不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞分泌相关蛋白及细胞因子的影响

doi:10.12307/2022.384

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (19): 3043-3047.doi: 10.12307/2022.384

• 牙髓及牙周膜干细胞 Dental pulp and periodontal ligament stem cells • 上一篇下一篇

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞分泌相关蛋白及细胞因子的影响

李琨1，安婕2，董素阁1，崔丽丽1，刘蕾1，李婷婷1

1郑州大学第五附属医院口腔科，河南省郑州市 450052；2荷兰拉德堡德大学，奈梅亨 6525GA

收稿日期:2020-11-23 修回日期:2021-02-27 接受日期:2021-08-25 出版日期:2022-07-08 发布日期:2021-12-28
通讯作者: 安婕，博士，研究员，荷兰拉德堡德大学，奈梅亨 6525GA
作者简介:李琨，女，1972年生，湖南省邵阳市人，苗族，副主任医师，主要从事口腔修复与种植方面的研究。
基金资助:
河南省高等学校重点科研项目计划(教育厅)(14A320020)，项目负责人：李琨

Effects of different fimA genotypes of Porphyromonas gingivalis on the secretion related proteins and cytokines in human umbilical vein endothelial cells

Li Kun1, An Jie2, Dong Suge1, Cui Lili1, Liu Lei1, Li Tingting1

1Department of Stomatology, Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China; 2Radboud University, Nijmegen 6525GA, The Netherlands

Received:2020-11-23 Revised:2021-02-27 Accepted:2021-08-25 Online:2022-07-08 Published:2021-12-28
Contact: An Jie, MD, Researcher, Radboud University, Nijmegen 6525GA, The Netherlands
About author:Li Kun, Associate chief physician, Department of Stomatology, Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Supported by:
the Key Scientific Research Project Plan of Higher Education Institutions in Henan Province (Education Department), No. 14A320020 (to LK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
牙龈卟啉单胞菌：在动脉粥样硬化型心血管疾病患者股骨动脉、冠状动脉内可检出600种以上口腔菌群，其中牙龈卟啉单胞菌约占80%。牙龈卟啉单胞菌是当前研究广泛且证据充足的重要牙周致病菌之一，且近年发现牙龈卟啉单胞菌感染是动脉粥样硬化的一个新的独立危险因素。
单核细胞趋化蛋白1：由76个氨基酸组成的单肽链，它既具有特异的单核细胞趋化活性，也具有激活单核细胞的活性，在机体防御、炎症恢复和抗肿瘤等方面起着重要作用。

背景：牙龈卟啉单胞菌感染是近年发现与动脉粥样硬化等多种疾病发生有关的危险因素，但不同fimA基因型的牙龈卟啉单胞菌致病能力不同，积极探明牙龈卟啉单胞菌高危菌株对于完善动脉粥样硬化诊疗机制具有重要作用。
目的：探讨不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞分泌单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、内皮素1/一氧化氮的影响。
方法：厌氧条件下对Ⅳ、Ⅱ、ⅠfimA基因型牙龈卟啉单胞菌进行培养，应用感染复数值为100感染人脐静脉内皮细胞，同时设阳性对照组为牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激人脐静脉内皮细胞、阴性对照组人脐静脉内皮细胞仅加细胞培养液培养。采用酶联免疫吸附法检测各组培养2，6，24 h后人脐静脉内皮细胞培养上清液中单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、内皮素1/一氧化氮水平。
结果与结论：除阴性对照组外，其他4组人脐静脉内皮细胞培养上清液中白细胞介素6、内皮素1/一氧化氮、单核细胞趋化蛋白1水平逐渐增高，且ⅣfimA基因型刺激组白细胞介素6、内皮素1/一氧化氮水平高于Ⅱ、ⅠfimA基因型刺激组及阳性对照组、阴性对照组(P < 0.05)；ⅡfimA基因型刺激组单核细胞趋化蛋白1水平高于Ⅳ、ⅠfimA基因型刺激组、阴性对照组(P < 0.05)。结果表明，不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激人脐静脉内皮细胞功能紊乱机制存在一定差异，Ⅱ、Ⅳ fimA基因上调单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、内皮素1/一氧化氮分泌能力较强，可能在引起血管内皮细胞功能紊乱中占主导地位。

https://orcid.org/0000-0003-4690-186X (李琨)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 人脐静脉内皮细胞, 牙龈卟啉单胞菌, fimA基因型, 单核细胞趋化蛋白1, 白细胞介素6, 内皮素1

Abstract: BACKGROUND: Porphyromonas gingivalis infection is a risk factor that has been found to be related to atherosclerosis and other diseases in recent years. However, different fimA genotypes of Porphyromonas gingivalis have different pathogenic abilities. Actively explore Porphyromonas gingivalis high-risk bacterial strains play an important role in improving the diagnosis and treatment mechanism of atherosclerosis.
OBJECTIVE: To investigate the effects of different fimA genotypes of Porphyromonas gingivalis on the secretion of monocyte chemoattractant protein-1, interleukin-6, and endothelin-1/nitric oxide in human umbilical vein endothelial cells.
METHODS: Porphyromonas gingivalis genotypes IV, II, and I fimA were cultured under anaerobic conditions, and the multiplicity of infection was 100 to infect human umbilical vein endothelial cells. In the positive control group, Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide was used to stimulate human umbilical vein endothelial cells, and in the negative control group, human umbilical vein endothelial cells were cultured with cell culture medium only. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the levels of monocyte chemoattractant protein 1, interleukin 6, endothelin 1/nitric oxide in the culture supernatant of human umbilical vein endothelial cells after 2, 6, and 24 hours in each group.
RESULTS AND CONCLUSION: Except for the negative control group, the levels of interleukin 6, endothelin 1/nitric oxide, and monocyte chemoattractant protein 1 in the culture supernatant of human umbilical vein endothelial cells in the other four groups gradually increased. The levels of interleukin 6, endothelin 1/nitric oxide in the iv fimA genotype stimulation group were higher than those in the ii and i fimA genotype stimulation groups and the positive control group and the negative control group (P < 0.05). The level of monocyte chemoattractant protein 1 in the ii fimA genotype stimulation group was higher than that in the iv, i fimA genotype stimulation group and the negative control group (P < 0.05). The results indicate that there are certain differences in the dysfunction mechanisms of Porphyromonas gingivalis with different fimA genotypes in stimulating human umbilical vein endothelial cells. The ii fimA genotype and iv fimA gene have a strong ability to up-regulate the secretion of monocyte chemoattractant protein 1, interleukin 6, and endothelin 1/nitric oxide, and may play a dominant role in causing vascular vein endothelial cell dysfunction.

Key words: human umbilical vein endothelial cells, Porphyromonas gingivalis, fimA genotype, monocyte chemoattractant protein-1, interleukin-6, endothelin-1

中图分类号:

李琨, 安婕, 董素阁, 崔丽丽, 刘蕾, 李婷婷. 不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞分泌相关蛋白及细胞因子的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(19): 3043-3047.

Li Kun, An Jie, Dong Suge, Cui Lili, Liu Lei, Li Tingting. Effects of different fimA genotypes of Porphyromonas gingivalis on the secretion related proteins and cytokines in human umbilical vein endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(19): 3043-3047.

图/表（结果） 3

2.1 人脐静脉内皮细胞培养及鉴定结果人脐静脉内皮细胞呈多角形或菱形贴壁生长，细胞核呈圆形或者椭圆形，可见一两个核仁，且细胞生长速度快，2-5 d可融合成片，呈典型铺路石状镶嵌排列，互不重叠；CD31与第Ⅷ因子免疫细胞化学染色后细胞胞浆中可见棕黄色阳性颗粒，表明培养人脐静脉内皮细胞属血管内皮细胞。
2.2 各组人脐静脉内皮细胞培养上清液内单核细胞趋化蛋白1水平 Ⅳ、Ⅱ、Ⅰ fimA基因型刺激组及阳性对照组培养2，6，24 h后，人脐静脉内皮细胞培养上清液中单核细胞趋化蛋白1水平逐渐增高(P < 0.05)；组间比较，各时间点人脐静脉内皮细胞培养上清液内单核细胞趋化蛋白1水平ⅡfimA基因型刺激组高于ⅣfimA基因型刺激组、ⅠfimA基因型刺激组、阴性对照组(t=2.342-22.168，P均 < 0.05)，ⅣfimA基因型刺激组高于ⅠfimA基因型刺激组、阴性对照组(t=5.407-8.521，P均 < 0.05)，且各时间点ⅡfimA基因型刺激组高于阳性对照组(t=3.959-11.151，P均 < 0.05)，培养2，6 h后ⅣfimA基因型刺激组高于阳性对照组(t2 h=5.971，t6 h=
3.775，P均 < 0.05)，培养6，24 h后ⅠfimA基因型刺激组、阳性对照组高于阴性对照组(t=2.679-7.042，P均 < 0.05)；阴性对照组各时间点人脐静脉内皮细胞培养上清液内单核细胞趋化蛋白1水平相比，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.3 各组人脐静脉内皮细胞培养上清液内白细胞介素6水平 Ⅳ、Ⅱ、ⅠfimA基因型刺激组及阳性对照组培养2，6，24 h后，人脐静脉内皮细胞培养上清液内白细胞介素6水平逐渐增高(P < 0.05)；组间比较，各时间点人脐静脉内皮细胞培养上清液中白细胞介素6水平Ⅳ fimA基因型刺激组高于ⅡfimA基因型刺激组、ⅠfimA基因型刺激组及阳性对照组、阴性对照组(t=2.311-39.625，P均< 0.05)，且ⅡfimA基因型刺激组、ⅠfimA基因型刺激组、阳性对照组均高于阴性对照组(t=4.135-39.569，P均< 0.05)，培养2，6 h后ⅡfimA基因型刺激组高于ⅠfimA基因型刺激组(t2 h=5.760，t6 h=2.079，P均< 0.05)；阴性对照组各时间点人脐静脉内皮细胞培养上清液内白细胞介素6水平相比，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.4 各组人脐静脉内皮细胞培养上清液中内皮素1/一氧化氮水平 Ⅳ、Ⅱ、ⅠfimA基因型刺激组及阳性对照组培养2，6，24 h后，人脐静脉内皮细胞培养上清液中内皮素1/一氧化氮水平逐渐增高(P < 0.05)；组间比较，各时间点人脐静脉内皮细胞培养上清液中内皮素1/一氧化氮水平ⅣfimA基因型刺激组高于ⅡfimA基因型刺激组、ⅠfimA基因型刺激组及阳性对照组、阴性对照组(t=4.521-9.149，P均 < 0.05)，且ⅡfimA基因型刺激组、ⅠfimA基因型刺激组高于阳性对照组及阴性对照组(t=2.297-4.767，P均 < 0.05)；阴性对照组各时间点人脐静脉内皮细胞培养上清液中内皮素1/一氧化氮水平相比，差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，两组间比较采用独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2018年1月至2020年1月在郑州大学第五附属医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞人脐静脉内皮细胞来源于郑州大学第五附属医院中心实验室。
1.3.2 实验仪器、试剂 RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(上海赛默飞生物科技有限公司)；内皮细胞生长添加剂 (美国Amresco公司)；青/链霉素(上海北诺生物科技有限公司)；牛心脑浸液培养基(英国OXIOD公司)；脂多糖、氯化血红素(美国Sigma公司)；鼠抗人Ⅷ因子单抗(上海信裕生物科技有限公司)；羊抗人CD31单抗(美国 Santa Cruz公司)； Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、MTT试剂盒(上海西塘生物科技有限公司)；单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、内皮素1、一氧化氮酶联免疫试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；厌氧培养箱(YQX-3型，冠森生物科技上海公司)；CO2细胞培养箱(BB15型，美国 Thermo 公司)；倒置相差显微镜(DMIL-PH1型，德国Leica公司)；酶标仪(ELx 800型，美国BioTek公司)。牙龈卟啉单胞菌由郑州大学第五附属医院中心实验室提供。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养、鉴定人脐静脉内皮细胞株在饱和湿度、 37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养，细胞培养基为含体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养液，取对数期细胞接种至含盖玻片的6孔板(105-106个/孔)，待细胞完全贴壁，取出盖玻片，加入丙酮4 ℃固定10 min，PBS反复洗涤，加入体积分数为3% H2O2室温孵育10 min，灭除内源性过氧化物酶活性，加入封闭液37 ℃孵育30 min，弃封闭液，加入鼠抗人Ⅷ因子单抗(1∶100)、羊抗人CD31单抗(1∶100)，37 ℃孵育60 min，PBS反复洗涤，加入二抗37 ℃孵育20 min，PBS反复洗涤，DAB显色，苏木精染色，梯度乙醇脱水，封固，显微镜观察，拍片。
1.4.2 牙龈卟啉单胞菌株培养、感染人脐静脉内皮细胞复苏冷冻干燥管内ⅠfimA型、ⅡfimA型、Ⅳ fimA型牙龈卟啉单胞菌菌株，接种至牛心脑浸液血琼脂培养基(含1 mg/L维生素K1、5 mg/L氯化血红素)，厌氧培养48 h(37 ℃、体积分数为10% CO2、体积分数为10% H2)，取对数生长期菌株加入PBS悬浮液，使用细菌比浊仪检测菌液浓度，按感染倍数100∶1分别感染14份人脐静脉内皮细胞样本，分别在感染后2，6，24 h采用酶联免疫吸附法检测培养上清液内单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、内皮素1、一氧化氮水平，由资深检验医师按试剂盒操作步骤规范完成，设阳性对照组为牙龈卟啉单胞菌脂多糖(0.1 μg/L)刺激人脐静脉内皮细胞、阴性对照组为仅加细胞培养液的人脐静脉内皮细胞。
1.5 主要观察指标 ①人脐静脉内皮细胞培养及鉴定结果；②各组人脐静脉内皮细胞培养上清液内单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、内皮素1/一氧化氮水平。
1.6 统计学分析采用统计学软件SPSS 19.0处理数据，计量资料以x±s描述，采取Bartlett 方差齐性检验与 Kolmogorov-Smirnov正态性检验，均确认具备方差齐性且近似服从正态布，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的主要致病菌，流行病学、分子学及免疫学等多方面研究证实，牙龈卟啉单胞菌还与动脉粥样硬化发生、发展关系密切[7-8]。相关研究显示，在动脉粥样硬化型心血管疾病患者股骨动脉、冠状动脉内可检出600种以上口腔菌群，其中牙龈卟啉单胞菌约占80%[9]，但目前尚未完全明确牙龈卟啉单胞菌介导动脉粥样硬化发生发展的具体机制，明确其病理过程，对临床加强动脉粥样硬化防治具有重要指导意义。
已有研究证实，牙龈卟啉单胞菌主要通过细胞毒性及炎症反应介导牙周炎进展过程，而趋化因子白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1在机体一系列病理生理中发挥重要作用，参与血管内皮细胞损害进程[10]。牙龈卟啉单胞菌根据fimA基因核苷酸序列可分为Ⅰ-Ⅴ型及Ⅰb fimA型，其中Ⅱ、Ⅳ fimA型与慢性牙周炎、中重度牙周炎具有密切关系，可能是高毒力株，ⅠfimA型可能是低病毒株[11]。因此，该研究采取Ⅰ、Ⅱ、ⅣfimA型牙龈卟啉单胞菌刺激人脐静脉内皮细胞，结果显示，阴性对照组仅少量表达白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1，而Ⅱ、ⅣfimA型牙龈卟啉单胞菌能更迅速激活人脐静脉内皮细胞生成白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1，且Ⅱ、ⅣfimA基因型刺激组人脐静脉内皮细胞培养上清液中白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1水平高于ⅠfimA基因型刺激组(P < 0.05)。白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1能趋化、迁移白细胞进入动脉壁组织，介导动脉粥样硬化形成过程[12]。当前对牙龈卟啉单胞菌刺激血管内皮细胞生成白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1的研究持两种观点，一是牙龈卟啉单胞菌刺激下人脐静脉内皮细胞表达白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1 mRNA的能力上调，而细胞分泌白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1水平降低，此过程可能与牙龈卟啉单胞菌蛋白酶抑制白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1分泌有关，推测牙龈卟啉单胞菌短暂介导血管内皮细胞趋化因子反应行为可能利于病原菌与宿主共生，在机体慢性炎症反应中发挥重要作用[13]；二是牙龈卟啉单胞菌感染能刺激内皮组织生成白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1等趋化因子，将白细胞募集、迁移至内皮下间隙，参与动脉粥样硬化发生发展[14-15]。该研究结果与第二种观点近似，提示Ⅱ、ⅣfimA基因型牙龈卟啉单胞菌诱导细胞分泌白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1的能力更强。有学者对比不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对牙周组织炎症反应，发现Ⅱ、Ⅳ fimA基因型牙龈卟啉单胞菌诱导白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白1表达能力亦较强[16-17]。牙周炎与动脉粥样硬化均属慢性炎症损害性疾病，发生机制存在诸多相似之处，且牙龈卟啉单胞菌可通过炎症所破坏的牙周组织进入外周血循环，黏附、侵袭内皮组织，造成血管内皮细胞损伤，介导动脉粥样硬化发生[18-19]。
内皮素1是一种强效血管收缩因子，可诱发全身血管发生强烈收缩，刺激血管平滑肌增生，且其具有介导血管细胞分泌生长因子的能力，而这些物质又会继续促进内皮素1分泌，进一步加重血管内皮损害，促进动脉粥样硬化发展[20-21]。一氧化氮是全身血管舒张因子，具有多种生物学效应，与内皮素1协同调节血管舒张、收缩过程，正常情况二者在机体中保持相对平衡稳定状态，但病理刺激会致内皮素1/一氧化氮失衡，造成血管舒张-收缩紊乱，导致血管内皮细胞损害[22-23]。该研究采取不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激人脐静脉内皮细胞，分3个时间段检测，结果发现，牙龈卟啉单胞菌刺激下人脐静脉内皮细胞分泌内皮素1、一氧化氮存在时间依赖性，24 h后分泌水平达到高峰。杨志虹等[24]研究发现，体外单独刺激血管内皮细胞可促进其分泌内皮素1、一氧化氮，损害血管内皮细胞正常生理功能。在该研究中，起始2，6 h时Ⅰ、Ⅱ、ⅣfimA基因型牙龈卟啉单胞菌诱导人脐静脉内皮细胞生成内皮素1、一氧化氮的速度相对缓慢，与漆正楠等[25]研究相似，起始阶段牙龈卟啉单胞菌可刺激人脐静脉内皮细胞生成内皮素1、一氧化氮，随时间延长，牙龈卟啉单胞菌不断增殖、侵袭，人脐静脉内皮细胞生成内皮素1、一氧化氮速度呈逐渐升高趋势。此外，该研究还发现，不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激人脐静脉内皮细胞生成内皮素1、一氧化氮能力不同，推测可能与牙龈卟啉单胞菌黏附、侵袭细胞能力强弱有关。有研究发现ⅡfimA基因型牙龈卟啉单胞菌黏附、侵袭口腔上皮细胞能力最强，但其仅应用1株ⅡfimA基因型牙龈卟啉单胞菌模式株，因此尚无法完全定论。有学者检测牙龈卟啉单胞菌对KB细胞侵袭能力发现，Ⅱ、ⅣfimA基因型侵袭能力最大可相差17倍[26]。该研究采取14份样本通过对比不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌发现，ⅣfimA基因型刺激组各时间点人脐静脉内皮细胞培养上清液中内皮素1/一氧化氮水平均高于Ⅰ、Ⅱ fimA基因型刺激组、阳性对照组、阴性对照组(P < 0.05)，提示ⅣfimA基因型牙龈卟啉单胞菌在介导内皮素1/一氧化氮方面毒性最强。但不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌介导动脉粥样硬化的强弱程度及机制不尽相同，需后期进行基础实验进一步探究。
综上可知，不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激人脐静脉内皮细胞功能紊乱机制存在一定差异，Ⅱ、Ⅳ fimA基因上调单核细胞趋化蛋白1、白细胞介素6、内皮素1/一氧化氮分泌能力较强，可能在引起血管内皮细胞功能紊乱中占主导地位。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞分泌相关蛋白及细胞因子的影响

Effects of different fimA genotypes of Porphyromonas gingivalis on the secretion related proteins and cytokines in human umbilical vein endothelial cells

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