王朝元等[16]研究显示22.05，44.09 μmol/L(约7.8，15.6 mg/L)的绿原酸对MC3T3-E1细胞的增殖具有一定的促进作用，再结合此次实验结果，在10 mg/L质量浓度的基础上增加了20 mg/L质量浓度。
2.1.2   绿原酸促进MC3T3-E1细胞向成骨分化和成骨细胞矿化   碱性磷酸酶染色观察结果显示，10 mg/L的绿原酸增强了MC3T3-E1细胞的成骨分化能力，当其质量浓度升至20 mg/L时，MC3T3-E1细胞的成骨分化能力更为显著；碱性磷酸酶活性检测结果显示，在诱导成骨分化成功的基础上加入10 mg/L的绿原酸，MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性出现了显著上升，当绿原酸质量浓度增加至20 mg/L，MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活力随之上升，见图2A、B。

茜素红染色结果显示，随着绿原酸质量浓度的增加，MC3T3-E1细胞的钙沉积和钙结节生成能力升高，见图2C、D。



2.1.3   绿原酸促进MC3T3-E1细胞成骨相关基因表达   定量qPCR检测结果显示，与对照组比较，成骨诱导组SMAD4、骨形态发生蛋白2、RUNX2、碱性磷酸酶的基因表达量分别增加至(3.92±0.58)，(1.48±0.55)，(7.11±0.95)，(1.74±1.80)倍，低浓度绿原酸组分别增加至(4.50±1.04)，(1.95±0.20)，(8.35±1.06)，(2.33±0.21)倍，高浓度绿原酸组分别增加至(10.26±0.29)，(3.18±0.02)，(13.41±0.59)，(3.00±0.42)倍，同时绿原酸对成骨相关的其他基因骨桥素和骨钙素的表达也起到了一定的促进作用，见图3。



2.1.4   绿原酸通过BMP-2/SMAD/RUNX2信号通路促进成骨分化   Western blot检测结果显示，与对照组和成骨诱导组相比，低、高浓度绿原酸组骨形态发生蛋白2、RUNX2和SMAD4的蛋白表达增加，经ImageJ定量分析其相关表达量，蛋白增加有显著性意义(P < 0.05)，见图4。



2.2   体内实验结果   
2.2.1   实验动物数量分析   32只小鼠全部进入结果分析。
2.2.2   各组小鼠骨组织Micro-CT二维及三维分析   Micro-CT扫描结果显示，去卵巢组小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度及数量均低于假手术组(P < 0.05)，骨小梁分离度高于假手术组(P < 0.05)；经过不同剂量的绿原酸干预后，去卵巢小鼠的上述指标均有所改善，其中低、高剂量绿原酸组骨密度值是去卵巢组的(1.20±0.12)，(1.39±0.18)倍，上述指标以高剂量绿原酸组改善效果有显著性意义(P < 0.05)，见图5。



2.2.3   各组小鼠骨组织形态学观察   苏木精-伊红染色结果显示，去卵巢组小鼠骨量少于假手术组，经过绿原酸干预后骨量增加，见图5。进一步证实了绿原酸对去卵巢小鼠的骨丢失有一定的预防作用。

骨质疏松是由于破骨细胞的骨吸收能力增强、成骨细胞的骨形成能力减弱，骨吸收超过骨形成导致骨质流失严重，以骨密度下降和骨微结构破坏为特征，容易引发脆性骨折、骨缺损等并发症[1-3]。随着社会人口老龄化加剧，骨质疏松症患者数量逐年递增[4]，严重影响患者的生活质量，增加社会的医疗负担，已成为中国乃至全球的主要公共健康问题。因此，深入研究骨质疏松发生发展的细胞与分子机制，探索有效的干预策略，具有重要的科学意义和社会价值。

目前，治疗骨质疏松症的药物主要有两大类[5]：抗吸收药物和合成代谢类药物[6]。抗吸收药物如双膦酸盐、狄诺塞麦[7]，虽然在短期内均可抑制骨吸收、降低骨折风险，但长期使用也会抑制骨形成，停药后骨吸收反弹，导致更严重的骨质疏松；此外，该类药物还存在着胃肠道不良反应、食管及胃刺激、低钙血症、肾脏毒性等[8]。合成代谢药物如特立帕肽在促进骨形成的同时也会激活破骨细胞，导致骨微结构破坏[9]。由此可见，现今迫切需要发展长期有效、且无不良反应的新型骨质疏松治疗药物，以降低骨折发生的风险，改善患者的生存质量。

近年来研究发现，一些食物和中药含有很多能够调控骨代谢平衡的有效成分，如植物中含有的多酚类物质具有抗氧化和清除自由基的能力[10]，通过调控氧化应激途径抑制骨吸收，从而缓解骨丢失；伞形蜈蚣草中标志性成分獐牙菜苷可通过上调骨形态发生蛋白2和RUNX2介导的分子促进成骨细胞分化与矿化[11]。因此，通过食疗提高骨质疏松患者的骨量、降低骨折发生的风险，具有很好的有效性和安全性，可能成为治疗骨质疏松的一种新兴策略。

绿原酸是干李子中含量最丰富的多酚类物质，具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤的生物学活性[12]。研究发现绿原酸可以抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移，从而降低肿瘤细胞的侵袭性，起到抗肿瘤的作用[13]。近年来，绿原酸作为一种多酚类物质在骨骼保护中的作用引起了广泛关注。绿原酸通过P21waf1/cip1激活Nrf2/HO-1抗氧化信号通路，减少活性氧的生成，从而抑制成骨细胞的凋亡[14]；同时绿原酸还可以通过激活Shp2/PI3K/Akt/Cyclin D1信号通路，促进成骨前体细胞的增殖以及骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[15]，显著提高骨质疏松个体的骨量。因此，绿原酸有望可作为食源性药物应用于骨质疏松的治疗中。

此次实验分析绿原酸对成骨前体细胞分化与矿化的调控效应和机制，为骨质疏松治疗提供新的策略和思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   体外细胞学实验，随机对照动物实验，组间比较采用配对t检验与ANOVA单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年2月至2021年5月在苏州大学骨科研究所完成。
1.3   材料
1.3.1   实验细胞   体外实验使用的MC3T3-E1细胞，由苏州大学骨科研究所提供，使用α-MEM完全培养基进行传代培养，细胞融合至90%左右加入0.25%胰酶消化液传至下一代，按照1传3的比例进行传代，约3 d传一代。
1.3.2   实验试剂与仪器   绿原酸、高氯酸、抗坏血酸Vc、β-甘油磷酸钠、地塞米松(Sigma，美国)；α-MEM 培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(东岭，中国)；青霉素-链霉素双抗(Gibco，美国)；PBS(索莱宝，中国)；鼠β-Actin单克隆抗体(AA123)、碱性磷酸酶染色试剂盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、快速封闭液(碧云天，中国)；反转录试剂盒(ABM生物，中国)；茜素红染色试剂盒(Cyagen，美国)；40 g/L多聚甲醛(Bioshap，中国)；CCK-8(日本，Dojindo)；荧光定量PCR试剂盒(SYBR Green Master Mix)(伯乐，美国)；TRIzol RNA分离试剂(Invitrogen，美国)；抗骨形态发生蛋白2、SMAD4、RUNX2(ab284387，ab40759，ab236639，Abcam，美国)；山羊抗小鼠 /山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab6789，ab97051，Abcam，美国)。
1.3.3   实验动物   选用雌性C57BL/6小鼠，6-8 周龄，体质量约18 g，由苏州大学动物中心统一订购，相关实验操作遵循实验动物管理规定并通过苏州大学伦理委员会审批，伦理审批号：ECSU-2019000143。c57BL/6雌性小鼠饲养于苏州大学SPF级动物房，恒温20-25 ℃，湿度40%-70%，光照时间12 h明12 h暗；许可证号：SYXK(苏)2021-0065。
1.4   实验方法   
1.4.1   体外实验

绿原酸对MC3T3-E1细胞增殖的影响：将MC3T3-E1细胞以2×103/孔的密度种于96孔板中，加入含不同质量浓度梯度[0(对照)，0.1，1，10，100 mg/L]绿原酸的α-MEM完全培养基(含有体积分数10%胎牛血清)培养。培养1，3，5，7 d后，用PBS洗涤细胞，然后在孔中加入含有10%的CCK-8溶液的100 μL α-MEM完全培养基；孵育2 h后，在450 nm波长下测量吸光度值，统计分析检测细胞在不同时间点的增殖能力。

绿原酸对MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化的影响：①碱性磷酸酶染色：将MC3T3-E1细胞以2×103/孔的密度种于96孔板中，分4组培养，对照组加入α-MEM完全培养基，成骨诱导组加入成骨诱导培养基(α-MEM、体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素、0.2 mmol/L抗坏血酸、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠)，低、高浓度绿原酸组分别加入含10，20 mg/L绿原酸的成骨诱导培养基。培养7 d后进行碱性磷酸酶染色，40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，以PBS洗涤细胞，根据说明书加入按比例配置好的碱性磷酸酶染色工作液孵育10-15 min，弃去染色液，倒置显微镜下观察和拍照。②碱性磷酸酶活性检测：培养7 d后，收集各组细胞，加入RIPA裂解液，使用BCA蛋白测定试剂盒测量蛋白浓度，将每组蛋白浓度调至一致后，按照碱性磷酸酶定量试剂盒的说明书进行碱性磷酸酶定量检测和分析。

绿原酸对成骨细胞矿化的影响：分组同上。细胞培养21 d后，40 g/L多聚甲醛固定细胞，以PBS洗涤细胞3遍，加入0.1%的茜素红溶液(pH=4.3)染色30 min，弃去染液，显微镜下观察和拍照；随后，在细胞中加入5%高氯酸溶解钙结节，用酶标仪在420 nm波长下测定吸光度值。

绿原酸对成骨细胞成骨相关基因表达的影响：分组同上。细胞培养7 d后，使用RIPA裂解液裂解细胞，利用TRIzol试剂盒提取细胞的总RNA并测定浓度；随后，按照反转录试剂盒说明书将mRNA反转录为cDNA；稀释后作为底物模板，加入不同基因的引物，引物序列见表1，根据荧光定量PCR试剂盒说明书配置体系后，上机检测。以GAPDH为内参将数据标准化，然后使用2-ΔΔCt法计算。

绿原酸调控成骨细胞分化的机制研究：采用Western Blot法检测骨形态发生蛋白2、SMAD4、RUNX2蛋白表达。分组同上。细胞培养7 d后，消化收集细胞，提取总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；等量的总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后使用恒流将条带转移到硝化纤维膜上。根据指示蛋白marker将膜裁剪至合适大小，使用封闭液封闭后，加入一抗4 ℃孵育过夜，一抗分别为骨形态发生蛋白2(1∶1 000)、SMAD4(1∶5 000)、RUNX2(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000))，洗涤后骨形态发生蛋白2、SMAD4、RUNX2用HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶20 000稀释)进行标记，β-actin与HRP山羊抗小鼠二抗(1∶10 000)进行标记，室温孵育1 h。最后，用化学发光法加入底物进行条带曝光。用Image lab软件对曝光后条带进行分析定量。 
1.4.2   体内实验   适应性饲养后，采用随机数字表法将32只C57BL/6小鼠分成4组，分别为假手术组、去卵巢组及低、高剂量绿原酸组，每组8只。在严格的无菌条件下，备皮后行小鼠腹部正中切口，找到双侧输卵管，结扎其下面的血管丛以防止出血而影响手术视野，然后找到形状似菜花状的卵巢，切除，假手术组小鼠仅开腹并未去除或结扎卵巢，缝合腹膜肌肉及皮肤。造模后，低、高剂量绿原酸组腹腔注射25，50 mg/(kg·d)的绿原酸，假手术组、去卵巢组腹腔注射PBS 100 µL/d，连续给药8周。给药8周后，采用瑞沃德动物麻醉机(异氟烷吸入式麻醉，异氟烷浓度4%，氧气流量
0.2 L/min)麻醉处死小鼠，取股骨与胫骨，进行如下检测。

Micro-CT检测分析：采用的Mirco-CT仪器为苏州大学骨科研究所持有的SkyScan 1176型扫描器(Bruker-MicroCT，Kontich，Belgium)，扫描具体过程如下：将小鼠的股骨与胫骨分别竖直平放于泡沫槽内，股骨尽量剔除多余软组织，扫描范围包括整个股骨远端和胫骨近端。扫描使用参数为：分辨率9 μm，电压50 kV，电流200 μA，5 mm Al过滤器。扫描之后的图像经过计算机配套软件(NRecon、NReconServer)重建和(Dateview、CTan)分析，通过重建旋转确定股骨远端生长板位置，分析时选取股骨远端股骨生长板上60层(每层约为9 μm)为底层，再往股骨干方向选择150层作为顶层圈定骨小梁区域进行分析得到骨密度及骨小梁参数，使用Minics进行3D重建直观展示各组的骨量差异。

骨组织形态学分析：将小鼠股骨经脱钙处理，使用乙醇进行梯度脱水，使用石蜡包埋后，石蜡切片机(徕卡，德国)进行骨组织切片，切片厚度6 μm。对所要染色的切片烤片20 min后，使用二甲苯脱蜡后梯度乙醇复水，苏木精染色后水洗干净，再经过盐酸乙醇分化后，使用伊红染色，染色后分别置于体积分数95%乙醇、无水乙醇脱水，使用二甲苯透明。染色好的标本于通风橱晾干去除化学气味后，使用树脂盖玻片封固，正置显微镜(Zesis，德国)下拍照。
1.5   主要观察指标   绿原酸对MC3T3-E1细胞增殖与成骨分化的作用，以及对去卵巢小鼠的作用。
1.6   统计学分析   采用SPSS 26.0统计软件进行统计学分析。所有数值均以x±s表示。采用配对t检验检测两组间的变量和ANOVA单因素方差分析来确定统计学意义。P < 0.05认为差异有显著性意义。统计学方法已经通过苏州大学附属第一医院生物统计学专家审核。

基于植物来源的药物在骨质疏松治疗中运用广泛[17]。此次实验使用MC3T3-E1细胞来探究绿原酸是否对MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化产生影响，从而促进其成骨分化，对骨质疏松起到治疗意义。

首先，许多研究发现药物浓度对细胞的增殖有很大影响[18]，如果药物浓度过高可能会抑制细胞增殖。研究发现绿原酸在低浓度(10 μmol/L)可促进骨髓间充质干细胞的增殖，但当浓度达到100 μmol/L时会对细胞的增殖产生抑制。因此，实验中通过设置绿原酸质量浓度梯度，探讨绿原酸对MC3T3-E1增殖的影响。结果发现，在10 mg/L质量浓度下，绿原酸对MC3T3-E1细胞的生长具有促进作用，当质量浓度达到100 mg/L时，绿原酸对MC3T3-E1细胞的生长有抑制作用。可以看出，在一定质量浓度范围内，绿原酸促进MC3T3-E1细胞的增殖，这为探索绿原酸在体外对成骨分化的影响提供了药物质量浓度这一先决条件。

骨形成作为骨成长过程中必不可少的一部分[19-20]，绿原酸对于骨形成的影响值得探究。在体外碱性磷酸酶和茜素红染色及定量结果显示，绿原酸促进了MC3T3-E1细胞的成骨分化，根据体外成骨相关基因的qPCR结果显示，绿原酸促进了成骨相关基因的表达。但目前对于绿原酸成骨效应的相关机制研究甚少。

研究报道Shp2/PI3K/Akt/cyclin D1信号通路可抑制绿原酸诱导的骨髓间充质干细胞增殖。BMP-2/SMAD4/RUNX2信号通路为常见的一个成骨信号通路[21]，在骨代谢中起着重要作用。骨形态发生蛋白2主要通过激活SMAD4作用于RUNX2，促进其表达。RUNX2是一类转录因子蛋白的总称，这些蛋白的共同特性是它们的分子结构中都含有相同的由氨基酸组成的DNA结合区，区域内共有128个氨基酸[22]。RUNX2能够促进骨形成的早期分化，其表达直接决定骨形成的强度[23]。根据Western blot及其定量结果显示，绿原酸可以通过上调骨形态发生蛋白2、SMAD4、RUNX2蛋白的表达，从而可能通过BMP-2/SMAD4/RUNX2信号通路促进成骨细胞的成骨分化。

此次实验所得体外结果与ZHOU等[15]在绿原酸促进成骨分化这一结论上相一致，同时体内实验部分绿原酸提高去卵巢小鼠骨量与其结果相一致。ZHOU等的研究发现，绿原酸通过在Shp2/PI3K/Akt进行成骨调控，而此次实验在BMP-2/SMAD4/RUNX2成骨相关通路上进行了相关研究。王朝元等[16]研究发现使用22.05 μmol/L和44.09 μmol/L的绿原酸(约7.8 mg/L和15.6 mg/L)培养MC3T3-E1细胞时会抑制细胞的碱性磷酸酶活力，与此次实验10 mg/L和20 mg/L的绿原酸促进碱性磷酸酶活力并不一致，可能是由于细胞培养时间的不同，此次实验是对培养7 d的细胞进行碱性磷酸酶活力测定，而王朝云等研究是在第2，4，6天进行碱性磷酸酶活力测定，此外，不同的细胞状态可能会导致碱性磷酸酶活性的差异。

骨重塑过程是成骨细胞和破骨细胞相互作用的过程[24]。研究发现，成骨细胞和破骨细胞可以通过不同的激素和蛋白质相互作用[25]，如成骨细胞通过凋亡因子配体/凋亡因子(FasL/Fas)信号通路促进破骨细胞凋亡[26-27]，成熟破骨细胞分泌的C3a(补体系统的一种补体成分3)促进成骨细胞的分化[28]。研究指出，成骨细胞与破骨细胞之间的失衡会导致骨质疏松症[29-31]，因此，平衡破骨细胞和成骨细胞对骨质疏松的治疗至关重要，因此研究绿原酸对于破骨细胞增殖及分化的影响成了下一步研究的关键问题。

结论：体外实验结果表明，第一，一定浓度下的绿原酸可直接促进成骨前体细胞MC3T3-E1的增殖；第二，绿原酸可促进成骨前体细胞MC3T3-E1的骨形成相关基因的表达，并促进其成骨分化；第三，绿原酸可能通过BMP-2/SMAD4/RUNX2信号通路促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。在体内实验中，注射绿原酸后去卵巢小鼠的骨量显著增加，骨小梁参数明显提高，组织形态学分析清楚地表明小鼠的骨量和小梁骨数量得到了明显改善。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
成骨细胞分化：是机体骨量增加中重要的一环，与破骨细胞分化相互制衡，机体的成骨能力较强可防止骨量丢失。研究可通过对特定的成骨细胞系(该文使用MC3T3-E1细胞株)进行成骨诱导，诱导一定时间后对成骨相关基因进行检测，在基因层面确定细胞的成骨作用，并分别在早期及晚期对细胞进行染色(包括碱性磷酸酶染色及茜素红染色)，直观可见成骨效应。
绿原酸：是干李子中含量最丰富的多酚类物质，具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤的生物学活性。研究发现绿原酸可以抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移，从而降低肿瘤细胞的侵袭性，起到抗肿瘤的作用。近年来，绿原酸作为一种多酚类物质在骨骼保护中的作用引起了广泛关注。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨质疏松症一直以来是全球关注的骨代谢相关疾病，骨松后骨折不但影响患者的生活质量，而且给患者带来了沉重的经济负担，因此，对其相关诊疗方法的研究从未停止。近年来，研究发现一些食物和中药含有很多能够调控骨代谢平衡的有效成分，如植物中含有的多酚类物质具有抗氧化和清除自由基的能力，通过调控氧化应激途径抑制骨吸收，从而缓解骨丢失；伞形蜈蚣草中标志性成分獐牙菜苷可通过上调骨形态发生蛋白2和runt相关转录因子2介导的分子促进成骨细胞分化与矿化。因此，通过食疗提高骨质疏松患者的骨量、降低骨折发生的风险，具有很好的有效性和安全性，可能成为治疗骨质疏松的一种新兴策略。此次实验选用来源于植物李子的提取物-绿原酸，通过研究其对成骨前体细胞的成骨作用及相关信号通路BMP-2/SMAD4/RUNX2的影响，从食疗角度为骨质疏松症治疗提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程