2.1   紫草素对RAW264.7细胞生存率的影响   因冻存细胞使用的冻存液含有1%的二甲基亚砜，为排除紫草素抑制破骨细胞生成是药物本身细胞毒性以及冻存时使用的二甲基亚砜本身的毒性作用导致，采用CCK-8比色法测定0-2 μmol/L的紫草素浓度及1%二甲基亚砜对RAW264.7细胞在24，48，72 h的细胞毒性作用。结果显示，0-0.5 μmol/L的紫草素及1%二甲基亚砜 72 h内对RAW264.7的毒性作用较小；0.5 μmol/L在48，72 h时存活率分别为91.1%和76.6%(均P < 0.05)；1，2 μmol/L在24，48，72 h时存活率均低于50%，与对照组(0 μmol/L)相比差异有显著性意义，而其他浓度与对照组相比差异无显著性意义。因此，实验选择了0.062 5-0.5 μmol/L的紫草素浓度进行后续实验，见表2和图1。







2.2   RANKL质量浓度对破骨细胞生成的影响   为研究RANKL质量浓度对破骨细胞生成的影响，用0，30，50，100 μg/L RANKL处理5 d。抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示，RANKL质量浓度越高破骨细胞数目越多，100 μg/L 组的破骨细胞内的细胞核较其他组明显更多。30，50，100 μg/L RANKL组与阴性对照组相比较差异有显著性意义(P < 0.05)，但50 μg/L与100 μg/L 组之间差异无显著性意义。因此，实验选择了50 μg/L的RANKL浓度进行后续实验，见图2，表3。








2.3   紫草素抑制RANKL诱导的破骨细胞生成    为研究紫草素对破骨细胞生成的影响，用RANKL和不同浓度的紫草素(0，0.062 5，0.125，0.25，0.5 μmol/L)处理5 d，进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色。在0.062 5-0.5 μmol/L浓度时紫草素能够抑制体外RANKL诱导的破骨细胞分化，并呈浓度依赖性(F=124.2，P < 0.01)。此外，紫草素还以浓度依赖的方式降低了破骨分化过程中抗酒石酸酸性磷酸酶的活性(F=676.1，P < 0.01)，见图3，表4。







2.4   紫草素抑制RANKL诱导的破骨细胞相关基因表达   为进一步证实紫草素能够抑制破骨细胞的生成，通过实时定量PCR检测紫草素对RANKL诱导5 d后破骨细胞相关标志物基因mRNA表达的影响。紫草素0.125-0.5 μmol/L能够浓度依赖性地抑制基质金属蛋白酶9、组织蛋白酶K、c-Fos(均P < 0.01)mRNA水平的表达；0.062 5 μmol/L的紫草素对RANK、活化T细胞核因子 1 mRNA水平的表达具有明显的抑制作用(均P < 0.01)，见表5，图4。

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牙周炎是一种口腔常见的炎症性疾病，总体患病率为45%-50%，易造成牙周支持组织的破坏，是40岁以上成年人牙齿缺失最主要的原因。严重的牙周炎还会加重动脉粥样硬化、糖尿病等全身性疾病[1-2]，因此牙周病的防治对于维持口腔及全身健康是非常重要的。目前临床上治疗牙周炎的方法主要是机械性清除菌斑、牙石并控制其他局部刺激因素，然而应用药物控制炎症、阻断牙槽骨吸收及促进骨再生也是治疗牙周炎不可缺少的一种方法。因此临床上常使用一些抗菌药物作为辅助治疗，常用的抗菌药物有硝基咪唑类[3]、四环素类[4]、大环酯类等[5]。长期使用抗菌药物不仅会使细菌耐药性增强，而且还会导致患者口腔和肠道菌群紊乱，甚至出现牙面着色、呕吐和腹泻等不良反应[6]。近年来随着中草药的不断发展，中西医结合治疗牙周炎不仅可以协调患者全身状况，还可减少西药使用剂量及其不良反应的发生[7]，但因中草药理化性质复杂，进一步探索其治疗牙周炎的作用机制具有深远的意义。

破骨细胞是来源于骨髓造血系细胞的多核终末分化细胞。RAW264.7细胞系是来源于cAbelson白血病病毒转化的BALB/c小鼠细胞系的单细胞/巨噬细胞样细胞系，近年来因其在巨噬菌体介导的免疫、代谢和吞噬功能方面有很好的特性，被越来越多地用作研究破骨细胞的细胞模型[8]。核因子κB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)与破骨细胞前体细胞结合，通过激活调节破骨细胞生成的转录因子，从而促进破骨细胞的生成[9]。紫草素(Shikonin)是存在于紫草中的一种萘醌类化合物，具有抗炎[10]、抗病毒[11]、抗肿瘤等作用[12]，近年来已有中医利用其清热解毒、消炎止痛的功效将紫草应用于牙周炎的治疗，并发现其疗效甚佳[13]。SHINDO等[14] 研究表明紫草素可以抑制牙周膜干细胞中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α刺激的炎症反应，进而证明其可以作为抗牙周炎的消炎药。因其化学成分复杂，还需要进一步研究其防治牙周炎的作用机制。该实验旨在研究紫草素对RANKL诱导的破骨细胞生成的影响，并初步探讨其作用机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   细胞学实验。
1.2   时间及地点   实验于2021年3-8月在新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院完成。
1.3   材料   RAW264.7细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)、DMEM培养基、α-MEM培养基(Gibco公司，美国)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素-链霉素双抗(penicillin-streptomycin solution，PS)(Biological Industries公司，以色列)；重组小鼠RANKL蛋白(Peprotech公司，美国)；紫草素(源叶，中国上海)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒、抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(索莱宝，中国)；细胞毒性试剂(Dojindo公司，日本)；反转录试剂盒(Thermo Scientific公司，美国)；Quanti Nova SYBR Green PCR试剂盒(QIAGEN公司，德国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   细胞培养   小鼠单核巨噬细胞RAW264.7复苏后接种到含体积分数10%FBS、1%PS的DMEM完全培养基的细胞瓶内，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育过夜，次日观察细胞贴壁情况，待细胞融合至70%-80%传代、冻存。 

1.4.2   CCK-8细胞毒性实验   将RAW264.7细胞以2×103/孔的密度接种于96孔板中，每孔100 μL，每组6个复孔。24 h后弃掉原培养基加入含紫草素浓度为0，0.062 5，0.125，0.25，0.5，1，2 μmol/L及含0.1%二甲基亚砜的DMEM完全培养基，分别培养24，48，72 h后将培养基更换为含 10%CCK-8试剂的DMEM培养基，37 ℃孵育2 h后于酶标仪上选择450 nm测吸光值。通过下述公式计算细胞存活率：[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100%。
1.4.3   RANKL的质量浓度筛选   将RAW264.7细胞以2×103/孔的密度接种于96孔板中，每孔100 μL，每组3个复孔。24 h后细胞贴壁弃去原培养基，分别加入含有0，30，50，100 μg/L RANKL的α-MEM完全培养基，隔天换液。培养5 d后用PBS冲洗，40 g/L多聚甲醛固定细胞10 min，采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色法对细胞染色。倒置相差显微镜下观察，记录破骨细胞阳性细胞的数量(细胞核数≥3)。
1.4.4   抗酒石酸酸性磷酸酶染色   将RAW264.7细胞以2×103/孔的密度接种于96孔板中，每孔100 μL，每组3个复孔。24 h后细胞贴壁弃去原培养基，分别加入含有RANKL(50 μg/L)且紫草素浓度为0，0.062 5，0.125，0.25，0.5 μmol/L的α-MEM完全培养基，隔天换液。培养5 d后用PBS洗2遍，40 g/L多聚甲醛固定细胞10 min，采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色法对细胞染色。倒置相差显微镜下观察，记录破骨细胞阳性细胞的数量(细胞核数≥3)。
1.4.5   抗酒石酸酸性磷酸酶活性检测   将RAW264.7细胞以1×104/孔的密度接种于24孔板中，每孔1 mL，每组3个复孔。24 h后细胞贴壁弃去原培养基，分别加入含有RANKL(50 μg/L)且紫草素浓度为0，0.062 5，0.125，0.25，0.5 μmol/L的α-MEM完全培养基，隔天换液。培养5 d后用PBS洗2遍，使用0.1%Trition裂解细胞提取蛋白，根据抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒在405 nm测定吸光度。根据酶活性定义，计算出样本中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。      
1.4.6   实时定量PCR   将RAW264.7细胞以1×105/皿的密度接种于6 cm培养皿中，每皿5 mL，每组3个平行皿。24 h后细胞贴壁弃去原培养基，别加入含有RANKL且紫草素浓度为0，0.062 5，0.125，0.25，0.5 μmol/L的α-MEM完全培养基，隔天换液。培养5 d后采用 Trizol法提取总RNA，并将其反转录成cDNA用于Real-Time PCR检测基质金属蛋白酶、RANK、组织蛋白酶K、活化T细胞核因子(nuclear factor-activated T cell 1，NFATc1)和原癌基因c-Fos mRNA的表达。使用反应体系为10 μL，反应条件为95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，进行40个循环。基因引物序列见表1，以GAPDH为内参，使用2-ΔΔCt法表示目的基因的相对表达水平。

1.5   主要观察指标   ①筛选紫草素作用于RAW264.7细胞的最佳安全浓度；②筛选诱导破骨细胞的最佳RANKL质量浓度；③观察破骨细胞的形态、抗酒石酸酸性磷酸酶染色及抗酒石酸酸性磷酸酶活性情况；④破骨细胞标志性基因基质金属蛋白酶9、组织蛋白酶K、RANK、活化T细胞核因子和c-Fos的mRNA表达。
1.6   统计学分析   采用SPSS 24.0统计软件进行统计学分析。计量资料使用x±s表示，若满足正态性及方差齐性，采用单因素方差分析，组间两两比较采用Dunnett法；若不满足正态性及方差齐性，则采用秩和检验。检验水准：α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过新疆医科大学生物统计学专家审核。

牙周炎是一种细菌导致的慢性炎症性疾病，可导致牙周支持组织的破坏[15]。牙槽骨作为牙周支持组织的组成部分，其结构和其他骨骼基本一致，是骨骼中变化最活跃的部分[16]，牙槽骨的吸收是牙周炎病理性变化之一，而破骨细胞是参与骨吸收的主要功能细胞。过去破骨细胞的体外分离和培养存在相当大的困难，因此阻碍了破骨细胞的研究[17]。为了解决破骨细胞培养的问题，研究者们发现一些原代破骨细胞前体细胞，包括骨髓巨噬细胞[18]、脾细胞和外周血单核细胞[19-20]，它们可以在RANKL、巨噬细胞集落刺激因子等信号因子的刺激下融合为多核细胞并最终活化成破骨细胞[21]。然而，由于这些细胞系的特征，不同细胞研究准备之间的可用性和反应模式的差异给这些原代细胞的使用带来了困难[22]。因此，此次研究采用成熟的破骨细胞前体细胞RAW264.7。

MASHALKAR等 [23]研究表明绝经后妇女牙槽骨丢失的严重程度可能是全身性骨质流失的一个早期危险指标，因此牙周炎早期的发现可以有助于预防骨质疏松的发生。目前中药治疗牙周炎的临床应用越来越广泛，紫草素是存在于紫草中的一种萘醌类化合物，但对其治疗牙周炎机制的研究较少。因此为初步探索其防治牙周炎的相关机制，此次研究将紫草素倍比稀释成不同浓度作用于RAW264.7细胞，结果显示0.5 μmol/L以下的紫草素对RAW264.7细胞是安全的。抗酒石酸酸性磷酸酶被称为破骨细胞表型标记物，抗酒石酸酸性磷酸酶染色是用于检测破骨细胞生成的标准方法[24]，此次研究通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞数目以及抗酒石酸酸性磷酸酶活性检测发现紫草素呈浓度依赖性降低RANKL诱导的破骨细胞生成，证明紫草素可抑制RANKL诱导的破骨细胞生成。但从染色中可发现高浓度药物处理组细胞数量明显减少，提示结果并非通过抑制破骨细胞分化，而是通过诱导细胞凋亡发挥作用，后续需通过细胞凋亡实验进一步证明。

基质金属蛋白酶是锌依赖性内肽酶家族，基质金属蛋白酶9与骨骼发育、重塑和修复以及细胞外基质的降解有关，其通过切割组蛋白H3N末端尾部在破骨细胞基因的活性转录中发挥关键作用刺激骨吸收[25]。组织蛋白酶K是破骨细胞上的标志性表达，在激活的破骨细胞中高水平的活化酶极化细胞皱褶缘，溶酶体囊泡与细胞膜皱褶缘融合，组织蛋白酶K被释放到细胞外[26]。因此为进一步探讨紫草素抑制破骨细胞生成的机制，此次研究通过实时定量PCR技术检测结果显示紫草素呈剂量依懒性的抑制了必需的转录因子基质金属蛋白酶9、组织蛋白酶K的mRNA表达水平。此外，RANK是表达在破骨细胞及其前体细胞上的RANKL受体[27]，RANKL只有与其结合后才能够诱导破骨细胞的生成，实验通过实时定量PCR技术检测得出紫草素可以抑制RANK mRNA的表达水平，这提示其抑制破骨生成可能和减少了RANKL与RANK的结合有关。c-Fos是一种已建立的参与破骨细胞分化的必需转录因子，由RANK-RANKL相互作用传递信号诱导的c-Fos可以直接激活活化T细胞核因子的表达[28]。而活化T细胞核因子是在调节许多破骨细胞特异性基因，例如组织蛋白酶K和基质金属蛋白酶9等基因的表达中起关键作用的下游核转录因子[29]。因此，阻断c-Fos/NFATC1信号通路及其标志性表达，对抑制RANKL诱导破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化、减少破骨细胞生成有重要意义。结合实时定量PCR结果推断，紫草素也可能是通过抑制RANK、活化T细胞核因子和 c-Fos 的表达进而抑制破骨细胞的生成。

综上所述，紫草素通过抑制破骨细胞标志性基因基质金属蛋白酶9、RANK、组织蛋白酶K、活化T细胞核因子和c-Fos mRNA的表达，来抑制体外RANKL诱导的破骨细胞生成，从而对牙周炎牙槽骨的吸收显出潜在的治疗作用，但仍需与后期动物实验相互验证，为牙周炎的防治提供有力的理论依据。破骨细胞的生物活性受到一系列信号通路的调控[30]，但是若想证明紫草素是通过这一系列的信号通路抑制破骨细胞的生成仍需进一步的蛋白质免疫印迹技术检测相关因子蛋白水平表达的证实。前期课题组研究发现紫草粗提物对6种主要致龋细菌的生长代谢及致龋的毒力因子均有显著的抑制作用[31]，证明了紫草素有着抑菌的作用。而牙周炎的主要致病因素为细菌，因此紫草素是否能够通过抑制其相关致病菌的脂多糖进而防治牙周炎的发生发展还需进一步研究探讨。
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文题释义：
牙周炎：是一种常见的多因素感染性疾病，可导致牙周支持组织的破坏，是造成成年人失牙的首要原因，严重影响患者的生活质量。目前临床上治疗牙周炎的方法主要是机械性清除菌斑、牙石并控制其他局部刺激因素，并应用药物作为机械性治疗的辅助治疗控制炎症、阻断牙槽骨吸收及促进骨再生。
紫草素：为紫色片状结晶或结晶性粉末，不溶于水，溶于乙醇、有机溶剂和植物油，易溶于碱水，遇酸又沉淀析出的性质，是存在于紫草中的一种萘醌类化合物，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用。

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天然中草药具有毒副作用小，生产成本低和可长期服用等优点，近年来逐渐成为防治牙周炎的研究热点。紫草素具有明显的抗炎、抗真菌和抗肿瘤等作用，以及低细胞毒性，成本低和可长期服用等优点。近年来已有中医将其应用于牙周炎的防治。

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