进一步生化检测发现造模后实验组大鼠血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶、α-L-岩藻糖苷酶、甲胎蛋白和γ-谷氨酰转肽酶指标异常升高，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2。符合文献造模情况的描述，说明造模成功可进入下一阶段实验。



2.3   加味逍遥散对肝癌并发抑郁症大鼠的肝脏病理形态具有改善作用    与空白对照组相比，模型组大鼠肝脏组织结构破坏严重，肝组织出现坏死空洞病灶，细胞核出现固缩，排列顺序紊乱；经加味逍遥散治疗后，肝组织整体坏死病灶有所改善，异常增生减少，组织学趋于正常，表明加味逍遥散能够改善大鼠病理状况，见图3A-C。



2.4   加味逍遥散改善肝癌并发抑郁症大鼠的抑郁样行为   行为学数据显示经加味逍遥散治疗后大鼠跨格次数、垂直运动次数以及运动总距离明显增多(P < 0.05)，同时强迫水游泳实验中大鼠水中静止时间减少(P < 0.05)，见表1；另外糖水消耗实验发现，进行慢性不可预知温和应激造模后大鼠对糖水偏爱百分比明显降低，但经加味逍遥散治疗后糖水的消耗率上升(P < 0.05)，与行为学结果一致，见图4。表明了加味逍遥散能够有效改善肝癌并发抑郁症大鼠的抑郁样行为表现。







2.5   加味逍遥散治疗肝癌并发抑郁症大鼠的蛋白质组学研究   在蛋白质组学研究中，共鉴定到1 082个蛋白，其中加味逍遥散与模型组相比共145个，有90个上调，55个下调(表2、图5)，上调差异最大4个蛋白分别为黑素转铁蛋白(MFI2)、微管相关蛋白1(MAP1)、人源全长重组蛋白(IGHM)、免疫球蛋白重链1a(IGH-1A)，下调则是血清白蛋白(ALB)、谷胱甘肽s-转移酶(GSTM1)、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K(Serpina3c)、甲胎蛋白(AFP)。在Uniprot数据库中输入idmapping，根据此次鉴定到的蛋白uniprot 编号获得相应蛋白名称及基因名称，下调仅列出前差异最大的前30个蛋白信息，见表3。











2.6   差异蛋白的KOG功能分类、Domain功能域分析及KEGG通路分析   对鉴定出的加味逍遥散与模型组表达差异蛋白进行Unigene与COG数据库比对获得KOG的分类，主要集中在：仅供一般功能预测(General function prediction only)、翻译后修饰，蛋白质周转，伴侣(Posttranslational modification，protein turnover，chaperones)、信号转导机制(Signal transduction mechanisms)，见图6。Domain蛋白功能域主要集中在免疫球蛋白样结构域(Immunoglobulin-like domain)、免疫球蛋白v集结构域(Immunoglobulin V-set domain)、免疫球蛋白样折叠(Immunoglobulin-like fold)，见图7。KEGG信号通路富集分析显示作主要涉及5条通路：酒精中毒(Alcoholism，KEGG PATHWAY: hsa05034)、胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway，KEGG PATHWAY: map04910)、糖解/葡萄糖生成(Glycolysis/glucose production)、叶酸生物合成等通路(Folic acid biosynthesis and other pathways)、光合生物中的碳固定作用(Carbon fixation in photosynthetic organisms)，见图8，仅展示其中2条最相关通路图。











2.7   蛋白质组学研究与网络药理学分析重合靶点   将加味逍遥散组的网络药理学与蛋白质组学中鉴定出的差异蛋白取交集，发现在有3个共同作用靶点，为GSTM1、PDK1、HSP90AB1，见表4，图9。在Cytoscape软件绘制“中药-化合物-靶点”的可视化网络，见图10。全方中发挥调节这些靶点的药物为甘草[灵芝酸G、Licochalcone-G；甘草香豆素、3-(2,4-dihydroxyphenyl)-8-(1,1-dimethylprop-2-enyl)-7-hydroxy-5-methoxy-coumarin；甘草查尔酮A、Licochalcone A；丙三醇、Glycyrol；半甘草异黄酮B、Semilicoisoflavone B；鳞叶甘草素B、Glepidotin B；甘草利酮、Licoricone；甘草宁、5,7-dihydroxy-3-(4-methoxyphenyl)-8-(3-methylbut-2-enyl)chromone；甘草异黄酮B、Licoisoflavone B；光甘草酮、Glabrone]；丹参(形式不对称合成天然产物、Przewalskin B)；麦芽(雪腐镰刀菌烯醇、Nivalenol)；延胡索(二氢血根碱、Dihydro sanguinarine)。











2.8   蛋白质组学与网络药理学重合靶点的GO分析与KEGG分析   将3个共有蛋白靶点进行GO功能分析发现直接参与神经元凋亡过程的负调控(Negative regulation of neuronal apoptotic process)的生物过程；细胞组分则是分布在细胞内液(cytosol)、细胞质基质(cytoplasm)中；分子功能蛋白激酶结合(protein kinase binding)。参与的通路则是PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)和前列腺癌(Prostate cancer)分子信号通路，见表5。



2.9   对血清重合差异靶点的含量验证   通过酶联免疫吸附法(Elisa)对大鼠血清中的GSTM1、PDK1和HSP90AB1具体含量进行验证。与模型组比较，经加味逍遥散治疗后血清中GSTM1表达上调，差异有显著性意义(P < 0.01)；模型组大鼠血清中PDK1和HSP90AB1的表达经加味逍遥散治疗后同样出现下调趋势。表明加味逍遥散可能通过调节GSTM1、PDK1和HSP90AB1的含量发挥治疗作用，见图11。

肝癌早期发病较为隐匿，大部分患者确诊时已是晚期，错过了最佳手术根治时期，而确诊后的化疗、放疗、介入治疗容易让患者产生焦虑、抑郁情绪，严重危害身心健康[1]。肝癌中晚期患者因受治疗病程长、预后不良、经济压力大、不良反应明显等多方面原因作用下容易并发抑郁症为代表的心理疾病，从而导致患者出现自杀和消积治疗等行为，由此可见对肝癌并发抑郁症患者产生最大威胁的来源就是生理与心理的不健康状态[2]。

加味逍遥散来自宋代的《太平惠民和剂局方》，具有健脾养血、疏肝解郁的功效，此次研究加味逍遥散则是在原方中进行加减，全方组成为：柴胡、当归、赤芍、白芍、党参、炒白术、生甘草、丹参、炒麦芽、炒谷芽、延胡索、丹皮、茯苓、薏苡仁、栀子、炒枳实、陈皮共17味药，具有疏肝健脾、行气活血、化痰解毒、利湿止痛之功。中医藏象理论指出肝癌和抑郁的病位均在肝，分别归属于“肝积”与“肝郁”，常常相互影响，多见共同发病[3]。加味逍遥散治疗肝癌并发抑郁证旨在疏理肝气而调畅一身气机，使得气机升降有序，开阖得利；调理气血以求全身血气疏注畅达，得以消积化瘀；解毒止痛，舒缓癌病因气血瘀滞产生疼痛不适的症状，恢复身心畅达的生理状态。

网络药理学是一门基于系统生物学理论体系，常常以中医基础理论为指导，囊括药效物质的活性成分、靶点及通路等信息，符合“中药-成分-靶点”研究多层面分析的目的[4]。同时蛋白质组学也可用于研究疾病发生、发展及药物干预的靶点蛋白变化，与中医辨证论治、中药复方多靶点调节的方式相吻合，能够全面、系统地反映体内蛋白的表达情况，寻找具有潜力的物质基础为丰富生物学机制研究及临床应用提供参考[5-6]。此次研究在此基础上，借助网络药理学与蛋白质组学的技术全面而整体地阐述加味逍遥散治疗效应机制的发挥，为临床治疗和药物的研发提供重要理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   利用雄性SD大鼠构建肝癌并发抑郁大鼠模型进行相关动物实验。
1.2   时间及地点   实验于2020年10月至2021年6月在广西中医药大学科学实验中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   SPF级SD大鼠36只，雄性，体质量150-180 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-004；饲养条件良好，自由摄食与饮水，6只大鼠为一笼，12 h的光/暗循环。
实验方案于2020年11月通过广西中医药大学伦理委员会的动物实验伦理审查，动物伦理证明编号：DW20201104-101。实验动物在戊巴比妥钠麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   二乙基亚硝胺(DEN)的准备   二乙基亚硝胺纯度0.95 g/mL(批号：N84760-5，上海Macklin公司)，0.4 mL二乙基亚硝胺加入100 mL生理盐水中，配成质量浓度为4 g/L的溶液，4 ℃冰箱避光保存。
1.3.3   行为学设备   BW-OF302旷场实验视频分析系统，Bw-dfs201强迫游泳实验系统，上海软隆科技发展有限公司。
1.3.4   苏木精-伊红染色相关试剂和相关设备   苏木素、伊红、中性树脂、40 g/L多聚甲醛(Bioswamp公司)；甲醛、无水乙醇、二甲苯、体积分数3%H2O2(国药集团化学试剂有限公司)；BX43型显微镜(日本Olympus公司)。
1.3.5   大鼠肝功能及分析甲胎蛋白生化指标检测及相关设备   α-L-岩藻糖苷酶试剂盒(AFU)(货号：E008、南京建成公司)；γ-谷氨酰转移酶试剂盒(GGT)(货号：C017-1、南京建成公司)；RAT甲胎蛋白试剂盒(货号：RA21311、Bioswamp公司)；其余指标检测采用c16000型全自动生化分析仪(美国Abbott公司)。
1.3.6   加味逍遥散制备   加味逍遥散药物组成：柴胡10 g、当归10 g、赤芍15 g、白芍15 g、党参10 g、炒白术10 g、生甘草6 g、丹参20 g、炒麦芽10 g、炒谷芽10 g、延胡索15 g、丹皮10g、茯苓15 g、薏苡仁15 g、栀子6 g、炒积实15 g、陈皮15 g，均购自广西中医药大学第一附属医院门诊部，经中药教研室鉴定，符合药物质量标准。按照以上药量配比混合，加入8倍生药量的体积分数85%乙醇，加热回流提取2次，每次提取1 h，真空泵抽滤，合并2次滤液，质量浓度3.55 g/mL定容备用(按生药量计算)。
1.3.7   蛋白质组学相关仪器   ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit (Sigma公司)；Waters HPLC e2695/2998色谱仪、Strata X SPE脱盐柱(phenomenex公司)；高pH C18 RP色谱柱Bridge Peptide BEH C18, 130A 3.5 μm 4.6*250 mm(Waters公司)；台式冷冻真空浓缩仪Concentrator Plus 5305(Eppendorf公司)；Thermo nanoLC 1000纳升级高效液相色谱系统、Acclaim PepMap® 100 C18, 3 μm, 100 Å(75μm×2 cm)上样柱、Acclaim PepMap® RSLC C18, 2 μm, 100 Å(50μm×15 cm)分析柱、搜库软件为Proteome Discoverer 1.3(Thermo Scientific公司)。
1.3.8   Elisa检测血清中标志物含量   96T GSTM1、PDK1 Elisa试剂盒(货号：RA21680、RA22503 Bioswamp公司)；HSP90AB1 Elisa试剂盒(货号：XY-HSP90αB1-Ra 上海信裕生物科技有限公司)；AMR-100酶标分析仪、APW-200酶标洗板机(杭州奥盛仪器有限公司)；TG16W微量高速离心机(国产)；GNP-9080隔水式恒温培养箱(国产)。
1.4   实验方法   
1.4.1   实验动物模型建立与干预   36只大鼠分为空白对照组、模型组、加味逍遥散组，适应性喂养1周后以4 g/L的二乙基亚硝胺，按照25 mg/kg剂量对模型组与加味逍遥散组大鼠腹腔注射进行肝癌造模[7-8]，3次/周，连续给药12周，空白对照组进行等量生理盐水腹腔注射。第7周模型组与治疗组进行慢性不可预知温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)造模[9]，通过24 h禁水、24 h禁食、24 h强光刺激、4 ℃冰水游泳5 min、夹尾5 min、潮湿垫料24 h、悬尾5 min交替刺激共8周。第16周起对加味逍遥散组大鼠以6.0 mL/kg剂量灌服加味逍遥散悬液，1次/d，空白组、模型组大鼠同步灌胃等量生理盐水，为期4周。整个实验周期为20周结束。

1.4.2   行为学检测及糖水实验   行为学检测与糖水实验共检测5次[11]，分别为第1，7，11，20周前一天及第15周后一天进行检测。行为学实验采用常用而客观的旷场实验(Open-field法)[12]、强迫水游泳实验(Forced Swimming Test)[13]。①旷场实验观察并记录5 min内大鼠的活动情况，分别记录大鼠开放区域总动态距离(Distance)、大鼠跨格次数(Crossing)，反映动物的活动度；两爪腾空站立为垂直运动(Rearing)次数，反映动物对新鲜环境的好奇程度。记录水平运动次数及垂直运动次数，每只大鼠测定1次，每次测定时间为5 min。②强迫水游泳是一种行为绝望实验法，将大鼠置于水中，观察其“不动状态”，记录产生绝望的不动状态中的参数，可以用来评价致抑郁剂和抗抑郁剂的作用效果。

适应喂养期间对大鼠进行含糖饮水训练，将2瓶1%蔗糖水水瓶放置每一笼，24 h后更换一瓶纯净水，再24 h后交换2瓶位置。每次实验前24 h禁水，水瓶放置前后称质量，放置水平观察1 h内大鼠饮水情况，计算糖水消耗率=每只大鼠糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。
1.4.3   大鼠分离血清及取材   实验第20周后禁食12 h取材。1%戊巴比妥钠0.04 mL/kg麻醉后用5 mL真空采血管取血，静置2 h后4 ℃，3 000 r/min离心10 min，将血清分装入1.5 mL EP管，-20 ℃冰箱保存待用。
1.4.4   大鼠甲胎蛋白及肝功能检测   检测前将血清从冰箱取出室温解冻，用超纯水将血清稀释一倍后备用，并将试剂盒拿出平衡至室温；肝功能自动分析仪检测大鼠血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶水平；采用可见分光光度检测大鼠血清中α-L-岩藻糖苷酶、甲胎蛋白和γ-谷氨酰转肽酶，具体操作见试剂盒说明书。
1.4.5   苏木精-伊红染色法检测大鼠肝脏病理变化   将含瘤肝组织切成0.5 cm×0.5 cm大小，40 g/L多聚甲醛先进行固定，后取出肝脏，30%蔗糖脱水，石蜡包埋后切片，厚度为30 μm，60 ℃烘箱放置30 min-1 h，后置于二甲苯Ⅰ和Ⅱ中分别浸泡30 min、15 min，将无水乙醇与二甲苯等量混合后将切片放置浸泡3 min，逐级浸泡无水乙醇Ⅰ、Ⅱ，体积分数80%乙醇、蒸馏水、PBS各5 min。随后放入苏木精浸泡5 min，蒸馏水冲洗去除染料，再浸泡伊红1 min，蒸馏水冲洗30 s，依次体积分数95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各浸泡1 min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ，二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡各浸泡3 min中，滴加中性树脂封固，镜下观察。
1.4.6   蛋白浓度测定与酶解   用ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit对血清样品进行高丰度蛋白去除；加入适量Resolution Buffer(含8 mol/L Urea，100 mmol/L TEAB，1% protease PMSF)，12 000 r/min，4 ℃离心5 min，去除不溶性杂质。蛋白浓度采用Bradford法测定，设置标准品浓度后，绘制y+315.86x-19.384 R2=0.999 2的标准曲线。根据定量结果取100 μg样品，8 mol/L Urea buffer调整等体积调平；加入终浓度10 mmol/L DTT于37 ℃孵育45 min，还原蛋白二硫键；再加入终浓度25 mmol/L IAM室温孵育55 min，烷化保护巯基基团；用100 mmol/L TEAB稀释至Urea浓度低于2 mol/L后进行酶解；根据质量比1︰50加入trypsine，37 ℃酶解过夜；根据质量比按1︰100加入trypsine，37 ℃二次酶解4 h。
1.4.7   肽段标记与组分分离   Strata X SPE(phenomenex)脱盐柱除盐后真空干燥后-20 ℃保存；500 mmol/L TEAB复溶除盐后的肽段，40 μL异丙醇复溶0.8 mg iTRAQ试剂并与100 µg肽段合并后室温反应2 h后混匀上机样品干燥后标记。HPLC组分分离肽段进行馏分分离。A液为2%乙腈，pH=10；B液为98%乙腈，pH=10；液相流速设置0.7 mL/min；液相梯度：0-5 min，0% B；5-55 min，0-30% B；55-67 min，30%-100% B；67-75 min，100% B；75-78 min，100%-0% B；78-88 min，100% A。检测波长为214 nm；收集60个肽段流出组分，真空抽干后再进行合并成15个组分质谱鉴定。
1.4.8   肽段质谱鉴定   通过Proteome Discoverer 1.3(Thermo Scientific)软件将Orbitrap Elite对肽段鉴定的原始图谱文件(.raw文件)提交至SEQUEST软件进行数据库检索，获得高度可信的定性结果。配置好的该物种数据库与该项目的定量方法后，按照如下参数配置搜库：Enzyme: Typsin/P；Missed Cleavages: 2；Fixed Modification: Caramidomethyl (C)；Variable Modifications：Acetyl(N-term)，Oxidation(M)，iTRAQ(K，Y)，iTRAQ(N-term)；Peptide Tolerance：20 ppm；MS/MS Tolerance：0.05 Da；Use Target-Decoy，Peptide FDR < 0.01。使用Proteome Discoverer 1.3(Thermo Scientific)中的Sequest软件集成，使用20 ppm的肽质量耐受性和产品离子耐受性进行搜索，从UniProt数据库下载的Rattus Novegicus蛋白质组数据库，为分别统计每个KOG分类下的差异蛋白数目将其进行分类。
1.4.9   加味逍遥散治疗肝癌并发抑郁症的网络药理学分析   使用中药系统药理学分析平台TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，分别检索加味逍遥散中17味中药的化学成分。以口服药物浓度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18，筛选出加味逍遥散中的383个活性成分，去除重复后得到332个有效化学成分。通过SwissTargetPrediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)，利用化学成分的“Canonical SMILES”格式，预测有效化学成分对应的作用靶点，取前10位靶点通过Cytoscape 3.4.0软件(http://www.cytoscape.org/)构建化合物-靶点网络。通过OMIM(https://omim.org/)、DiGSeE(http://www.disgenet.org/search)2个疾病靶点数据库，以关键词“Hepatocellular carcinoma”和“Depression”分别进行检索，收集肝癌和抑郁症相关的疾病靶点基因。对加味逍遥散化学成分靶点与肝癌和抑郁相关靶点进行Venn分析，获得188个潜在作用靶点。再将网络药理学预测的188个蛋白靶点与蛋白质组学获得的145个靶点做交集，将实验重合的3个作用靶点对应的“中药-化合物-靶点”信息导入Cytoscape软件进行可视化及网络拓扑学分析，构建蛋白互作网络。
1.4.10   有效蛋白靶点的基因本体论(Gene Ontology，GO)富集分析与京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析   将获得的3个有效作用靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，说明有效蛋白的功能富集情况。将蛋白输入DAVID数据库(https://david-d.ncifcrf.gov/)进行GO富集分析。利用KEGG数据库，将蛋白按照参与的pathway通路或行使的功能分类，对KEGG pathway进行富集分析，研究蛋白发挥的具体功能与参与的通路过程。
1.4.11   Elisa检测血清中的差异表达含量   将置于-20 ℃血清融化后保持2-8 ℃检测谷胱甘肽S转移酶μ重组蛋白(glutathione transferase，GSTM1)、3磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide dependent protein kinase1，PDK1 or PDPK1)、热休克蛋白90AB1(heat shock protein HSP 90-beta，HSP90AB1)表达，在酶标包被板上设标准品孔、空白孔、样本孔，样本孔中先加样品40 μL，然后再加生物素标记的抗体10 μL。除空白孔外，每孔加入酶标试剂50 μL，37 ℃温育30 min。孵育完后进行洗涤5次，拍干，每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色10 min。最后每孔加终止液50 μL，终止反应；酶标仪设置450 nm波长检测各孔的吸光度值。 
1.5   主要观察指标   观察加味逍遥散治疗肝癌并发抑郁症大鼠的肝脏组织病理形态及抑郁样行为的改变情况，同时检测中药对治疗后显著差异蛋白靶点的影响，检测其表达含量，以此说明加味逍遥散治疗肝癌并发抑郁症的有效作用。①苏木精-伊红染色观察大鼠肝脏组织病理形态改变；②大鼠抑郁样相关行为学检测及糖水实验；③血清差异表达蛋白；④GO功能富集分析；⑤KEGG(http://www.kegg.jp/)信号通路分析；⑥STRING数据库(http://string-db.org/)蛋白质相互作用网络分析(PPI)。
1.6   统计学分析   采用SPSS 21.0统计软件分析实验数据。造模后两组间对比采用t检验，结果以x±s表示；其余检测组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，均以P < 0.05为差异有显著性意义。蛋白质组学采用方差分析(ANOVA)，必要时进行Tukey的事后分析，显著性设置为P < 0.05。文章统计学方法已经广西中医药大学生物统计学专家审核。

肝癌在中医学中属“肝积”“癥瘕积聚”等范畴，其病因病机大多与外感邪气，内伤饮食、脾胃虚损，或七情内伤、肝气郁结，气血运行不畅致瘀毒气滞、痰气湿浊相互交结而为积[14]。而抑郁症则是因肝失疏泄，气血不调而为郁，同时可涉及心、脾、肾。肝郁日久伤血、肝郁犯脾、脾失健运，使气血生化乏源，不利于肝癌的康复与治疗[15]。最早在《黄帝内经》中也提出木郁达之是肝气郁结的基本治则，临床上用于疏肝类的方剂较多，如小柴胡汤、柴胡疏肝散、越鞠丸等，都具有抗抑郁与治疗肝癌的作用[16-20]。国内外研究对于加味逍遥散治疗肝癌并发抑郁症的临床与基础研究较为罕见，因此有必要进一步对其有效成分进行挖掘，寻找肝癌并发抑郁症的核心作用靶点及可能涉及的通路，从整体的角度反映加味逍遥散的疗效机制。  

前期研究发现加味逍遥散可以改善肝癌组织病理恶性程度，减轻肝癌合并抑郁大鼠的抑郁样行为，同时显著增加大鼠脑内多巴胺和5-羟色胺的含量。此次实验在此基础上，借助网络药理学技术结合蛋白质组学技术发现了有效化合物及可能发挥治疗作用的具体靶点：GSTM1、PDK1、HSP90AB1。

谷胱甘肽硫转移酶M1编码蛋白GSTM1属于谷胱甘肽转硫酶的基因表型，存在于机体的血液、脑脊液等多种组织中，既往的研究结果对GSTM1对肝癌的影响结果具有多差异性[21-22]，2001年荷兰TIEMERSMA等[23]提到 GSTM1和肝癌的发生没有相关性，同时吴一迁等[22]也获得了一致的结论，而杨志国等[24]认为仅表达GSTM1或GSTT1时可导致肝癌发生风险性升高1.36倍及1.70倍，彭宁等[25]再进一步验证中发现GSTM1和GSTT1不能在肝脏中表达时，会使相应的解毒酶失活，最终导致肝癌形成；另一方面GSTM1在神经系统中也发挥重要作用，比如帕金森症和阿尔茨海默症等[26-27]；在青少年双相情感障碍早期发病中，GSTM1无效基因型降低了发病风险，GSTM1阳性基因型和GSTT1无效基因型与GSTM1和GSTT1阳性基因型的组合则增加了发病风险，同时遗传因素会诱发情绪障碍患者的烟草使用障碍合并症的可能性，情绪障碍相关疾病如抑郁症和烟草使用障碍合并症已被证实与氧化应激和血清素途径相关的GSTM1、GSTT1、STin2、5-羟色胺等特定生物标志物有关，除此之外还有学者认为GSTM1基因可以通过调节谷胱甘肽-S-转移酶的活性，从而通过发挥抗氧化作用调节的情绪障碍疾病的发展[28]。由此可见GSTM1、GSTT1的协同效应在肝癌与抑郁中都具有重要的意义。

转移和复发是导致肝癌高死亡率的主要原因，其中在肝癌中最具差异HOXC10基因，具有通过上调与转移相关的PDK1促进肝癌细胞转移的作用，在肝癌小鼠模型中也发现了Akt-PDK1相互作用能有效抑制肿瘤细胞的生长[29-30]；病情预后的好坏直接影响患者的心理健康，从而产生焦虑或者抑郁的情绪，焦虑障碍和抑郁症可以通过脑源性神经营养因子逆转，同时脑源性神经营养因子信号传导涉及PI3K/PDK1，在亚变形PDK1(hm)小鼠中发现，PI3K信号传导减弱会降低与大脑中的GABA和5-羟色胺的浓度，因此可以作为诊断抑郁症发生的分子底物[31]；mTOR是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶，是PDK1下游的交汇点，mTOR的激活可以增加突触蛋白合成，增强突触功能从而发挥快速抗抑郁作用[32-33]。

热休克蛋白90(HSP90AB1)目前被认为是致癌基因成瘾和癌细胞存活的关键促进剂，通常是通过甲基化促进癌细胞的增殖，在肺癌、乳腺癌、肝细胞癌中均有过度表达，影响肿瘤的形成、发展及肿瘤耐药[34-37]。最新研究结果表明HSP90AB1基因在肝细胞癌组织及肝癌细胞系中均中呈高表达，根据GEPIA数据库分析显示HSP90AB1高表达的肝癌患者预后较差[38]。在精神疾病抑郁症患者和抑郁样慢性不可预测压力小鼠模型的外周血中，circDYM水平均显著降低，而circDYM表达的恢复可显著增加HSP90的泛素化，降低抑郁的发生，而在对大鼠进行慢性可变应激造模14 d后海马胞质中HSP90水平也明显增加[39-40]。

GO富集分析结果表明加味逍遥散治疗肝癌并发抑郁症的直接作用靶点参与神经元凋亡过程的负调控，众所周知神经元凋亡会破坏神经元间信息传递，损害人类记忆功能，在小鼠体内的神经元损伤更是破坏认知和空间记忆能力，抑郁症患者发病就有明显的记忆损伤和缺失的临床表现[41-42]。KEGG通路分析则是指出与PI3K-Akt信号通路和前列腺癌分子信号通路相关。加味逍遥散治疗肝癌并发抑郁症的最重要的途径就是抑制神经元的凋亡。PI3K是一种细胞内蛋白激酶，与多种人类肿瘤的发生相关，而AKT作为是PI3K下游关键蛋白之一[43]。组蛋白可以通过线粒体功能障碍和P13k/Akt信号通路的抑制来介导HepG2细胞凋亡[44]，有作者在实验中也发现通过下调肝癌细胞SMMC-7721中PTEN基因表达，能够下调PI3K/AKT信号通路，从而抑制肝癌细胞的生长[45]。PI3k/Akt信号通路作为脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸激酶受体B(Trk B)的下游信号通路，当PI3k/Akt信号通路被抑制时神经元细胞数量增殖显著减少，5-羟色胺和去甲肾上腺素的表达水平下降明显[46-47]。近期也有研究发现，苦参碱可以通过促进海马中PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素信号转导对小鼠产生抗抑郁样作用，而西药吡格列酮的抗抑郁样作用发挥也与调节PI3K/Akt信号通路介导小鼠神经细胞凋亡有 关[48-49]。抑郁症能够推动癌症进展并导致不良结果，斑激酶(FAK)的敲除能够抑制肿瘤中抑郁症促进的肿瘤侵袭，一些抗抑郁的药物比如丙咪嗪(IMI)常用于治疗慢性精神病对多种癌症也有抑制作用，在晚期癌症治疗中常用于癌痛，包括肝癌、结肠癌、前列腺癌等，前列腺癌中使用丙咪嗪治疗后发现显着下调p-AKT蛋白表达，上调磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK1)/2蛋白表达水平，抑郁症能够促进前列腺癌细胞及分子的增殖与转移[50]。

该研究通过网络药理学的角度为加味逍遥散的治疗作用提供了相关文献与数据支持，同时构建肝癌并发抑郁症的大鼠模型，借助蛋白质组学技术分析加味逍遥散治疗肝癌并发抑郁的效应。筛选出核心靶点GSTM1、PDK1、HSP90AB1，参与了PI3K-Akt信号通路和前列腺癌分子信号通路，这为课题组下一步的研究工作提供了方向：以GSTM1、PDK1 、HSP90AB1为中心，信号通路作为研究对象，进一步对此次的发现进行分子与通路层面的基础研究，为加味逍遥散治疗肝癌并发抑郁症的临床提供重要的理论依据。

此外该研究尚且存在一些局限性：第一，由于筛选时需要设置条件，只能分析加味逍遥散的主要作用靶点，其筛选结果和成分分析可能具有局限性；其次，通过网络药理学和蛋白质组学技术虽然能够筛选出共有的靶点和通路，但仍需要进一步结合体外实验验证发挥作用疗效的具体机制，以阐明加味逍遥散治疗肝癌并发抑郁症的分子作用机制，促进中药现代化发展；最后，酶联免疫吸附法检测血清中的GSTM1、PDK1 、HSP90AB1含量可能存在一定误差，有必要对3个共有靶点进行进一步的细胞实验进行验证及分析。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
肝癌并发抑郁症：肝癌患者在疾病过程中容易并发抑郁症，同时抑郁症进展容易诱发肝癌的发病，两者之间是相互影响共同促进的关系，同时中医藏象理论认为肝癌与抑郁同属“肝积”和“肝郁”范畴，病位在肝，因此治疗当从肝入手。
网络药理学与蛋白质组学分析：网络药理学与蛋白质组学的研究均为整体、全面的研究，探讨药物-靶点-疾病间的关系，中药复方研究存在多成分、多靶点的特点，有效而全面整体的研究对发掘中医药治疗疾病的机制具有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

肝癌与抑郁症存在相互影响与促进的关系，目前加味逍遥散治疗疾病的机制尚不明确。 蛋白质组学与网络药理学结合具有更全面而完整的探讨加味逍遥散治疗疾病的特点。

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