2.1  实验动物数量分析  48只SPF级SD大鼠参与实验，术后3 d内每天注射2次青霉素抗感染，实验过程中控制环境温度，饲养条件和管理方式一致，均进入结果分析，中途未有脱落。

2.2  生物信息学分析  Gene MAIN生物信息学技术预测分析可知，Bcl-2通过Csf3(细胞集落刺激因子)与Caspase3存在联系，并且Caspase3通过Atf3(细胞转录因子)可与白细胞介素6建立联系，见图1。

2.3  BBB运动功能评分  在脊髓损伤后，仅有假手术组的评分在20，21分，联合治疗组和地塞米松组在打击后评分为0，后肢出现截瘫，由此推测造模成功。对不同时间点评分结果进行分析：生理盐水组、联合治疗组和地塞米松组的BBB评分在各时间点均低于假手术组(P < 0.05)；联合治疗组的BBB评分高于地塞米松组；术后13，14 d，联合治疗组的BBB评分高于生理盐水组(P < 0.05)，见图2。

2.4  Bcl-2、Caspase3和白细胞介素6在大鼠脊髓内的定位分布  采用免疫组织化学方法对白细胞介素6、Bcl-2和Caspase3在脊髓前角神经元的表达情况进行计数，见图3-6。整个恢复时期，联合治疗组较地塞米松组有更多的Bcl-2阳性表达；在7 d时联合治疗组Bcl-2表达高于生理盐水组，差异有显著性意义(P < 0.05)，在3，14 d时联合治疗组的表达同样增多，但差异无显著性意义(P > 0.05)；整个恢复时期，联合治疗组Caspase3阳性表达较生理盐水组下调，在3，7 d时差异有显著性意义(P < 0.05)，在3 d时地塞米松组Caspase3阳性表达低于生理盐水组，差异有显著性意义(P < 0.05)；地塞米松组和联合治疗组白细胞介素6阳性表达在恢复过程中明显下降，在3 d时联合治疗组白细胞介素6阳性表达低于地塞米松组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

脊髓损伤是一种可导致损伤平面以下不同程度运动感觉功能障碍甚至括约肌功能全部丧失的中枢神经系统创伤。脊髓损伤可分为原发性损伤与继发性损伤，减少继发性损伤更有利于脊髓功能恢复，因此如何减少继发性损伤成为国内外脊髓损伤研究的重点^[1]。脊髓在损伤后开始出现一系列复杂的病理生理学变化，其中炎症反应和凋亡反应是脊髓继发性损伤中重要的病理过程^[2-5]，Caspase3和Bcl-2是凋亡相关因子，Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用，是细胞凋亡研究中最受重视的基因之一^[5]，Caspase3被认为是凋亡的关键蛋白酶，一旦被激活，即发生下游的级联反应^[6]，使凋亡不可避免，有大量实验证明Caspase3表达是导致神经元细胞凋亡的重要因素之一^[2]。白细胞介素6是重要的促炎因子，在脊髓损伤后神经元细胞中白细胞介素6表达显著增加^[3]。以上研究提示监测白细胞介素6、Bcl-2和Caspase3的表达可以直观了解炎症和细胞凋亡变化情况。

目前临床上脊髓损伤后的常用药物地塞米松属于糖皮质激素，主要用于危重疾病和各类炎症的治疗。糖皮质激素能降低脊髓损伤后的不利影响^[7-8]，但单独注入后常伴有糖皮质激素受体减少^[9]，而且在某些疾病中单独使用地塞米松还存在毒性大、体内代谢时间短等问题，如急性皮质类固醇肌病和蔓延性感染^[10]。雌激素是一种具有抑制细胞膜脂质过氧化反应能力的类固醇激素。研究证明，雌激素可以通过抑制脂质过氧化，降低钙内流和抗凋亡等途径减轻脊髓损伤后的不利影响，是啮齿动物模型中减轻神经元细胞损伤的潜在缓解剂^[11-14]。娄雪玲^[13]研究还发现雌激素具有较好的抗感染作用，主要抗感染途径与激活炎症细胞有关。目前对于地塞米松和雌激素联合治疗在脊髓损伤恢复时期通过抑制相关因子的表达来减少继发性损伤的相关报道较少^[15-16]。

该实验通过GENE MANIA方法预测白细胞介素6、Caspase3和Bcl-2之间的关系，BBB评分观察大鼠后肢运动功能恢复情况，免疫组织化学检测脊髓组织中白细胞介素6、Bcl-2和Caspase3的表达，对比地塞米松联合雌激素与地塞米松单独使用对大鼠脊髓钝挫伤恢复的影响，以期在此基础上探索脊髓损伤治疗的新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  2018年10月至2019年2月在成都医学院基础医学院实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  健康4周龄雌性SD大鼠48只，体质量200-220 g，SPF级，购于成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(川)2014-028。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。

1.3.2  实验试剂及仪器  打击仪(宏峰，中国)；纯净水净化器(成都优普科技有限公司，中国)；地塞米松磷钠注射液(辰欣药业股份有限公司，中国)；苯甲酸雌二醇注射液(杭州动物药品厂，中国)；氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司，中国)；白细胞介素6一抗(北京博奥森生物技术有限公司，中国)；Bcl-2一抗(北京博奥森生物技术有限公司，中国)；Caspase3一抗(北京博奥森生物技术有限公司，中国)；通用SP试剂盒(SP-9000，中杉金桥，中国)。

1.4  实验方法

1.4.1  生物信息学分析  采用Gene MANIA生物信息学预测白细胞介素6、Caspase3和Bcl-2的关系(http://www. genemania.org)，筛选出具有相互联系的基因，完善实验设计思维，并且对于后续实验的开展具有前瞻性意义。

1.4.2  实验动物及分组  采取分笼饲养，室内温度20- 25 ℃，随机分为4组：假手术组、生理盐水组、地塞米松组、联合治疗组，每组12只。

1.4.3  动物模型制备及治疗  腹腔注射3.6%水合氯醛 (10 mL/kg)麻醉大鼠，将大鼠固定在特制手术台上，以T₁₀为中心，于上下2 cm，左右1.5 cm备皮，乙醇消毒，纵向切开皮肤及皮下组织，切口长2 cm，剥离脊椎旁肌肉并暴露椎板与棘突，使用咬骨钳咬除T₁₀椎板。参照改良Allen's法制备动物模型，打击仪为10 g冲击棒自30 mm高处自由坠落砸伤脊髓^[17-18]，被打击处脊髓出现充血，大鼠后肢及尾部无束缚状态下出现腿部抽搐、摆尾现象，即造模成功，打击完毕后，立即提起冲击棒，用棉签于打击处止血，记录打击时间，清理伤口，逐层缝合肌肉、筋膜、皮肤，碘伏消毒。术后3 d内，大鼠每日腹腔注射1 mL(2×10⁵ U/mL)青霉素预防感染。假手术组将大鼠椎板剥开后暴露脊髓，但不对脊髓进行打击，直接缝合，其余条件与其他3组相同。

脊髓损伤术后30 min和1，2，3，4，5 d的同一时间，假手术组和生理盐水组大鼠注射生理盐水(0.2 mL/kg)，地塞米松组大鼠注射地塞米松(0.2 mg/kg)，联合治疗组大鼠先后注射雌二醇(0.04 mg/kg)、地塞米松(0.2 mg/kg)^[19]。注射部位均为大鼠前肢大腿外侧肌。

1.5  主要观察指标

1.5.1  生物信息学分析  采用Gene MANIA生物信息学预测白细胞介素6、Caspase3和Bcl-2的关系。

1.5.2  大鼠后肢运动功能评分  采取BBB评分体系，术后14 d内每天对各组大鼠后肢运动行为学进行评分，评分范围为0-21分，运动功能完全缺失为0分，正常鼠为21分。评分人员为3位以上熟悉评分标准的未参加模型制备的实验人员，评分后取均值，判断大鼠后肢运动功能恢复情况。

1.5.3  免疫组织化学检测白细胞介素6、Caspase3和Bcl-2的表达  术后3，7，21 d各组大鼠麻醉后处死，自损伤点附近前后各0.5 cm取材，40 g/L多聚甲醛固定24 h；放入自动脱水包埋机进行脱水处理，制备成5 μm厚切片备用；依次进行烤片、脱蜡及水化，高压热抗原还原修复，恢复至室温，用体积分数为3%H₂O₂封闭内源性过氧化酶，正常山羊血清封闭非特异性抗原；加入Bcl-2、Caspase3和白细胞介素6一抗4 ℃孵育18 h，次日取出至室温，0.01 mol/L PBS漂洗；加入羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育0.5 h；现配制DAB-H₂O₂显色液，室温下反应，显微镜下观察显色充分时，及时用0.01 mol/L PBS漂洗终止反应；苏木精复染，1%盐酸乙醇分色，自来水返蓝，脱水，透明树脂封固；Motic显微镜观察阳性结果并用ImageJ软件对阳性细胞计数。

1.6  统计学分析  用SPSS 21.0软件进行统计学处理，计量资料正态分布用x(_)±s表示。两组以上比较时采用单因素方差分析，方差齐行LSD法进行组间比较，方差不齐行Dunnett法进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义；两组比较时采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

目前临床上常使用大剂量的地塞米松治疗脊髓损伤，虽然能够有效降低脊髓损伤后的不利影响，但容易带来如物质代谢、水盐平衡紊乱等诸多不良反应^[9]。雌激素可以通过减少炎症反应、抑制凋亡等途径减轻脊髓继发性损伤^[20-21]，能最大程度保护损伤后剩余的神经组织，对脊髓损伤恢复有良好的促进作用^[6-8，20]，但很少有单独使用雌激素治疗脊髓损伤。该实验通过比较地塞米松联合雌激素与单独使用地塞米松治疗脊髓损伤模型大鼠，评估各组大鼠的运动功能，检测炎症因子白细胞介素6和凋亡相关因子Caspase3、Bcl-2的表达，探究药物联合治疗对脊髓损伤恢复是否有更好地促进作用。

除假手术组外，其余各组脊髓损伤大鼠BBB评分下降为0，各组恢复的起始时间有所不同。对BBB评分数据进行分析，结果显示联合治疗组恢复起始时期更早，并且恢复情况较生理盐水组和地塞米松组更好，以上结果提示联合治疗组对于脊髓损伤后运动功能恢复有促进作用。

Gene MANIA方法预测结果显示Bcl-2和Caspase3之间具有相关性。在CHAN等^[22]研究中，白细胞介素6和Caspase3被验证具有显著的共表达趋势，且能够影响高侵袭性肿瘤细胞黏附、信号转导等生物能效应；OH等^[23]观察到在脊髓损伤恢复过程中对炎症的干预能够较好地抑制Caspase3的表达，炎症干预过程中也出现了白细胞介素6的显著下调。免疫组织化学方法检测结果表明，联合治疗组较地塞米松组Caspase3表达更少并且在3 d和7 d时差异有显著性意义(P < 0.05)。Caspase3基因是细胞中的一类凋亡基因^[24]，Caspase3可激活特定信号系统，产生核皱缩、DNA片段形成等凋亡现象，最终导致细胞凋亡^[25]。NGUYEN等^[26]证明Caspase3的高表达和细胞凋亡密切相关。免疫组织化学方法检测结果表明，联合治疗组较地塞米松组表达更多并且呈现上升趋势，且在14 d时差异有显著性意意义(P < 0.05)。Bcl-2在神经元细胞的抗凋亡机制中起重要作用，朱旻宇等^[27]证明Bcl-2表达可以强力抑制细胞凋亡并且增强细胞活性，SMERAGE等^[28]通过向脊髓损伤大鼠转染Bcl-2基因的实验发现Bcl-2基因会转运到Clarke核神经元，从而减少细胞萎缩并防止细胞死亡，对细胞凋亡起到抑制作用。该实验结果表明，联合治疗后神经元细胞的抗凋亡能力更强。脊髓损伤后进行联合用药治疗效果较好，其机制可能是通过提高Bcl-2的表达同时降低Caspase3的表达从而抑制神经元细胞凋亡。

白细胞介素6作为主要促炎因子之一^[29]，能调节巨噬细胞以及中性粒细胞的作用来促进蛋白水解酶和各种促炎性细胞因子进入脊髓损伤区域，造成神经元细胞的机械性损伤、电解质溢出等，而这些并发症会严重阻碍脊髓功能的恢复^[30]。研究表明，白细胞介素6能够诱导特定的炎性细胞侵入局部受损脊髓产生继发性炎症反应，加重受损脊髓的损害^[25，30]，王涛丽等^[31]实验证实对炎症的适当干预能有效促进脊髓损伤恢复。该实验对白细胞介素6阳性表达神经元进行计数，联合治疗组的白细胞介素6表达较地塞米松组低且在7，14 d差异有显著性意义(P < 0.05)，而地塞米松组的白细胞介素6水平一直处于较高水平。以上研究结果提示联合用药可降低白细胞介素6的表达，减少炎症的发生，促进大鼠后肢运动功能的恢复。

综上所述，联合用药可更好地减少炎症反应，抑制脊髓神经元细胞凋亡，减少由神经元凋亡引起的继发性损伤，保护脊髓神经元从而促进大鼠后肢运动功能的恢复。该研究为地塞米松与雌激素联合治疗脊髓损伤提供了依据，为临床治疗策略的选择提供了参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

生物信息学分析：生物信息学是随着生命科学和计算机科学迅猛发展的一门学科，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。该研究使用常用工具Gene MAIN对白细胞介素6、Caspase3和Bcl-2的相关性进行分析，结果显示Bcl-2通过Csf3(细胞集落刺激因子)与Caspase3存在联系，并且Caspase3通过Atf3(细胞转录因子)可与白细胞介素6建立联系。Csf3等中间因子可能就是药物协同抵消负性作用的关键位点。

联合用药：主要是为了增加药物的疗效或为了减轻药物的毒副作用。该研究所聚焦的雌激素和地塞米松都具有一定的毒副作用，雌激素具有较好的抗凋亡作用，但在术后的抗感染阶段可过度激活炎症反应；地塞米松则能够有效缓解炎症反应的发生，减少脊髓损伤部位炎细胞数量。因此两者联合可以较好地避免负性效应，增强正性的治疗作用。

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脊髓损伤属于严重的中枢神经系统病变，该疾病的发生发展与炎症、水肿和凋亡等继发性病理变化关系密切。临床药物大都直接单独针对这些基本病理变化中某一特定病变，干预效果较好。但是药物大都存在不同程度毒副作用，医生在临床用药时大都不会单一使用，而是根据药理知识合理搭配药物以减轻毒副作用。然而，联合治疗相关分子机制较为复杂，如何透过现象观察特定的分子变化，成为了基础研究的一个重要方向。近年来，中医的方剂、物理化学因素协同治疗以及干细胞移植协同药物等治疗作用及机制研究已经愈来愈热。作者大胆推测，“联合/协同”的深入研究可能成为未来各领域发展创新的关键思维，单一因素的研究已经接近尾声，联合/协同将开启新一轮探索。

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