各组细胞经过48 h潜伏后进入对数生长期，48 h时，CPC/PLGA组细胞数比对照组多，差异有显著性意义(P < 0.05)；72 h时，CPC/PLGA组的细胞数明显高于对照组及羟基乙酸组，差异有显著性意义(P < 0.05)；72 h后，细胞增长速率减慢；在96 h时，细胞数量达到顶峰；120 h时，各组细胞数量下降，CPC/PLGA组较其他两组显著降低(P < 0.001)。
2.2   RT-PCR检测结果   CPC/PLGA组NFATc1、核因子κB受体活化因子、抗酒石酸酸性磷酸酶 mRNA的表达水平较对照组和羟基乙酸组升高，差异有显著性意义(P < 0.01)；羟基乙酸组和对照组的NFATc1、核因子κB受体活化因子、抗酒石酸酸性磷酸酶的mRNA表达无差异；羟基乙酸组、CPC/PLGA组的金属基质蛋白酶9 mRNA表达水平显著高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.001)，见图2。



2.3   Western Blot检测结果    CPC/PLGA组的核因子κB受体活化因子、NFATc1 蛋白表达水平显著高于对照组和羟基乙酸组，差异有显著性意义(P < 0.05)；羟基乙酸组和对照组的核因子κB受体活化因子、NFATc1 的蛋白表达水平无差异；羟基乙酸组、CPC/PLGA组的金属基质蛋白酶9蛋白表达水平显著高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图3。



2.4   破骨细胞诱导及结果鉴定   见图4。

镜下见未分化RAW264.7细胞多数呈圆形，含1个细胞核，抗酒石酸酸性磷酸酶染色阴性；破骨样细胞呈椭圆形或不规则形，体积较大，含有3个及以上的细胞核，抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性(10×10 倍镜下)，红色箭头所指为破骨样细胞。镜下观察可见6孔板中生成的破骨样细胞数量，CPC/PLGA组中破骨细胞数量(7.67±1.53)高于羟基乙酸组(4.33±1.53)和对照组(3.33±0.58)，差异有显著性意义(P < 0.05)。

骨组织缺损是临床常见疾病之一，主要由创伤、感染、肿瘤及骨组织相关疾病等因素导致，其修复过程漫长且复杂[1-3]。骨重建生物材料包括自体骨、同种异体骨、人工材料和组织工程骨[4]。自体骨移植由于自身具有骨诱导性、骨传导性、成骨性和非免疫原性等特点，被认为是骨替代的金标准，但存在取材有限等缺点[5]。同种异体移植和异种移植作为自体移植的替代物，存在免疫学和病毒污染传播风险等问题，因此人工骨成为研究热点[6-7]。

磷酸钙复合材料最接近自体骨的矿物性质和结构，因其具有良好的生物相容性、流动性、可塑性和骨传导性[6]，被认为是最佳的骨修复材料[8]，在骨科和牙科具有广阔的应用前景，但其存在降解速率慢、骨转换率低等缺点[9]，在骨缺损修复中会导致降解速率与成骨性能适配性不佳。聚乳酸羟基乙酸[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]共聚物是由乳酸和乙醇酸聚合而成的高分子聚合物，具有可降解性、良好的生物相容性等优点[10-12]。磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)/PLGA化合物由于加入PLGA微球，可加速CPC材料的生物降解和新骨形成速率，材料的降解程度和新骨形成量明显优于其他化合物[2, 13-14]，但其具体机制仍不清楚。

磷酸钙材料的植入会引发机体的免疫、炎症、破骨细胞反应等。单核细胞是最早产生免疫效应的细胞之一，极易受微环境的影响，在不同的刺激下可极化为M1促炎型或M2组织修复前亚型的细胞[15]。破骨细胞主要来源于单核/巨噬细胞的融合分化，在核因子κB受体活化因子配体/巨噬细胞集落刺激因子的作用下分化为破骨细胞[16]。核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体是常见的骨吸收调节途径，其可募集肿瘤坏死因子受体相关因子蛋白6，激活下游的活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1)，诱导破骨细胞的分化[17]。破骨细胞和巨噬细胞通过吞噬、吸收和清除作用，介导材料的吸收和降解，破骨细胞附着于磷酸钙材料表面，会形成吸收陷窝，在褶皱边缘的酸性微环境中，破骨细胞的吸收能力更明显[18]。磷酸钙材料降解细胞的表面超微结构结果证明，破骨细胞对材料具有吞噬作用[19]，因此增加破骨细胞的数量或促进破骨细胞的分化可能是提高新骨形成的有效手段。作者所在课题组前期研究工作发现CPC/PLGA降解液可以促进RAW264.7细胞中核因子κB受体活化因子表达的上调[20]，乳酸通过活化 T 细胞核因子 c1 位点促进RAW264.7 细胞破骨向分化[21]。有理由怀疑骨组织工程材料的降解产物会导致局部微环境的变化，从而诱导单核细胞的活化和分化，促进破骨细胞形成。此次实验根据作者所在课题组既往研究及结合文献资料[20-21]，配置钙磷离子比例，同时使用羟基乙酸和乳酸混合，配置成一定比例的CPC/PLGA复合材料，改变降解产物形成的微环境，观察其对单核细胞破骨向分化的影响，为提高材料降解速度和促进新骨形成提供一定的理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   细胞体外对照实验，数据符合正态和方差齐性检验，用单因素方差分析进行组间比较；不符合正态和方差齐性检验，则用非参数检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年4月至2021年4月在广西医科大学口腔颌面修复与重建研究重点实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验用试剂   小鼠巨噬细胞株 RAW264.7(ATCC公司，美国)，胎牛血清(Gibco，澳洲)，乳酸(Sigma-Aldrich，美国)，羟基乙酸 (Sigma-Aldrich，美国)，Na2HPO4/NaH2PO4(Sigma-Aldrich，美国)，氯化钙(CaCl2·2H2O，Sigma-Aldrich，美国)，SDS-PAGE彩色凝胶制备试剂盒(BBI，中国)，反转录试剂盒 (TaKaRa，日本)，核因子κB受体活化因子配体(R&D system，美国)，DMEM 高糖培养基(Gibco，美国)，RIPA 裂解液(强)(碧云天，中国)。
1.3.2   仪器   CO2细胞培养箱(Tliermo Scientific，美国)，倒置像差显微镜(Olympus，日本)，PCR仪(Applied Biosystems，美国)，iMark自动酶标仪(BIio-Rad，美国)，电泳仪(Bio-Rad，美国)，ChemiDoc MP全能型成像系统(Bio-Rad，美国)，NanoDrop分光度计(Thermo Fisher Scientific，德国)，台式离心机(Thermo SCIENTIFIC，美国)。
1.4   方法   
1.4.1   实验准备

实验分组：根据培养基的不同进行分组，分为3组：①空白对照组；②羟基乙酸组；③CPC/PLGA 组。

配液：①0.6 mmol/L钙离子溶液；②Na2HPO4、NaH2PO4按4∶1比例混合配制成1.8 mmol/L 磷酸根离子溶液；③0.2 mg/L乳酸溶液；④7.4 mg/L 羟基乙酸溶液。

按照实验分组，将配制好的溶液和50 μg/L核因子κB受体活化因子配体添加到完全培养基(DMEM 培养液：胎牛血清=9∶1)中制备成不同条件的培养基，见表1。培养小鼠RAW264.7细胞5 d，诱导其分化。

1.4.2   CCK-8检测降解液对细胞增殖的影响   取对数生长期的细胞消化，按2×103个/孔的密度接种于96孔板，每组3个复孔，细胞贴壁后，去除培养液，每孔加入100 μL新鲜培养基，37 ℃，体积分数5%CO2条件培养，隔日换液。设置5个检测时间点，每次间隔24 h，加入CCK-8试剂，37 ℃避光孵育2 h，使用酶标仪450 nm波长检测吸光度(A)值，重复3次，绘制细胞增殖曲线。
1.4.3   RT-PCR检测破骨分化相关因子mRNA的表达   将5×104个/孔的细胞接种至6孔板中共培养 5 d。按照TaKaRa试剂盒说明提取总RNA，紫外分光光度计检测样品浓度，反转录生成cDNA，以β-actin为内参，采用RT-PCR检测NFATc1、金属基质蛋白酶9、核因子κB受体活化因子、抗酒石酸酸性磷酸酶mRNA的相对表达水平，重复3次；以 2-ΔΔCt理论为基础，对目的基因的相对表达量进行计算和统计分析。相关PCR引物序列见表2。

1.4.4   Western Blot检测 NFATc1、核因子κB受体活化因子和金属基质蛋白酶9 蛋白的表达   细胞共培养5 d，去除旧培养基，PBS 漂洗两三次后，加入裂解液(含蛋白酶抑制剂 cocktail)，12 000×g离心 10 min，取上清。BCA法测样品蛋白浓度，蛋白样品和上样缓冲液(5×)按体积 4∶1 的比例进行混合，100 ℃加热10 min，-80 ℃冷藏。使用一步法凝胶制备试剂盒制胶，每孔蛋白上样量为40 μg，80 V恒压电泳30 min，调至120 V继续电泳并随时观察；200 A恒流转膜1.5 h，封闭，4 ℃孵一抗(1∶1 000)过夜，室温孵二抗(1∶10 000)1 h，使用化学发光法检测，Image J 分析NFATc1、核因子κB受体活化因子和金属基质蛋白酶9的蛋白表达，重复3次。
1.4.5   抗酒石酸酸性磷酸酶染色   将3×103个/孔细胞接种于24 孔板培养 5 d后，使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒进行染色。在显微镜下观察，具有3个及3个以上细胞核的多核细胞，认定为破骨样细胞，按照九分法选取观察视野进行计数。
1.5   主要观察指标   ①不同条件的培养基对小鼠RAW264.7细胞增殖能力的影响；②不同条件培养基对小鼠RAW264.7细胞NFATc1、金属基质蛋白酶9、核因子κB受体活化因子及抗酒石酸酸性磷酸酶 mRNA 表达的影响；③不同条件培养基对小鼠RAW264.7细胞 NFATc1、核因子κB受体活化因子、金属基质蛋白酶9蛋白表达的影响；④不同条件培养基对小鼠RAW264.7细胞破骨向诱导的影响。

1.6   统计学分析   运用SPSS 20.0、Excel等软件进行统计分析，用x±s表示结果。数据符合正态和方差齐性检验，用单因素方差分析进行组间比较；不符合正态和方差齐性检验，则用非参数检验。检验水准 α=0.05。

骨重塑是一个由成骨细胞和破骨细胞进行的动态过程，这一个过程受局部微环境中各种激素和细胞因子的密切调控[22]。单核/巨噬细胞系是最早接触骨植入材料的免疫细胞类型之一，在巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体的刺激下可以分化为破骨细胞[15-16]。磷酸钙骨水泥存在降解率低、骨转换率低等缺点限制其修复效果[23]，研究发现加入PLGA可以改善其降解率，PLGA水解时会降解乳酸和乙酸产生孔隙，有利于组织向内生长、血管形成和新骨形成[24-25]；这些酸性单体还会导致局部pH值降低，加速CPC降解，释放出钙离子、磷酸根离子[23, 26]。CPC/PLGA复合材料中PLGA颗粒整体降解较早，因此可以通过改变PLGA的含量来控制磷酸钙骨水泥的降解速率，使其与新骨的再生速率相适应[27]。CPC/PLGA复合材料研究表明，CPC/PLGA复合材料可以为细胞黏附、增殖提供有利的条件，比纯CPC材料具有更好的黏附条件和更强的增殖作用，PLGA颗粒的凸起部分增加了复合材料的有效表面积，有利于细胞黏附和增殖[27]。从细胞增殖实验结果可以看出，72 h 时与羟基乙酸组和对照组相比，CPC/PLGA组可以更显著地促进细胞增殖；120 h时，CPC/PLGA组细胞增殖显著下降，结合抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果可知，CPC/PLGA组破骨细胞数量高于对照组和羟基乙酸组，表明CPC/PLGA 复合材料植入骨组织缺损后，以一定的速度降解释放出羟基乙酸、乳酸和钙离子、磷酸根离子，这些降解产物形成局部特异性的微环境，在早期促进小鼠RAW264.7单核细胞增殖，后期可以促进其向破骨细胞分化。

核因子κB受体活化因子与核因子κB受体活化因子配体结合是调节骨吸收的常见途径[17]。核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体可募集肿瘤坏死因子受体相关因子蛋白，其中肿瘤坏死因子受体相关因子蛋白6是破骨细胞分化的关键蛋白因子，研究发现肿瘤坏死因子受体相关因子蛋白6缺陷小鼠的破骨细胞分化和骨吸收会受到抑制[28-29]。核因子κB受体活化因子配体还可激活下游信号核因子κB、JNK、ERK、p38、Akt和NFATc1的表达，NFATc1在破骨细胞分化中起着至关重要的作用[30]。钙离子可激活钙调神经磷酸酶，使NFATc1中的丝氨酸残基去磷酸化，快速转移进入细胞核从而被激活，调节破骨细胞生成[31]。已有研究表明破骨细胞可通过质膜上的钙离子感受器感知胞外的钙离子浓度[32]，低浓度的钙离子可激活线粒体脱氢酶，影响线粒体对阳离子的摄取，影响基因表达和细胞凋亡[33-34]；高浓度的钙离子会引起胞内钙离子升高，抑制水解酶的释放，影响破骨细胞的功能及降低骨吸收活性[35]。高浓度磷酸盐离子环境通过抑制c-Fos 的表达，降低 DC-STAMP 和 NFATc1的表达，抑制破骨细胞的形成，表明高浓度的钙磷离子对破骨细胞的生成和活化有抑制作用[36-37]。作者所在课题组前期实验发现，CPC/PLGA 降解液所形成的较低浓度钙磷离子微环境可以促进成骨细胞的分化，促进破骨细胞的相关特异性基因标志物表达[20，38]，因此，适宜的钙磷离子浓度对单核细胞破骨向分化起积极作用。此次实验的PCR和Western blot结果表明，破骨细胞分化相关的基因标志物NFATc1、核因子κB受体活化因子及抗酒石酸酸性磷酸酶在CPC/PLGA 组的表达水平高于对照组和羟基乙酸组，可能是由于 CPC/PLGA降解后释放出的钙磷离子或降解液中其他各成分的相互作用，从而促进了 RAW264.7 细胞向破骨细胞分化。

课题组在前期实验中检测CPC/PLGA在不同时间段的降解浓度时，发现添加1.8 mmol/L磷酸盐离子、0.6 mmol/L钙离子的培养液可促进细胞的增殖和分化能力；观察CPC/PLGA 中 PLGA降解产物羟基乙酸和乳酸的变化，发现羟基乙酸浓度随着降解时间的延长逐渐升高，在第8周时达到 7.4 mg/L 随后降低，而乳酸浓度一直较低，最高浓度为 0.2 mg/L[38-39]，羟基乙酸的浓度变化趋势较大。在研究乳酸对小鼠单核细胞分化的影响时发现，随着乳酸浓度升高，乳酸促小鼠RAW264.7细胞破骨向分化的能力先升高后降低，10 mmol/L 乳酸为促小鼠 RAW264.7 细胞破骨向分化的最适浓度[21]。从而可见PLGA降解后浓度为0.2 g/L的乳酸对单核细胞的影响可能不如羟基乙酸对单核细胞的影响大，因而此次实验设置羟基乙酸组和CPC/PLGA组为实验组，探究羟基乙酸和CPC/PLGA材料对单核细胞破骨向分化的影响。

金属基质蛋白酶9是一种锌依赖性内肽酶，参与细胞外基质中各种蛋白质的降解，促进单核细胞、破骨前体细胞的迁移[40]。金属基质蛋白酶9主要由中性粒细胞和巨噬细胞分泌，正常生理条件下，是一个低表达状态；炎症、肿瘤刺激可使其分泌水平升高[41]。金属基质蛋白酶9通过降解骨有机质中的Ⅰ、Ⅳ型胶原及激活破骨细胞介导骨吸收[42]。金属基质蛋白酶9依赖性组蛋白H3蛋白水解是破骨细胞形成的关键因子，金属基质蛋白酶9表达增加对H3NT蛋白的水解和破骨细胞前体细胞分化有显著的促进作用[43]。研究发现替加环素和米诺环素可显著抑制金属基质蛋白酶9对H3尾的切割，从而阻断核因子κB受体活化因子配体诱导的NFATc1信号通路，抑制破骨细胞的形成[44]。使用氢氧化钙进行根管治疗后，炎症细胞和金属基质蛋白酶9阳性细胞数量少，破骨细胞形成减少，表明金属基质蛋白酶9合成降低会抑制破骨细胞的形成[45]。在此次实验中，羟基乙酸组和 CPC/PLGA 组金属基质蛋白酶9的表达水平较对照组高，可能是添加的羟基乙酸作为外界炎症刺激因子，促进破骨细胞分化，增强金属基质蛋白酶9 基因的表达；但羟基乙酸组并不能提高破骨细胞分化其他标志蛋白(如 NFATc1、核因子κB受体活化因子)的表达。因此，后续仍需进一步实验研究才能确定羟基乙酸对金属基质蛋白酶9的作用机制以及在破骨细胞分化中所起的作用。

综上，此次实验结果表明CPC/PLGA 降解产物所构成的微环境促进了单核细胞破骨向分化，提示微环境的改变可影响单核细胞的分化方向。此次实验从骨组织工程材料降解后的微环境对单核细胞破骨向分化的影响入手，探索微环境改变对材料降解速率和新骨形成速率的影响，为提高骨组织材料在植入区新骨形成的效率提供一些理论依据。此次实验只研究了羟基乙酸、CPC/PLGA总降解产物对破骨细胞分化的影响，未深入单独探讨各降解成分的具体作用，若要探索各组分在其中起到的具体作用及机制，则需要进一步的实验证明。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
磷酸钙骨水泥/聚乳酸羟基乙酸共聚物：聚乳酸羟基乙酸是由乳酸和羟基乙酸聚合而成的高分子聚合物，具有可降解性、良好的生物相容性等优点，与磷酸钙骨水泥复合后，可加速磷酸钙骨水泥材料生物降解和新骨的形成速率。
金属基质蛋白酶9：属于锌金属蛋白酶家族，主要由中性粒细胞和巨噬细胞分泌，正常生理状态下处于低表达的状态，炎症、肿瘤刺激可使其分泌水平升高；激活后可降解细胞外基质，促进单核细胞、破骨前体细胞的迁移。

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磷酸钙复合材料最接近自体骨的矿物性质和结构，因其具有良好的生物相容性、流动性、可塑性和骨传导性，被认为是最佳的骨修复材料，在骨科和牙科具有广阔的应用前景，但其存在降解速率慢、骨转换率低等缺点，在骨缺损修复中会导致降解速率与成骨性能适配性不佳，影响骨缺损修复治疗，其中磷酸钙骨水泥/聚乳酸羟基乙酸(CPC/PLGA)材料的降解速率和新骨形成量优于其他化合物。此次研究观察CPC/PLGA降解产物构成的微环境对小鼠单核细胞破骨向分化的影响，检测破骨细胞分化相关标志物的基因和蛋白的变化，发现其通过核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体结合调节核因子κB 信号通路，激活T细胞核因子c1促进小鼠RAW264.7细胞破骨向分化。

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