的细胞株，是目前公认的成系的破骨细胞前体细胞。

背景：牙周膜干细胞作为种子细胞，其成骨潜能成为研究热点，而牙周膜干细胞对破骨细胞活动的调控研究较少，有待进一步探索。
目的：研究持续静压力作用下三维培养人牙周膜干细胞对RAW264.7细胞破骨向分化的影响。
方法：取第3，4代人牙周膜干细胞进行三维培养，随机分为13组，采用FLEXCELL5000C加压仪器，分别施加5 kPa(2，6，12 h)，
25 kPa(2，6，12 h)，45 kPa(2，6，12 h)，65 kPa(2，6，12 h)的持续静压力，第13组不加压。将细胞上清作为条件培养基按照一定比例作用于RAW264.7细胞，5 d后抗酒石酸酸性磷酸酶染色及qPCR检测破骨相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9的表达。

结果与结论：①三维培养下加压实验组与不加压对照组支架形态稳定，细胞状态良好；②压力加载组人牙周膜干细胞条件培养基促进RAW264.7细胞的破骨分化；③在一定范围内，促破骨作用与力值加载条件呈正相关，45 kPa，12 h组促RAW264.7细胞破骨分化作用最强；65 kPa，12 h组的促破骨能力减弱；④结果表明，静压力作用下三维培养的牙周膜干细胞通过旁分泌途径促进RAW264.7的破骨分化，力值加载条件与促破骨作用具有相关性。

https://orcid.org/0000-0002-1583-7271(韩行) ；https://orcid.org/0000-0003-3288-1239(马文盛)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 静压力, 三维培养, 牙周膜干细胞, RAW264.7细胞, 破骨分化

Abstract: BACKGROUND: The osteogenic potential of periodontal ligament stem cells (as seed cells) has become a research hotspot. The regulation of periodontal ligament stem cells on osteoclast activity is less studied and deserves further exploration.
OBJECTIVE: To investigate the effect of three-dimensional cultured periodontal ligament stem cells under continuous static compression on the osteoclastic differentiation of RAW264.7 cells.
METHODS: Periodontal ligament stem cells at passages 3 and 4 were taken for three-dimensional culture and randomly divided into 13 groups. Continuous static compression of 5 kPa (2, 6, and 12 hours), 25 kPa (2, 6, and 12 hours), 45 kPa (2, 6, and 12 hours), and 65 kPa (2, 6, and 12 hours) was applied by FLEXCELL 5000C, and group 13 with no compression. The cell supernatant was used as a conditioned medium to act on RAW264.7 cells. The expression of osteoclast differentiation genes tartrate resistant acid phosphatase, cathepsin K, and matrix metalloproteinase 9 was detected by qPCR and tartrate resistant acid phosphatase staining after 5 days.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The scaffold morphology was stable and the cell status was good in the compression experimental group and the non-compression control group under three-dimensional culture. (2) The conditioned medium of periodontal ligament stem cells in the compression loading group promoted the osteoclastic differentiation of RAW264.7 cells. (3) Within a certain range, the pro-osteoclastic effect was positively correlated with the force conditions. At 45 kPa and 12 hours, RAW264.7 cells had the strongest osteoclastic differentiation effect. The osteoclast-promoting ability of 65 kPa and 12-hour group was weakened. (4) These findings indicated that the osteoclastic differentiation of RAW264.7 cells was promoted by three-dimensional cultured periodontal ligament stem cells under static compression through the paracrine pathway, and the force conditions were correlated with the osteoclast effect.

Key words: static compression, three-dimensional culture, periodontal ligament stem cell, RAW264.7, osteoclastic differentiation

中图分类号:

韩行, 李雯雯, 马文盛. 静压力作用下三维培养人牙周膜干细胞促进RAW264.7细胞的破骨向分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(24): 3810-3817.

Han Xing, Li Wenwen, Ma Wensheng. Three-dimensional cultured periodontal ligament stem cells promote osteoclastic differentiation of RAW264.7 under static compression[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(24): 3810-3817.

图/表（结果） 4

2.1 人牙周膜干细胞分离培养鉴定及RAW264.7细胞培养
(1)人牙周膜干细胞分离培养：组织块法培养5 d后，光镜下可见组织块周围发亮，长梭形细胞自组织块边缘爬出，呈放射状生长。传代培养后细胞与成纤维细胞形态相近，呈现纺锤形，漩涡状生长，见图1A。克隆形成能力测定显示人牙周膜干细胞增殖能力较强，见图1B。人牙周膜干细胞阳性表达间充质干细胞标记物CD90(97.59%)、CD146(99.82%)；阴性表达造血干细胞标记物CD34(0%)和泛白细胞标记物CD45(4.91%)，见图1C，证实该细胞为间充质来源的牙周膜干细胞。对提取的牙周膜干细胞进行成骨诱导，21 d后进行茜素红染色，见图1D，证明牙周膜干细胞具有成骨向分化能力。
(2) RAW264.7细胞培养：购置的RAW264.7细胞因密度过高，大量细胞悬浮于培养基中，将培养瓶置于培养箱，约4 h后将全部贴壁细胞吹打悬浮分置于离心管中，1 000 r/min离心3 min，重新接种到新培养瓶中培养；生长良好的RAW264.7细胞为球形，处于未分化状态，受到外界刺激后易分化，有触角形成，聚团生长，待七八个细胞聚团时即可传代，见图1E。

2.2 人牙周膜干细胞三维培养支架制备及压力加载细胞接种时为圆球形，约2 h后细胞在培养支架内伸展为长梭形，且随时间延长，细胞增殖，密度增加。无血清培养基组与含血清培养基组在48 h内形态无明显差异，含血清培养基组于48 h时细胞密度稍高，见图2A；人牙周膜干细胞三维培养支架可经受压力加载而不破碎，见图2B；最强压力加载实验组与不加压对照组相比，鬼笔环肽进行细胞骨架染色结果显示压力加载组细胞骨架稍皱缩，细胞之间间距减小，更加聚集，其余未见明显差异，见图2C。最强压力加载实验组与不加压对照组活死细胞染色显示均有活、死细胞的存在，且两组红色光显示的死细胞数目无明显差别，绿光标记的活细胞形态状态良好，见图2D。人牙周膜干细胞三维培养支架在压力培养板中状态良好，无破碎情况，见图2E。

2.3 条件培养基作用于RAW264.7细胞后抗酒石酸酸性磷酸酶染色细胞胞质桃红色表示为抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性，证明细胞中破骨相关基因表达。①空白对照组及不加压组细胞上清处理组未见抗酒石酸酸性磷酸酶阳性表达细胞；压力加载实验组可观察到抗酒石酸酸性磷酸酶红染区域；②红染区域的面积呈现一定的表达趋势，相同压力下，随着压力加载时间的延长，抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性区域逐渐增加；相同加载时间下，随着力值的增加，抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性区域逐渐增加，见图3A，B；③但过强的压力加载条件下，65 kPa，12 h组抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性区域的面积反而减少，见图3C；④此外光学显微镜下可以观察到使用RANKL诱导的阳性对照组有大量的多核巨细胞产生，而使用条件培养基干预的实验组则仅呈抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性，并未发现多核巨细胞，见图3A。

由此可见：①压力作用下人牙周膜干细胞条件培养基对RAW264.7细胞的破骨向分化具有促进作用，且随着力值的加大和时间的延长，促进作用增强，但过大力值及时间条件下这种促进作用减弱；②压力作用下人牙周膜干细胞条件培养基对RAW264.7细胞破骨向分化的作用低于诱导因子的阳性对照组。
2.4 qPCR检测破骨相关基因表达情况抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(Cts-K)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)均为RAW264.7细胞破骨向分化过程中高表达的基因。q-PCR结果显示压力加载下获得的人牙周膜干细胞条件培养基作用条件下RAW264.7细胞中破骨相关基因的表达量均有增加，且增高水平与力值及加载时间相关(P < 0.05，P < 0.01)。①在2，6 h两个时间点，随着压力加载力值的加大，破骨相关基因的表达升高；12 h时，随着压力加载力值加大，出现升高后又下降的趋势；②5，25，45 kPa条件下，随着加力时间的延长破骨相关基因表达升高；65 kPa时，随着压力加载时间的延长，破骨相关基因表达存在先升高后降低的趋势。以上结果说明：在一定压力加载强度范围内，人牙周膜干细胞可以通过旁分泌途径促进RAW264.7细胞的破骨向分化；然而过大压力强度下，这种促进作用减弱，见图4。

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引言

机械力刺激在生物发育过程中发挥重要作用，研究表明骨组织健康与机械力刺激密切相关，例如骨结构及骨量的适应是由机械力驱动的[1]。当失去生理量级的机械负荷时，骨矿化减少将导致骨吸收和骨质疏松症[2]。破骨细胞起源于骨髓单核细胞，是骨组织的重要成分，也是维持骨稳态的重要成员[3]。
牙槽骨作为特殊的骨组织结构，其骨稳态的调控在人类口腔健康中至关重要，在口腔稳态调控如加速正畸牙移动及口腔疾病如牙周炎中具有重要意义。正畸牙移动过程中，牙周膜作为口腔中特有组织，传导力学信号并介导骨重塑[4]。研究表明，机械力刺激下人牙周膜细胞在正畸牙移动过程中起着重要的介导作用[5]，牙周膜细胞对破骨细胞的产生和功能活跃以及凋亡具有调控作用[6]。随着组织工程技术的发展，牙周膜干细胞作为种子细胞[7]，其成骨潜能的研究成为热点[8-9]，而牙周膜干细胞对破骨细胞活动的调控研究较少，有待进一步探索。
目前理论研究认为压力刺激介导的骨吸收，其本质为一个无菌性炎症的过程，压应力经牙周膜介导骨吸收的研究大多是牙周膜细胞中炎症因子表达量的测定[10-11]，但炎症因子水平不是单一影响破骨细胞分化的要素，压力加载经由牙周膜干细胞对破骨细胞分化的直接影响研究欠缺，尚待补充。
研究表明二维与三维培养条件下压应力对牙周膜细胞基因表达谱的影响不同[12-13]。以往二维培养条件压力作用下牙周膜细胞对破骨细胞的调控作用研究取得了一定进展[14]，但三维培养条件下牙周膜干细胞对压力-破骨信号的转导情况有待进一步探究；其次，体外模拟压力加载的模型仍旧存在一些不足，如传统加压方式无法保证压力加载的均一性及稳定性，甚至有研究指出传统重力加压情况下，培养皿中央的细胞受到的是拉伸应力并非压应力[15]；此外压力加载数值有待进一步探索，特别是三维培养方式下压力数值的探索研究甚少。因此体外压力加载模型的构建及完善需要进一步的研究支持。
实验采用三维培养方式对牙周膜干细胞进行培养，以期使该培养条件下牙周膜干细胞分泌物质的表达更加接近体内真实情况；采用FLEXCELL压力加载仪器进行持续静压力加载，模拟施加正畸力过程中持续静压作用，压力加载装置稳定、可重复，均一性高且易于操作；此外，牙周膜干细胞的分泌产物直接作用于破骨前体细胞，直接对破骨分化相关标记物进行鉴定，作用效果直观、明显。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计研究压力加载下三维培养的牙周膜干细胞经旁分泌途径对RAW264.7破骨向分化的影响。采用单因素方差分析进行统计。
1.2 时间及地点实验于2021年11月至2022年6月在河北省口腔医学重点实验室完成。
1.3 材料 RAW264.7细胞(SCSP-5036中科院上海细胞库)；Flexcell压应力培养箱及压力加载装置(FLEXCELL，美国)；胎牛血清(Gibco)；α-MEM、DMEM(Gibco)；流式抗体(Biolegend)；活死细胞染色试剂盒(Solarbio)；鬼笔环肽染色试剂盒(碧云天)；PrimeScript RT、TB Green(TAKARA，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 人牙周膜干细胞的分离培养鉴定及RAW264.7细胞的培养
(1)所有实验程序均经河北医科大学口腔医院医学伦理委员会批准，经患者及监护人知情同意，从12-16岁正畸拔牙患者健康前磨牙获取牙周膜组织，组织块法分离牙周膜干细胞。牙齿离体后保存在含2%双抗的α-MEM中，置于4 ℃冰箱内，并于2 h内操作，在超净工作台中，使用拔牙钳夹持牙冠，根尖部位朝上，用含有2%的PBS冲洗，直至牙根表面无血块及污物，使用11号无菌手术刀片刮取牙根中部1/3的牙周膜组织，将组织块处理为约1 mm大小，放置于培养瓶底，培养瓶中加入5 mL α-MEM培养基，竖直放置在培养箱中，待组织块贴壁后轻轻翻瓶。5 d后可观察到组织块周围有长梭形的牙周膜干细胞爬出，定期换液，待细胞融合度达到80%-90%后按照1∶3比例进行传代，后续实验使用第3，4代细胞。
(2)流式细胞术鉴定人牙周膜干细胞表面标记物：收集第3代人牙周膜干细胞，PBS洗涤，重悬，细胞浓度为6×108 L-1，参照流式抗体说明书，向3个EP管中分别加入不同荧光标记的不同抗体，吹打均匀避光冰上孵育30 min，孵育结束后PBS洗涤，重悬，转移至流式管中，采用流式细胞仪检测细胞表面标记物的表达水平。
(3)克隆形成测定人牙周膜干细胞的增殖能力：第2，3代人牙周膜干细胞以500-1 000个/大培养皿密度进行接种，加入细胞培养基(体积分数为20%胎牛血清+α-MEM)，培养10 d后光镜下观察及结晶紫染色。
1.4.2 人牙周膜干细胞三维培养支架的制备及观察
(1)使用Ⅰ型胶原作为主要支架成分，将Ⅰ型胶原(酸溶解)、0.1%NaOH溶液、10×PBS与1×109 L-1牙周膜干细胞悬液按照一定比例在4 ℃冰水混合物中混匀，加入FLEXCELL压力培养板的支架环中，在超净工作台上室温静置30 min，待支架凝固后，培养支架高度为1 mm，分为2组，分别加入普通培养基(α-MEM+体积分数为10%胎牛血清)及无血清培养基(α-MEM)进行培养。
(2)三维培养下人牙周膜干细胞的形态观察：对普通培养基及无血清培养基中三维培养下的人牙周膜干细胞在刚接种和2，12，48 h 4个时间点进行光镜下观察，观察细胞状态。

1.4.3 FLEXCELL压力培养箱对人牙周膜干细胞进行压力加载

(1)制备三维培养支架，将压力基台放在孔上，加入无血清培养基，细胞种板孵育24 h后进行压力加载，基台旋钮按照样本高度进行调节，将4块细胞培养板放置于黑色培养架上，培养架下放置一块玻璃板保证加压稳定性，随后将培养基台整体连接至压力加载系统中。顺序打开压力泵、压力传导仪，Flexcell 5000V 1.0软件设置加载压力值，根据样品直径进行压力值转化计算，计算公式为Fibs(磅)=0.177×a(MPa)× D(mm)2 (其中a为加载力值，D为样本直径)。将压力加载实验分为12组，加载类型见表1。另设置不加压组。

(2)对最大强度压力加载实验组及不加压对照组进行体式显微镜观察样本支架状态，并进行F-actin细胞骨架染色及活死细胞染色，倒置荧光显微镜观察三维培养的牙周膜干细胞。
1.4.4 条件培养基的获取压力加载结束后收集人牙周膜干细胞培养上清，3 000 r/min离心10 min，去除沉淀，置于-80 ℃冰箱保存，用作条件培养基作用于RAW264.7细胞。
1.4.5 条件培养基作用于RAW264.7细胞将第5-7代RAW264.7细胞分别以10 000/孔的密度接种于24孔培养板和以60 000/孔的密度接种于6孔培养板，各组人牙周膜干细胞上清用0.22 μm的滤膜过滤后，按照9∶1的比例每孔加入普通培养基和各组细胞上清[16]；组13设置为不加压细胞上清干预组，组14阳性对照组设置为核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL)(30 ng/mL)+巨噬细胞集落刺激因子(20 ng/mL)诱导组；组15空白组设置为不添加条件培养基组。
1.4.6 RAW264.7细胞破骨向分化的鉴定
(1)抗酒石酸酸性磷酸酶染色：24孔板培养，条件培养基作用RAW264.7细胞5 d，按照说明书进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，体视显微镜及光镜下观察并拍照。使用Image J.Pro软件计算抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性区域(即红染区域)占比范围。

(2) qPCR检测破骨相关基因表达：6孔板培养，条件培养基作用RAW264.7细胞5 d，按照说明书提取RNA，检测RNA浓度及纯度。根据反转录试剂盒说明书进行反转录，随后进行 real-time PCR实验。每个反应使用同一cDNA样品进行3次重复，对3个样本来源的样品进行实验，计算目标基因相对于内参基因GAPDH表达量。引物设计见表2。

1.5 主要观察指标 ①三维培养条件下人牙周膜干细胞加压及不加压的形态变化以及细胞骨架染色、活死细胞染色状态；②Image J计算各组RAW264.7细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性区域占比范围大小；③各组RAW264.7细胞中破骨分化相关基因表达水平。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行数据分析，所有数据进行正态检验，采用单因素方差分析进行多重比较。文章统计学方法已经河北医科大学药学院医学统计学专家审核。

讨论

破骨细胞起源于骨髓的单核造血干细胞，是一种具有骨吸收功能的多核巨细胞，在骨代谢方面起着关键作用。破骨细胞活化是骨吸收启动的前提，破骨细胞活化是指破骨细胞由静息状态向激活状态转变的过程，该过程是一个复杂而又精细的多级调控过程，涉及许多信号通路及细胞因子，其中RANKL-RANK-OPG系统及其相关信号通路、巨噬细胞集落刺激因子相关信号通路以及炎症因子等在破骨细胞分化中起着重要作用。RAW264.7细胞为小鼠单核巨噬细胞，RAW264.7细胞是用Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠发生肿瘤后，收集小鼠腹水单核样巨噬细胞得到的细胞株[17]，是目前公认的成系的破骨细胞前体细胞[18]。
正畸牙移动过程中力加载于正畸牙，最终牙周组织重建，牙齿发生移动。牙移动的关键在于牙周组织(包括牙周膜及牙槽骨)重塑，牙周膜位于牙与牙槽骨之间，在介导力学传递方面起着重要作用[19]。牙周膜干细胞作为牙周膜中的重要细胞成分，不仅维持正常情况下牙周膜内环境的稳定性，也在牙周组织的自我更新和牙周炎疾病修复再生中起着重要的调控作用[20]。实验证实牙周膜干细胞参与传递压应力信号转导，促进破骨前体细胞破骨向分化。这种促进作用的强弱与压力加载强度相关，在一定压力加载强度范围内，牙周膜干细胞促进RAW264.7破骨向分化的作用与力值大小呈现正相关；然而过大压力强度下，这种促进作用减弱。具体机制仍需进一步探究，可能与过大强度压力作用下牙周膜干细胞的凋亡等活动相关。
该研究证实三维培养的牙周膜干细胞在压力加载条件下可通过旁分泌作用促进RAW264.7细胞的破骨向分化。众多研究指出破骨细胞的活化及分化需要成骨谱系细胞协调[19]，牙周膜干细胞即具有成骨向分化潜能的细胞，该研究对该猜想进行了验证。影响破骨前体细胞破骨向分化的因素众多，其中包括经典及非经典通路两部分，前者是指RANKL-RANK-OPG轴[21]，是破骨前体细胞在集落刺激因子作用下，成骨谱系的细胞如成骨细胞及成纤维细胞分泌RANKL与破骨前体细胞表面的RANK受体结合，激活破骨前体细胞内的相关信号通路使其发生破骨向分化。非经典通路则是指出以肿瘤坏死因子α为主的一部分炎症因子的作用能够刺激破骨前体细胞发生破骨向分化。因此压力作用下牙周膜干细胞促RAW264.7细胞破骨向分化的机制需进一步探究。
模拟正畸牙移动体外加力的研究众多，压力加载模型的构建是体外研究正畸牙移动机制的必要条件。近年来细胞三维培养研究广泛，应用于牙周膜细胞的三维培养方式包括细胞球团、羟基磷灰石、壳聚糖水凝胶、GelMA水凝胶及多聚乳酸支架等[22-23]。选择细胞三维培养方式时，应当依据研究目的决定，首先必须保证生物安全相容性，其次可根据研究目的，如组织工程应用等，确定支架材料的稳定性等。实验旨在建立压力加载模型，因此需保证压力加载条件下支架中牙周膜细胞的稳定性。此外采用Ⅰ型胶原作为主要成分，与牙周膜组织的主要胶原成分一致[24]，牙周膜干细胞在此支架环境中生长稳定，呈多向扩展生长；压力加载条件下，支架形态稳定，牙周膜干细胞状态稳定，三维培养条件下细胞基因表达及分泌更加接近体内状态，能够更加真实地模拟压缩应力作用下牙周膜干细胞的生理反应。
模拟正畸体外压力加载实验中，加压装置有选用玻璃板、磁珠重力加压、自主研发的液压装置或四点弯曲细胞力学加载仪[25]；以上压力加载装置存在部分缺点，如重力加压装置加压不均匀。该实验采用Flexcell压力培养箱进行压力加载，压力加载稳定，压力值加载准确。二维培养条件下多采用2-4 g/cm2压力值[26]，有研究采用多聚乳酸支架压力加载时选择25 g/cm2的力值[27]，该实验根据力学单位转换，参考25 g/cm2的压力值，同时结合样品厚度选取4个力值，进行压力加载力值的探索，结果显示随着压力力值的改变，牙周膜干细胞对破骨细胞分化的促进作用呈现一定趋势性变化，且压力力值中45 kPa，12 h条件下牙周膜干细胞条件培养基促破骨作用最强。
以往研究证明在不同类型压力加载条件下，牙周膜细胞的反应不同，其成骨分化潜能及对破骨细胞的调控作用也不尽相同[28-29]，这说明在牙周组织重建中力学信号的转导非常复杂，值得进一步探索其相互的交联作用。
综上所述，三维培养的牙周膜干细胞在压力加载条件下促进RAW264.7细胞的破骨向分化，促进作用的强弱与压力加载强度相关。该实验构建了三维培养条件下压力加载模型，同时探索出促破骨分化的最适力值，有利于正畸牙移动的机制研究；同时为加速正畸牙移动，以及组织工程技术中对破骨细胞的活动调控提供一定的研究基础。然而课题组仍需进一步检测条件培养基中其他成分如炎症因子及胞外囊泡等的分泌情况，来进一步确定该促进作用的机制。

静压力作用下三维培养人牙周膜干细胞促进RAW264.7细胞的破骨向分化

Three-dimensional cultured periodontal ligament stem cells promote osteoclastic differentiation of RAW264.7 under static compression

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