碱性成纤维细胞生长因子拮抗细胞外炎性因子保护软骨细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2724

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (23): 3621-3626.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2724

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

碱性成纤维细胞生长因子拮抗细胞外炎性因子保护软骨细胞

杨帆^1，2，刘保一²，曹孟²，朱小姝³，张于²，覃开蓉¹，赵德伟^1，2

¹大连理工大学生物医学工程系，辽宁省大连市 116024；²大连大学附属中山医院骨科，辽宁省大连市 116001；³中山大学附属第八医院，广东省深圳市 518033

收稿日期:2019-08-14 修回日期:2019-08-16 接受日期:2019-10-15 出版日期:2020-08-18 发布日期:2020-04-25
通讯作者: 赵德伟，博士，主任医师，教授，大连理工大学生物医学工程系，辽宁省大连市 116024；大连大学附属中山医院骨科，辽宁省大连市 116001
作者简介:杨帆，男，1987年生，黑龙江省大庆市人，汉族，大连理工大学在读博士，医师，主要从事生物材料和骨科学相关的实验研究。
基金资助:
中国博士后科学基金面上项目(2017M621116)；大连市高层次人才创新支持计划－“科技之星”项目(2017RQ154)；辽宁省博士启动基金项目(201601299)；辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2015021)

Basic fibroblast growth factors protect chondrocytes by antagonizing extracellular inflammatory factors

Yang Fan^{1, 2}, Liu Baoyi², Cao Meng², Zhu Xiaoshu³, Zhang Yu², Qin Kairong¹, Zhao Dewei^{1, 2}

¹Department of Biomedical Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning Province, China; ²Department of Orthopedics, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, Liaoning Province, China; ³The Eighth Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China

Received:2019-08-14 Revised:2019-08-16 Accepted:2019-10-15 Online:2020-08-18 Published:2020-04-25
Contact: Zhao Dewei, MD, Chief physician, Professor, Department of Biomedical Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning Province, China; Department of Orthopedics, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, Liaoning Province, China
About author:Yang Fan, MD candidate, Physician, Department of Biomedical Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning Province, China; Department of Orthopedics, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, Liaoning Province, China
Supported by:
the Postdoctoral Science Foundation of China (General Project), No. 2017M621116; Dalian High-Level Talent Innovation Support Program-“Science and Technology Star” Project, No. 2017RQ154; Liaoning Provincial Doctoral Start-up Foundation, No. 201601299; General Research Project of Liaoning Education Department, No. L2015021

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

碱性成纤维细胞生长因子：是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白，可诱导多种细胞增殖与分化，如软骨细胞、成纤维细胞、骨细胞、血管内皮细胞、肾上腺皮质和髓质细胞、神经元和神经胶质细胞等，在血管形成、促进创伤愈合与组织修复、促进神经组织生长发育过程中起着十分重要的作用。

炎性细胞因子：是指参与炎症反应的各种细胞因子，主要包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素6等，其具有激活中性粒细胞和淋巴细胞、诱导B细胞分化和产生抗体、诱导T细胞活化增殖与分化、参与机体免疫应答、促进炎性反应等免疫学作用。

背景：目前对于碱性成纤维细胞生长因子促进软骨细胞增殖以及白细胞介素1等炎性因子破坏软骨细胞结构的研究较多，但尚未有二者联合对软骨细胞影响的报道。

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子和炎性因子对软骨细胞增殖、分化的影响。

方法：取体外培养第3代SD大鼠软骨细胞分为4组：①空白对照组：软骨细胞单独培养；②阴性对照组：加入含肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和白细胞介素6的无血清DMEM/F12培养基进行培养；③阳性对照组：加入含碱性成纤维细胞生长因子的无血清DMEM/F12培养基进行培养；④实验组：加入含肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素6和碱性成纤维细胞生长因子的无血清DMEM/F12培养基进行培养。CCK-8法检测第3，5，7天各组软骨细胞的增殖活性；ELISA检测第3，5，7天各组软骨细胞中炎性因子水平；免疫荧光染色检测第7天各组软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的蛋白水平；Real time-PCR检测第3，5，7天各组软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的mRNA水平。

结果与结论：①4组软骨细胞在3个时间点增殖情况，阳性对照组>实验组>空白对照组>阴性对照组；②与空白对照组相比，阴性对照组白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平明显升高(P < 0.05)；与阴性对照组相比，实验组白细胞介素1、白细胞介素6和含肿瘤坏死因子α水平明显降低(P < 0.05)；③空白对照组、阳性对照组、实验组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖染色均呈现阳性，阳性对照组软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达最显著；④与空白对照组相比，阳性对照组、实验组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖在各时间点表达均上调，差异有显著性意义(P < 0.05)；而阴性对照组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖在各时间点表达均下调，与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果表明，合理应用碱性成纤维细胞生长因子能有效维持软骨细胞的表型，抑制去分化，促进细胞增殖。

ORCID: 0000-0001-8611-0558(赵德伟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词:

软骨细胞, 细胞增殖, 细胞分化, 碱性成纤维细胞生长因子, 白细胞介素1, 白细胞介素6, 肿瘤坏死因子α

Abstract:

BACKGROUND: Nowadays, there are many studies addressing basic fibroblast growth factor (bFGF) that promotes chondrocyte differentiation and inflammatory factors that damage chondrocyte structure, such as interleukin-1, but there are no reports on the combined effect of the two factors on chondrocytes.

OBJECTIVE: To observe the effect of bFGF and inflammatory cytokines on growth characteristics and differentiation potential of chondrocytes.

METHODS: Passage 3 chondrocytes from Sprague-Dawley rats cultured in vitro were divided into four groups: a blank control group in which chondrocytes were cultured alone, a negative control group in which chondrocytes were cultured with serum-free DMEM/F12 containing tumor necrosis factor-α, interleukin-1 and interleukin-6, a positive control group in which chondrocytes were cultured with serum-free DMEM/F12 containing bFGF, and an experimental group in which chondrocytes were cultured with serum-free DMEM/F12 containing bFGF, tumor necrosis factor-α, interleukin-1 and interleukin-6. At 3, 5, and 7 days after culture, the proliferative activity of chondrocytes was detected by cell counting kit-8 method; the levels of inflammatory cytokines were determined by ELISA method; and mRNA expression of collagen type II and proteoglycan in chondrocytes was measured by real-time PCR. Protein levels of collagen type II and proteoglycan were assessed by immunofluorescence assay at 7 days after culture.

RESULTS AND CONCLUSION: At 3, 5, 7 days after culture, the proliferation of chondrocytes ranked as follows: positive control group > experimental group > blank control group > negative control group. Compared with the blank control group, the expressions of interleukin-1, interleukin-6 and tumor necrosis factor-α were significantly increased in the negative control group. However, compared with the negative control group, the expressions of the above three inflammatory cytokines in the experimental group showed a significant decline (P < 0.05). There was positive expression of collagen type II and proteoglycan in the blank control, positive control and experimental groups, especially in the negative control group. Compared with the blank control group, the expressions of collagen type II and proteoglycan were up-regulated significantly in the positive control and experimental groups. To conclude, the rationale use of bFGF can maintain the phenotype of chondrocytes, inhibit dedifferentiation and promote cell proliferation.

Key words: chondrocytes, cell proliferation, cell differentiation, basic fibroblast growth factor; interleukin-1, interleukin-6, tumor necrosis factor-

中图分类号:

杨帆, 刘保一, 曹孟, 朱小姝, 张于, 覃开蓉, 赵德伟. 碱性成纤维细胞生长因子拮抗细胞外炎性因子保护软骨细胞[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(23): 3621-3626.

Yang Fan, Liu Baoyi, Cao Meng, Zhu Xiaoshu, Zhang Yu, Qin Kairong, Zhao Dewei. Basic fibroblast growth factors protect chondrocytes by antagonizing extracellular inflammatory factors[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(23): 3621-3626.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

随着当代运动热的兴起，关节软骨损伤病例日益增多，由于关节软骨结构的特殊性，使其再生修复过程十分复杂、困难，并且能够有效修复软骨损伤的方法也十分有限^[1]。关节软骨细胞生存于平衡的细胞外基质、可溶性因子和机械应力等环境中，如果这种平衡失衡将会导致软骨细胞分泌白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎性因子，这些炎性因子又可以反作用于软骨细胞，其与软骨细胞表面受体结合诱导合成一系列的酶如基质金属蛋白酶等，降解软骨基质和破坏软骨细胞^[2]。随着传代次数增加和培养时间延长，常规培养的软骨细胞形态逐渐从多角形和圆形变为类似成纤维细胞样的扁平形、长梭形^[3]，同时特异性的软骨细胞外基质成分也从表达Ⅱ型胶原(COL2A1)和蛋白聚糖(ACAN)转变为表达Ⅰ型胶原和纤连蛋白，这种现象被称为软骨细胞的去分化。目前已经证实Ⅱ型胶原和蛋白聚糖是软骨细胞表型的重要决定性基因，因此可通过检测Ⅱ型胶原、蛋白聚糖的基因和蛋白质水平来确定软骨细胞的增殖分化情况^[4]。

碱性成纤维细胞生长因子广泛存在于多种细胞内，是较强的促软骨细胞有丝分裂原，能够促进软骨细胞增殖与基质合成^[5-8]。目前对于碱性成纤维细胞生长因子影响软骨细胞分化以及白细胞介素1等炎性因子破坏软骨细胞结构的研究较多，但尚未有二者联合对软骨细胞影响的报道。该研究拟通过碱性成纤维细胞生长因子和炎性因子联合作用的方式，观察软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖表达变化，从分子水平验证应用碱性成纤维细胞生长因子能否有效维持软骨细胞表型，抑制去分化，以期在体外建立受损细胞修复模型，进而对临床有指导性作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2018年10月至2019年2月在大连大学附属中山医院骨科实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物雄性SD大鼠1只用于软骨细胞分离培养，6周龄，体质量250 g，购买于大连医科大学，实验动物机构许可证号：SYXK(辽)2018-0005，饲养环境为SPF级。

1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM/F12培养基、胎牛血清、双抗、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(Biowest公司)；碱性成纤维细胞生长因子、白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α(Peprotech公司)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；ELISA试剂盒(美国eBioscience公司)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)；超净工作台(日本Sanyo MCV 16BSU)。

1.4 实验方法

1.4.1 软骨细胞的提取与培养大鼠采用10%水合氯醛腹腔过量注射麻醉致死，双下肢反复消毒，游离双侧股骨，彻底清除所附着软组织，分离出双股骨两端(股骨头及股骨髁)软骨组织，弯头镊子取出软骨块放于培养皿中，PBS冲洗杂质及血液、骨组织残渣；将软骨组织切碎成1 mm×1 mm小块，PBS冲洗，转移至50 mL离心管中，加入5 mL 0.02%Ⅱ型胶原酶、5 mL DMEM/F12培养基、500 μL双抗，倾斜放置，在37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养过夜；吹打均匀，经150目筛网过滤，收集细胞，1 000 r/min离心8 min，吸去上清，加入2.5 mL含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打均匀后接种于细胞培养瓶，放置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养，倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。经观察，原代细胞培养3 d后长到培养皿90%左右进行传代，PBS清洗，胰酶消化重悬，调整细胞浓度为6×10⁹ L^-1，接种于新培养瓶。

1.4.2 软骨细胞分组取第3代细胞接种于96孔板，每孔细胞数1×10⁶个，培养1 d后细胞生长至约100%铺满孔底，进行实验分组：①空白对照组：软骨细胞单独培养；②阴性对照组：加入含肿瘤坏死因子α(20 μg/L)、白细胞介素1 (50 μg/L)和白细胞介素6(100 μg/L)的无血清DMEM/F12培养基进行培养；③阳性对照组：加入含碱性成纤维细胞生长因子(20 μg/L)的无血清DMEM/F12培养基进行培养^[9]；④实验组：加入含肿瘤坏死因子α(20 μg/L)、白细胞介素1 (50 μg/L)、白细胞介素6(100 μg/L)和碱性成纤维细胞生长因子(20 μg/L)的无血清DMEM/F12培养基进行培养。

1.4.3 CCK-8实验检测软骨细胞活力采用CCK-8实验检测4组96孔板中软骨细胞的活力。在干预第3，5，7天分别取4组对应的软骨细胞，浸泡于混有30 μL CCK-8检测液的300 μL工作液中，在37 ℃孵育箱中培养2 h，用酶标仪检测450 nm波长处吸光度值，绘制生长曲线。

1.4.4 ELISA检测软骨细胞中白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平按照所购买eBioscience公司试剂盒说明书规定进行操作，在干预第3，5，7天分别取4组对应的软骨细胞，采用ELISA法检测炎性因子白细胞介素1、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平。

1.4.5 免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达取上述4组经炎性因子干预7 d的软骨细胞，PBS洗涤，40 g/L多聚甲醛在室温下固定20 min，0.2%TritonX-100处理细胞5 min以通透细胞膜，PBS洗涤，用含1%BSA的PBS稀释抗Ⅱ型胶原和蛋白聚糖一抗抗体，再将细胞与上述混合液(1∶100)在室温下孵育1 h，PBS洗涤，与山羊抗大鼠IgG H&L(Alexa Fluor^® 488)室温下孵育1 h，PBS洗涤，细胞核用DAPI复染，PBS洗涤，用激光扫描共焦显微镜观察染色情况。

1.4.6 Real time-PCR测定Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达取上述4组经炎性因子干预3，5，7 d的软骨细胞，按照TRIzol试剂说明书提取总RNA，并保存于-80 ℃，按照RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，42 ℃反应1 h；70 ℃反应5 min；4 ℃静置10 min。取2 ng cDNA进行RT-PCR反应，扩增引物见表1，反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 25 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃ 8 min，4 ℃保持。采用2^-^∆∆Ct法计算mRNA表达，以GAPDH作为内参照基因。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠软骨细胞生长及增殖情况；②各组大鼠软骨细胞炎性因子水平；③各组大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达水平。

1.6 统计学分析应用SPSS 22.0进行分析，各组间计量资料比较采用方差分析及LSD两两比较，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

由于损伤或疾病导致的软骨缺损在临床上越来越多见，因软骨自身的结构特殊性，其再生修复过程十分缓慢、复杂，利用组织工程学可实现缺损软骨细胞的体外修复培养^[10-11]。

碱性成纤维细胞生长因子属于生长因子家族，能够正向调节软骨细胞的生长与分化，加速mRNA的转录与蛋白质合成，加速细胞有丝分裂进程，进而促进其分化与增殖^[12-13]。现有研究表明，碱性成纤维细胞生长因子对软骨细胞DNA的合成具有显著促进作用，加入碱性成纤维细胞生长因子培养的软骨细胞在电镜观察下可见丰富的内质网和高尔基体，说明了碱性成纤维细胞生长因子对软骨细胞的增殖具有促进作用^[14]。肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和白细胞介素6等炎性因子对软骨细胞的增殖具有显著抑制作用^[15-16]。现今仍未有二者共同作用对软骨细胞增殖影响的相关实验报道，而这种共同作用更加符合生物体内复杂的内环境，具有很高的实验价值。

为探讨软骨缺损修复过程中碱性成纤维细胞生长因子的刺激调控作用，用CCK-8法、免疫荧光和RT-PCR法分别检测碱性成纤维细胞生长因子对软骨细胞生长及增殖的影响。结果发现培养第3天的阳性对照组细胞即出现明显的增殖趋势并一直持续到第7天，随后用免疫荧光法检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖均呈现显著阳性表达，RT-PCR法检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的mRNA表达均呈现显著上调，说明碱性成纤维细胞生长因子对软骨细胞起到了促进增殖的作用，与DENG等^[17]用碱性成纤维细胞生长因子刺激和修复兔膝关节软骨缺损的结论一致，即24周后发现缺损软骨表面附有一层透明软骨组织；TSAI等^[18]通过体外软骨损伤修复的3D模型也表明加入碱性成纤维细胞生长因子可有效促进软骨细胞的增殖、迁移和分化；其他研究也表明碱性成纤维细胞生长因子可以维持软骨细胞的平衡及修复与再生^[19-22]。

正常的软骨细胞中存在少量的白细胞介素1，而受损的软骨细胞中白细胞介素1水平明显升高，导致软骨基质降解，启动炎症调节，通过级联反应促进白细胞介素6和基质金属蛋白酶的表达，介导软骨细胞凋亡，软骨细胞外基质Ⅱ型胶原合成能力下降，加速基质降解，肿瘤坏死因子α同样也是软骨基质降解的重要因子^[23-26]。实验通过加入肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和白细胞介素6等炎性因子在体外模拟软骨缺损及移植后体内炎性反应微环境，结果阴性对照组较空白对照组的细胞活性明显降低；ELISA检测分析肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和白细胞介素6水平，阴性对照组最高，实验组3种炎性因子水平有所降低；免疫荧光法检测阴性对照组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖呈现弱阳性表达，实验组呈现阳性表达；RT-PCR法检测阴性对照组Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达较空白对照组均显著下调，而实验组则显著上调，以上结果均说明炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和白细胞介素6导致软骨细胞凋亡及基质降解，而碱性成纤维细胞生长因子可以有效拮抗炎性因子对软骨的降解作用，从基因水平上促进Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的合成与表达，促进软骨细胞的修复^[27-28]。

综上所述，碱性成纤维细胞生长因子可正向调节软骨细胞的增殖、分化，并可以拮抗肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和白细胞介素6等炎性因子对软骨细胞合成功能的抑制，起到修复细胞外基质的作用，为进一步的体内软骨修复再生实验提供理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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