2.1   原代人牙周膜干细胞的形态   组织块贴壁培养5-7 d后于倒置相差显微镜下观察，有原代细胞从组织块边缘爬出并以组织块为中心呈放射状生长，位于中心位置的细胞排列紧密，远离中心位置的细胞排列疏松，细胞的生长排列呈漩涡状或放射状。爬出的细胞在形态上大部分呈长梭形或不规则长三角形，胞体丰满，胞质均匀，细胞核圆形或椭圆形并位于细胞中央，内含一两个核仁，见图1A。消化传代后3 h细胞贴壁，细胞增殖速度较快，第1代细胞见图1B。



2.2   人牙周膜干细胞的鉴定   
2.2.1   流式细胞仪对人牙周膜干细胞表面标志物的鉴定结果   人牙周膜干细胞表面标志物CD73、CD90、CD105呈阳性表达，阳性率分别为(96.43±1.82)%，(95.88±1.94)%，(84.72±1.79)%，而表面抗原CD45呈阴性表达，阳性率仅为(2.57±0.12)%，见图2。




2.2.2   免疫荧光染色结果   CD90、Vimentin标记的细胞胞浆为红色；CD73、S100A4标记的细胞胞浆染为绿色，表达绿色荧光的胞浆与CD90、Vimentin标记为红色的胞浆呈现出同样的细胞形态，均为典型的长梭形样；而CK染色时细胞胞浆不着色，见图3。



2.2.3   免疫细胞化学染色结果   CD90、Vimentin、CD73、S100A4将细胞胞浆染成棕黄色，细胞核染成蓝色，而CK呈阴性表达，见图4。



2.3   CCK-8绘制人牙周膜干细胞生长曲线    人牙周膜干细胞的生长曲线与一般细胞相似，呈“S”形，包括潜伏期、快速生长期和平台期，见图5。选取第1-6代人牙周膜干细胞进行CCK-8实验，结果显示，第1，2天为细胞生长的潜伏期，从第2，3天起细胞迅速增殖，进入对数生长期，第1-4代人牙周膜干细胞在第3天时增殖达到顶峰，而第5-6代人牙周膜干细胞在第4天时达到顶峰，这期间为细胞快速生长期。到第6天时细胞增殖缓慢，此时细胞进入平台期。CCK-8实验结果显示第2代、第3代人牙周膜干细胞的对数生长期比其余代次增殖水平显著升高(P < 0.05)。



2.4   CCK-8绘制PDGF-BB作用下的人牙周膜干细胞生长曲线   同一时间点上，0，50，100，200 μg/L的PDGF-BB组间相比较，100 μg/L PDGF-BB组的人牙周膜干细胞增殖明显优于0，50，200 μg/L PDGF-BB组，且差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。



2.5   矿化实验结果   第3代人牙周膜干细胞培养3 d后，在显微镜下观察细胞形态类似于成纤维细胞，大多呈梭形，有些呈多角形，形状不规则，其排列具有明显的方向性；加入成骨诱导液成骨诱导7 d后，成骨诱导液+ PDGF-BB组和成骨诱导液组细胞逐渐变为方形，出现灰白色钙化小结节、钙盐沉积和矿化结节，成骨诱导液+PDGF-BB组的钙结节与成骨诱导液组无明显差异，空白对照组无钙化结节形成；成骨诱导14 d时，成骨诱导液+PDGF-BB组镜下钙化结节多为板层状的圆形或椭圆形团块且多于成骨诱导液组，空白对照组无钙化结节形成；成骨诱导21 d，成骨诱导液组和成骨诱导液+ PDGF-BB镜下观察均可见大量钙化结节，但各组与14 d相比无明显差异，空白对照组无钙化结节形成，见图7。



2.6   Runx2、骨形态发生蛋白2的mRNA相对表达水平   成骨诱导14 d，分别提取空白对照组、成骨诱导液组、成骨诱导液+PDGF-BB组人牙周膜干细胞的RNA进行Real-time PCR实验，结果显示，Runx2、骨形态发生蛋白2的mRNA相对表达水平组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图8。




2.7   Runx2、骨形态发生蛋白2蛋白相对表达水平   成骨诱导14 d，Western blot检测结果显示：成骨诱导液+PDGF-BB组和成骨诱导液组均有Runx2、骨形态发生蛋白2蛋白的表达，成骨诱导液+PDGF-BB组Runx2、骨形态发生蛋白2的相对表达量与成骨诱导液组和空白对照组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图9。

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人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells，HPDLSCs)是牙周组织发育完成后存留于牙周膜中未分化的一类干细胞，由于人牙周膜干细胞来源丰富、取材方便，具有多向分化潜能，因而被认为是骨组织再生修复的一种理想种子细胞。人牙周膜干细胞具有促进骨折愈合、骨软骨再生及颅骨缺损修复的作用[1-3]。有研究将人牙周膜干细胞接种于纳米羟基磷灰石/壳聚糖/明胶支架上[4]，通过体内实验证明了人牙周膜干细胞可作为种子细胞联合纳米羟基磷灰石/壳聚糖/明胶支架能够促进颌骨缺损的再生修复。血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)是由2条多肽链构成的同型或异型二聚体，在骨缺损自然修复早期，PDGF释放增加[5-7]，吸引干细胞迁移至血肿外并诱导其增殖，促使成骨细胞分化，加速Ⅰ型胶原蛋白合成，从而促进骨修复。PDGF-BB是PDGF家族成员之一，是一类能够通过刺激结缔组织等组织细胞增长的肽类调节因子[8-10]。PDGF-BB的高表达可诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化，促进骨组织再生[7，11]，PDGF-BB还能够促进间充质干细胞的增殖、迁移和向内皮细胞分化，通过增加血管生成和成骨来促进坏死颌骨的愈合[12-13]，也可以通过促进血管内皮生长因子的表达调节血管内皮细胞，进而影响血管生成来诱导骨再生[14-15]。理想的骨组织再生修复需要通过种子细胞、细胞因子以及生物材料的协同整合来完成[16]，因此，基于PDGF-BB促进成骨以及人牙周膜干细胞的优势，该研究利用PDGF-BB对人牙周膜干细胞进行体外成骨定向诱导，并进行成骨分化的鉴定，探究PDGF-BB促进人牙周膜干细胞成骨分化的最佳质量浓度，为人牙周膜干细胞成骨向分化的功能特性研究奠定基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   人牙周膜干细胞在不同质量浓度PDGF-BB作用下的增殖能力测定，筛选PDGF-BB最佳质量浓度，联合成骨诱导液进行成骨诱导分化，体外观察人牙周膜干细胞在PDGF-BB作用下的成骨分化能力，基因水平探究其成骨分化特征，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年2月至2021年12月在西南医科大学口颌面修复重建和再生泸州市重点实验室完成。
1.3   材料   荧光倒置显微镜(Olympus)；酶标仪(Bio-rad)；CO2细胞培养箱(Thermo)；超低温冰箱、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、96孔培养板(Gibco)；DMEM(Gibco)；胎牛血清(Hyclone)；CCK-8试剂盒(碧云天生物技术研究所)；血小板衍生生长因子BB、成骨诱导液(Peprotech)；DAB显色试剂盒、鼠抗人Vimentin单克隆抗体、鼠抗人CK单克隆抗体、引物(Sangon)；CD73、CD90、S100A4抗体(Biolegend)；RT-PCR 试剂盒(碧云天生物技术研究所)；Western blot试剂盒(碧云天生物技术研究所)。
1.4   实验方法   
1.4.1   人牙周膜干细胞的分离、培养   收集12-16岁患者因正畸而拔除的前磨牙，监护人知情同意并签署同意书，该研究的实施符合西南医科大学附属口腔医院的相关伦理要求(人体标本伦理编号：20190828001)。采用组织块与酶消化相结合的方法，刮取牙根中1/3部位的牙周膜组织进行原代培养，3 d后首次换液，以后每两三天更换新鲜的含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液，待贴壁细胞接近70%-80%融合后消化传代备用，培养后每天用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。 

1.4.2   人牙周膜干细胞的鉴定

(1)流式细胞技术检测人牙周膜干细胞表面标志物：取处于对数生长期的第2代人牙周膜干细胞，胰酶消化法收集细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×109 L-1，将100 μL细胞悬液分装至1.5 mL EP管中，冰浴环境下向每个EP管中加入2 μL(1∶500)人CD73，CD90，CD105，CD45抗体，对照组加入Alexa Fluor标记的小鼠IgG，所有抗体4 ℃避光孵育，60 min后用含体积分数为2%胎牛血清的PBS清洗3次，加入羊抗小鼠二抗，避光条件下继续孵育60 min，流式细胞仪检测细胞表面标记分子的表达。

(2)免疫荧光染色：取处于对数生长期的第2代人牙周膜干细胞，胰酶消化法收集细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为2×105 L-1，接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞密度达70%-80%时，取出盖玻片，PBS漂洗3次，每次5 min；4 ℃ 条件下，丙酮固定细胞24 h，采用免疫细胞荧光染色法进行CD90、Vimentin、CD73、S100A4、CK染色，激光扫描共聚焦显微镜下观察并采集图像。

(3)免疫细胞化学染色：取处于对数生长期的第2代人牙周膜干细胞，胰酶消化法收集细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度为2×105 L-1，接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞密度达70%-80%时，取出盖玻片，PBS漂洗3次，每次5 min；4 ℃条件下，丙酮固定细胞24 h，采用免疫细胞化学染色法进行CD90、Vimentin、CD73、S100A4、CK染色，正置显微镜下观察并采集图像。
1.4.3   CCK-8法绘制人牙周膜干细胞生长曲线   取对数生长期的第1-6代人牙周膜干细胞，以每孔8×103个/孔的密度接种于96孔板中，培养3-5 d，每孔加入CCK-8溶液(5 g/L，用PBS配制，pH=7.4)20 μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解；选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值，记录结果，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.4.4   CCK-8法绘制PDGF-BB作用下的人牙周膜干细胞增殖曲线   取对数生长期的第3代人牙周膜干细胞，以每孔8×103个/孔的密度接种于96孔板，培养24 h，按照实验分组每孔加入含0，50，100，200 μg/L PDGF-BB的DMEM完全培养基，继续培养7 d，在第1，3，5，7天时，每孔加入10 μL CCK-8溶液，酶标仪检测490 nm处吸光度值，然后根据吸光度值绘制人牙周膜干细胞的增殖曲线。
1.4.5   人牙周膜干细胞的成骨诱导及矿化实验   取对数生长期的第3代人牙周膜干细胞，以每孔2×105个/孔的密度接种于6孔板中，培养24 h，按照空白对照组、成骨诱导液组、成骨诱导液+PDGF-BB组分别加入普通DMEM培养基、单纯成骨诱导液、成骨诱导液+100 μg/L PDGF-BB培养，分别在第7，14，21天时于倒置显微镜下采集图像并分析。
1.4.6   Real-time PCR检测Runx2、骨形态发生蛋白2的mRNA表达水平   取对数生长期的第3代人牙周膜干细胞，以每孔2×105个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞融合达70%-80%时，在空白对照组、成骨诱导液组、成骨诱导液+PDGF-BB组分别加入普通培养基、成骨诱导液、成骨诱导液+100 μg/L PDGF-BB培养，每组2个复孔，培养14 d，分别提取3组细胞的总RNA，采用分光光度计对各组中的RNA进行检测，然后按照cDNA试剂盒操作步骤对各组提取的RNA进行反转录，根据RT-PCR 试剂盒说明，按照预变性95 ℃ 60 s，变性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 60 s的程序(40个循环)检测各组细胞Runx2、骨形态发生蛋白2的mRNA相对表达水平，每个样品重复3次检测，并进行组间比较。Runx2、骨形态发生蛋白2的引物序列见表1。

1.4.7   Western blot检测Runx2、骨形态发生蛋白2的蛋白表达水平   取对数生长期的第3代人牙周膜干细胞以每孔2×105个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞融合达70%-80%时，空白对照组、成骨诱导液组、成骨诱导液+PDGF-BB组分别加入普通培养基、成骨诱导液、成骨诱导液+100 μg/L PDGF-BB培养，每组2个复孔，培养14 d，分别提取3组细胞总蛋白，BCA法对各组细胞蛋白定量检测，10%的SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、封闭，以GAPDH为内参，检测各组细胞Runx2、骨形态发生蛋白2蛋白的相对表达水平。
1.5   主要观察指标   ①人牙周膜干细胞的形态、表面标志物表达水平；②第1-6代人牙周膜干细胞的增殖水平；③不同质量浓度PDGF-BB刺激下人牙周膜干细胞的增殖能力，筛选PDGF-BB最佳质量浓度；④成骨诱导液及成骨诱导液联合PDGF-BB作用下人牙周膜干细胞的骨向分化能力，RT-qPCR、Western blot测定成骨相关基因、蛋白表达水平。
1.6   统计学分析   采用SPSS 26.0统计软件对数据进行方差分析。计量资料以x±s表示，多组之间检测结果采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。检验水准α=0.05。文章统计学方法已经通过西南医科大学附属口腔医院生物统计学专家审核。

人牙周膜干细胞作为干细胞的一种，在一定条件下具有分化为骨组织、脂肪组织、软骨组织和神经组织的潜能[17-20]，2004年，SEO等[21]学者首次成功地分离培养出人牙周膜干细胞，并认为是最有潜力的修复牙周缺损的种子细胞。牙周膜干细胞衍生的外泌体具有一定的修复能力，能够促进血管生成、调节成骨细胞、缓解炎症微环境[22-24]，促进颅骨缺损的骨再生和大鼠间充质干细胞成骨分化[25]。骨组织再生过程中的天然微环境涉及多种生长因子的整合，PDGF-BB的成骨作用及诱导骨祖细胞骨向分化的能力已被证实[26-27]，并广泛用于骨组织工程成骨效应和能力的研究。因此，基于PDGF-BB在一定条件下的诱导成骨效应，以及人牙周膜干细胞的多向分化潜能和前期学者对人牙周膜干细胞成骨分化能力的研究，该实验通过筛选PDGF-BB的最佳质量浓度，探讨PDGF-BB对人牙周膜干细胞增殖以及成骨效应的影响。目前尚无鉴定人牙周膜干细胞的特异性表面分子标记物，但有研究表示人牙周膜干细胞与骨髓间充质干细胞具有相似的表面分子标记物[28]，能够表达高水平的细胞黏附分子CD73、CD90、CD105，几乎不表达造血干细胞表面标志物CD45。CCK-8结果显示第2，3代人牙周膜干细胞增殖能力最好，PDGF-BB质量浓度在100 μg/L时人牙周膜干细胞的增殖能力达到最好，这与李殿奇[29]的研究结果相一致，因此该研究选取第2，3代人牙周膜干细胞为研究对象，采用100 μg/L PDGF-BB对其进行刺激，探索人牙周膜干细胞的成骨分化能力。

钙化结节是人牙周膜干细胞发生矿化时形成的，是细胞成骨分化逐渐成熟的标志，通过检测人牙周膜干细胞形成钙结节的数量可以分析人牙周膜干细胞成骨分化的程度[30]。该研究对人牙周膜干细胞分别用成骨诱导液和成骨诱导液+PDGF-BB进行诱导，在诱导第7，14，21天时观察各组矿化情况，对各组间不同时间点的矿化结果进行组间比较，发现成骨诱导液+PDGF-BB组在第7-14天表现出明显的促人牙周膜干细胞成骨分化能力，且促成骨效果明显优于成骨诱导液组，但在诱导21 d时成骨诱导效果基本与14 d时无明显差异，可能是在长达21 d的成骨诱导下，细胞大部分凋亡或死亡，无法继续进行骨向分化，从而钙化结节较14 d时无明显变化。相比成骨诱导液的促成骨分化能力，PDGF-BB表现出了明显的优势，同时也说明PDGF-BB对于人牙周膜干细胞的成骨分化作用是分阶段进行的，而Runx2、骨形态发生蛋白2的表达变化也同样证实了这一点。Runx2、骨形态发生蛋白2是成骨分化早期的重要标志性蛋白[5]，Runx2对于成骨细胞的分化至关重要，是成骨细胞增殖所必需的[31]。该实验发现成骨诱导14 d时成骨诱导液+PDGF-BB组的Runx2、骨形态发生蛋白2的mRNA相对表达水平和蛋白相对表达量均明显高于成骨诱导液组。以上结果一致说明PDGF-BB能够增强人牙周膜干细胞的成骨效应，PDGF-BB与成骨诱导液联合使用，具有明显的促成骨能力。

成骨微环境受多种因素影响，PDGF-BB在人牙周膜干细胞的成骨分化中起着动态调控作用。该研究结果表明单独应用成骨诱导液在一定程度上能促进人牙周膜干细胞的成骨分化，但对人牙周膜干细胞的增殖没有显著影响，成骨诱导液联合PDGF-BB可明显促进人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化，该研究用100 μg/L PDGF-BB对人牙周膜干细胞诱导14 d时，人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化效应最为显著，有助于研究者后续探索人牙周膜干细胞成骨分化的分子机制，为牙周组织的重建奠定基础。然而，由于体内微环境调控因素复杂多变，PDGF-BB在体内微环境中容易失活而难以调控，因此，如何在体内复杂微环境下维持和延长PDGF-BB的生物活性是其参与体内骨组织再生修复重建的关键因素，该问题的探索有望为骨组织再生修复重建机制的深入研究提供新视角，也是后续体内验证PDGF-BB促进人牙周膜干细胞成骨分化亟待解决的关键问题。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
血小板衍生生长因子BB：是血小板衍生生长因子的一种，具有良好的促细胞增殖作用，能够促进细胞的迁移、分化。在特定条件下，血小板衍生生长因子BB能够促进人牙周膜干细胞骨向分化，进而促进牙槽骨的再生重建，与成骨诱导液联合使用对人牙周膜干细胞的促成骨效应更显著。
人牙周膜干细胞：来源于人牙周支持组织，是一类具有自我更新和分化潜能的未分化间充质干细胞，也是牙周组织再生工程的关键种子细胞之一。人牙周膜干细胞能够促进血管生成和骨组织的缺损修复，在特定条件下对人牙周膜干细胞进行诱导，可使其发生成骨向分化，促进骨组织再生重建。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

促成骨效应及促血管新生作用是血小板衍生生长因子BB应用研究中备受关注的热点，其促成骨效应主要表现在特定条件下能够诱导未分化间充质干细胞定向迁移、分化，达到对局部缺损骨的再生重建，然而，不同来源的干细胞在血小板衍生生长因子BB作用下具有不同的成骨效应。血小板衍生生长因子BB在骨再生方面的研究主要体现在对骨髓间充质干细胞的作用，在牙周膜干细胞的成骨向分化研究中相对较少。在一定条件下，人牙周膜干细胞对牙周支持组织具有强大的重建功能，因此，该研究以人牙周膜干细胞为研究对象，探究在血小板衍生生长因子BB作用下的成骨效应及其成骨分化特征，为人牙周膜干细胞作为组织工程干细胞骨向分化功能特性的研究奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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