桃红四物汤“异病同治”类风湿性关节炎和骨关节炎的网络药理学及分子对接分析

doi:10.12307/2022.601

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (15): 2419-2425.doi: 10.12307/2022.601

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桃红四物汤“异病同治”类风湿性关节炎和骨关节炎的网络药理学及分子对接分析

王馨苑1，黄夏冰2，李娟2，邓鑫1

1广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530012；2广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530012

收稿日期:2021-09-01 修回日期:2021-10-30 接受日期:2021-11-20 出版日期:2022-05-28 发布日期:2022-01-06
通讯作者: 黄夏冰，中医学硕士，副主任医师，广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530012
作者简介:王馨苑，女，1984年生，中医学硕士，讲师，主要从事中医学、医学教育与医学边缘学科及中药学研究。
基金资助:
广西自治区教育厅项目(2020KY07031)，项目负责人：王馨苑

Network pharmacology and molecular docking analysis on Taohong Siwu Decoction for rheumatoid arthritis and osteoarthritis based on the concept of “Treating Different Diseases with the Same Therapeutic Principle”

Wang Xinyuan1, Huang Xiabing2, Li Juan2, Deng Xin1

1Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530012, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2First Affiliated Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530012, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2021-09-01 Revised:2021-10-30 Accepted:2021-11-20 Online:2022-05-28 Published:2022-01-06
Contact: Huang Xiabing, Master, Associate chief physician, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530012, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Wang Xinyuan, Master, Lecturer, Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanning 530012, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Guangxi Autonomous Region Education Department Project, No. 2020KY07031 (to WXY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
异病同治：指不同的疾病在其发展过程中，由于出现了相同的病机，因而采用同一方法治疗的法则。
网络药理学：是一门新兴且热门的学科，网络药理学的整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点与中医药学的基本特点相吻合。

背景：桃红四物汤已成为中医临床使用最广泛的活血化瘀方剂之一，也是异病同治的典型方剂。但是中药复方化学成分复杂，临床疗效的表现是其多成分、多靶点、多途径的协同作用；网络药理学的整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点与中医药学的基本特点相吻合。运用网络药理学与生物信息学阐述经典名方与疾病可能潜在的成分-靶点-通路-疾病之间的关联，是该方剂现代应用中亟待探究的关键问题。
目的：运用网络药理学、生物信息学和分子对接方法，基于异病同治的思想，探讨桃红四物汤治疗类风湿性关节炎和骨关节炎的分
子机制。
方法：利用GEO数据库筛选与类风湿性关节炎和骨关节炎作用的靶点，运用Cytoscape对化合物-靶点网络可视化，DAVID数据库进行GO、KEGG富集分析，并对核心靶点进行分子对接。
结果与结论：筛选出有效化合物44个；与类风湿性关节炎和骨关节炎相关的靶点201个；GO、KEGG分析主要与AGE-RAGE，MAPK，IL-17等信号通路相关；通过分子对接验证实验可知，桃红四物汤可能主要通过常春藤素、芍药苷、β-胡萝卜素、豆甾醇等有效化合物发挥治疗类风湿性关节炎和骨关节炎的作用。说明桃红四物汤治疗类风湿性关节炎和骨关节炎是通过IL-17信号通路、AGEs/AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路等信号通路，促使促凋亡和抗凋亡信号之间的平衡，减少炎症细胞因子的分泌，从而延缓或改善骨关节软骨的退变，为桃红四物汤治疗类风湿性关节炎和骨关节炎作用机制的方法研究提供了新思路和新方法。

https://orcid.org/0000-0002-1482-1964 (王馨苑)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 类风湿性关节炎, 骨关节炎, 桃红四物汤, 网络药理学, 分子对接, 作用机制

Abstract: BACKGROUND: Taohong Siwu Decoction has become one of the most widely used clinical prescriptions for promoting blood circulation and removing blood stasis in Chinese medicine, and it is also a typical prescription for treating different diseases with the same treatment. However, the chemical components of traditional Chinese medicine compounds are complex, and the clinical efficacy is manifested by the synergy of its multiple components, multiple targets, and multiple pathways. The integrality, systemicity, and emphasis on drug interactions of network pharmacology are similar to the basic characteristics of traditional Chinese medicine. The use of network pharmacology and bioinformatics to explain the relationship between the classic prescription and the possible potential component-target-pathway-disease of the disease is a key issue that needs to be explored in the modern application of the prescription.
OBJECTIVE: To explore the molecular mechanism of Taohong Siwu Decoction in the treatment of rheumatoid arthritis and osteoarthritis based on the idea of “Treating Different Diseases with the Same Therapeutic Principle” by using network pharmacology, bioinformatics, and molecular docking methods.
METHODS: The GEO database was used to screen the targets that interact with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Cytoscape was used to visualize the compound-target network. The DAVID database was used for GO and KEGG enrichment analysis, and the core targets were molecularly docked.
RESULTS AND CONCLUSION: Totally 44 effective compounds were screened; 201 targets related to rheumatoid arthritis and osteoarthritis. GO and KEGG analyses were mainly related to AGE-RAGE, MAPK, and IL-17 signaling pathways. The molecular docking verification experiment demonstrated that Taohong Siwu Decoction is mainly used to treat rheumatoid arthritis and osteoarthritis through effective compounds, such as hederin, paeoniflorin, β-carotene, and stigmasterol. It is concluded that Taohong Siwu Decoction treats rheumatoid arthritis and osteoarthritis through IL-17 signaling pathway, AGEs/AGE-RAGE signaling pathway, TNF signaling pathway, MAPK signaling pathway, and Toll-like receptor signaling pathway to promote the balance between pro-apoptotic and anti-apoptotic signals, reduces the secretion of inflammatory cytokines, thereby delaying or improving the degeneration of bone and articular cartilage, which provides new ideas and new methods for the study regarding the mechanism of action of Taohong Siwu Decoction in the treatment of rheumatoid arthritis and osteoarthritis.

Key words: rheumatoid arthritis, osteoarthritis, Taohong Siwu Decoction, network pharmacology, molecular docking, mechanism of action

中图分类号:

王馨苑, 黄夏冰, 李娟, 邓鑫. 桃红四物汤“异病同治”类风湿性关节炎和骨关节炎的网络药理学及分子对接分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(15): 2419-2425.

Wang Xinyuan, Huang Xiabing, Li Juan, Deng Xin. Network pharmacology and molecular docking analysis on Taohong Siwu Decoction for rheumatoid arthritis and osteoarthritis based on the concept of “Treating Different Diseases with the Same Therapeutic Principle”[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(15): 2419-2425.

图/表（结果） 8

2.1 桃红四物汤有效成分筛选以及化学成分潜在靶点预测结果通过在TCMSP在线数据库平台检索与桃红四物汤中单味药材中所有已报道的有效化学活性成分及其ADME参数，同时根据OB≥30%，DL≥0.18参数对桃红四物汤的有效活性成分进行筛选，共搜集到44个有效药物活性成分，其中白芍5个、川芎5个、红花13个、桃仁17个、多种药物共有活性成分4个，详见表1。

2.2 微阵列芯片下载及获取疾病基因集对GSE123568芯片进行校正和归一化后，获取骨关节炎和类风湿关节炎两种疾病的基因集以及筛选差异表达基因(DEGs)。基因集中共有21 452个基因，其中，与骨关节炎相比，类风湿关节炎组中总共鉴定出516个DEGs。
2.3 获取药物和疾病的共有靶标结果将筛选的桃红四物汤活性成分靶点与疾病靶点取交集，并通过R软件绘制韦恩图，得到药物与疾病的共同靶点201个，见图1。

2.4 桃红四物汤治疗类风湿性关节炎和骨性关节炎的“药物-成分-疾病靶点”网络构建及分析根据靶点蛋白与药物的关系可以构建“药物-靶点”网络，涉及201个靶点构建的PPI 网络，见图2。

研究发现一个蛋白的Degree值和其基因的重要性直接相关，也就是说具有高Degree的蛋白更倾向于是关键蛋白。将201个的靶点基因绘制成PPI中的柱状图，并将度值最高的前30个靶点绘制成核心基因柱状图，见图3。涉及到的疾病靶点前10的包括AKT1、IL6、CASP3、TP53、JUN、EGF、MAPK1、MAPK8、TNF、VEGFA。

为了能够更加直观地探析桃红四物汤治疗疾病的作用机制，还将对“药物-成分-疾病靶点”进行网络构建，经分析得到的关键化学成分主要为hederagenin(常春藤苷)、Myricanone(杨梅酮)、paeoniflorin(芍药苷)、quercetin(槲皮素)、luteolin(木犀草素)、beta-carotene(β-胡萝卜素)、Stigmasterol(豆甾醇)、kaempferol(山奈酚)、baicalein(黄芩素)、gibberellin 7(赤霉素 7)等10个，见图4。

2.5 GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析结果为了探究药物与疾病的共同靶点的功能，通过R在线工具进行了富集分析。结果显示在GO功能富集中，生物过程(BP)中，主要参与对氧化应激的反应、细胞对化学应激的反应、对活性氧的反应、对金属离子的反应对脂多糖的反应。在细胞成分(CC)中主要富集于转录调节复合体、质膜筏、小窝、膜区、膜微区、膜筏。在分子功能(MF)中主要与泛素样蛋白连接酶结合、DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA-结合转录因子结合、类固醇激素受体活性、配体激活的转录因子活性的活动有关。此外，在KEGG通路富集结果中，骨关节炎与类风湿性关节炎与IL17信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、PT53信号通路等密切相关，见图5。

2.6 分子对接结果将2.5筛选到的核心靶点与主要的化学成分采用分子操作平台软件MOE (molecule operating environment)进行对接验证，更能直观展示关键成分的最佳构型和核心靶点之间的相互作用，分子与标靶蛋白的最低结合能均小于0，说明配体与受体均可以自发结合。Hsin KY就分子对接的研究而言，结合能(kJ/mol)越小，表明活性物质与蛋白质之间对接的结果就会越牢固。当结合能的数值小于-4.25 kJ/mol时，则表示活性物质与蛋白质之间有一定结合活性，小于-5.0 kJ/mol时有较好的结合活性，小于-7.0 kJ/mol时有强烈的结合活性[18]。用MOE中的Dock模块进行分子对接，选择基于蛋白和配体间相互作用能的打分函数ASE，分别得到每个化合物与受体的对接打分，打分越低，配体与受体结合越稳定，结果见表2。

总体来说，AKT1、EGF、JUN、TNF、MAPK1、MAPK8、TP53与化合物结合相对稳定，其中AKT1、EGF、TNF、MAPK8与beta-carotene的结合能分别是-8.88，-8.66，-9.33，-7.70 kJ/mol，JUN与Myricanone结合能是-8.14 kJ/mol，MAPK1与paeoniflorin的结合能是-7.84 kJ/mol。主要活性成分和核心靶点之间的结合情况与预测关系相符。将结合将为稳定的化学成分与靶点进行对接可视化，见图6。如图6A，AKT1与beta-carotene对接打分为-8.88，化合物完全被包裹在活性口袋之中，OH原子分别与lys163形成氢键，距离分别为2.81 nm，键能分别为-7.4 kJ/mol；如图6C，EGFR与beta-carotene对接打分为-8.66 kJ/mol，化合物完全被包裹在活性口袋之中，2个碳原子分别与ASP 855，PHE 856形成氢键,距离分别为3.54和3.62 nm，键能分别为-0.7 kJ/mol和-0.6 kJ/mol，氨基的氮原子与残基MET 793形成氢键受体，距离为2.90 nm，键能为-5.4 kJ/mol，化合物的相对分子质量为444.52，logP为3.03。桃红四物汤中的主要活性成分与核心靶点的高结合亲和力表明，桃红四物汤可能是通过调节以上相关靶标发挥治疗类风湿关节炎和骨关节炎的作用。

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引言

类风湿性关节炎是一种复杂的慢性多系统自身免疫性疾病，主要影响柔性关节[1]。全世界每年报告的100 000例新病例中有0.5%-1%的成年人受类风湿性关节炎影响[2]。虽然疾病病因学仍然未知，但是类风湿性关节炎的进行性、慢性炎症和破坏性关节特征也称为血管翳组织的侵入性炎症组织延续[3]。此外，滑膜中的各种炎性细胞(包括单核细胞/巨噬细胞、T和B细胞、破骨细胞、树突细胞、内皮细胞和滑膜成纤维细胞)有助于类风湿性关节炎的发生和进展[4]。同样，骨关节炎是影响关节的另一种常见的慢性疾病，主要影响年龄大于60岁的个体。骨关节炎也是一种进行性疾病，其特征是软骨和骨骼退化，伴随着骨赘形成、关节间隙变窄和软骨下硬化[5]。尽管类风湿性关节炎和骨关节炎具有相似的症状，但两者的不同之处在于滑膜有不同的病理表现，类风湿性关节炎的特点是滑膜细胞肥大增生、伴有淋巴细胞和炎症细胞浸润，而骨关节炎滑膜的白细胞浸润较少[6-7]。尽管在理解类风湿性关节炎和骨关节炎的病理生理学方面取得了重大进展，但早期诊断、治疗干预和潜在的发病机制仍然具有挑战性[8]。
桃红四物汤出自清代柴得华《妇科冰鉴》，由生地(3钱，酒洗)、白芍钱(5分，酒炒)、川芎(1钱)、桃仁(14粒，去皮尖研泥)、当归(4钱，酒洗)、红花(1钱，酒洗)组成，具有“养血、活血、逐瘀”的功效[9]。最早见于清代吴谦所著《医宗金鉴·妇科心法要决》，是在妇科圣方四物汤(补血活血)的基础上，加桃仁-红花药对增强活血化瘀之功，对血瘀而兼有血虚者尤为适宜，适用于血瘀引起的多种病症[10-12]。类风湿性关节炎和骨关节炎中医归属于骨痹，桃红四物汤均可治之。桃红四物汤已成为中医临床使用最广泛的活血化瘀方剂之一，也是异病同治的典型方剂。但是中药复方化学成分复杂，临床疗效的表现是其多成分、多靶点、多途径的协同作用，桃红四物汤以其养血和活血化瘀功效为核心应用于类风湿性关节炎和骨关节炎的治疗，其成分-靶点-通路-疾病之间的交互作用网络如何关联，是该方剂现代应用中亟待探究的关键问题。
最近，许多研究策略探索了类风湿性关节炎和骨关节炎的分子特征。在这些研究策略中，高通量微阵列方法受到广泛关注并在肿瘤医学等领域取得了实质性进展，从分子诊断到分子分类，从患者分层到预后预测，以及新药靶点的发现到反应都有显著的临床应用预测[13-15]。此外，已经使用微阵列技术对骨关节炎和类风湿性关节炎进行了多项基因表达谱研究，并且已经确定了这些疾病的几个关键基因和诊断生物标志物，包括对涉及不同途径、生物学和生物学的数百个差异表达基因(differentially expressed genes，DEG)进行谱分析。
此次研究的目的是使用生物信息学、网络药理学和分子对接的方法分析类风湿性关节炎和骨关节炎之间基因蛋白和相关的生物过程，以阐明桃红四物汤“异病同治”类风湿性关节炎和骨关节炎潜在的机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 桃红四物汤有效成分筛选以及化学成分潜在靶点预测通过访问TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库平台，分别以桃仁、红花、地黄、川芎、当归、芍药为关键词，在数据库收集桃红四物汤药效成分信息，以类药性指数(drug like index，DL)≥0.18以及口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%为筛选条件[16-17]，搜索该数据库中所包含桃仁、红花、地黄、川芎、当归、芍药的有效活性成分及毒药物动力学(absorption，distribution，metabolism and excretion，ADME)信息，随后使用Perl软件(https://www.perl.org/)处理数据，将所得结果制成三线表。另外，在该数据库Ingredients获得筛选得到的桃仁、红花、地黄、川芎、当归、芍药药物有效化学活性成分相对应的靶点蛋白，并在Related Targets进一步获得蛋白靶点相对应的疾病靶点，再用Perl 软件(https://www.perl.org/)处理数据，筛选出无对应靶点成分，剔除掉重复靶点，并保存为“drug.txt”文本格式备用。
1.2 微阵列芯片下载以“(“arthritis, rheumatoid”[MeSH Terms] OR Rheumatoid arthritis[All Fields]) AND “Homo sapiens”[porgn] AND (“gse”[Filter] AND “Expression profiling by array”[Filter] AND “attribute name tissue”[Filter])”为检索式，在NCBI GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)搜索微阵列数据集，此次研究下载了GSE123568数据集，共纳入14例关节炎患者关节滑膜样品，包括20个类风湿性关节炎样品和4个骨关节炎样品。
1.3 数据处理使用Perl软件将探针的名称转化为基因名字。当≥2个的探针对应同一基因时，该基因的表达值取这些探针的平均值。
1.4 获取类风湿性关节炎和骨关节炎的疾病基因集使用R(4.0.2版本)软件中的微阵列数据包的线性模型包(LIMMA； http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html)对基因表达矩阵进行归一化处理，比较类风湿性关节炎组和骨关节炎组基因的表达值，将原始P值调整为错误发现率(false discovery rate；FDR)，以adjusted P < 0.05和|log2 FC(fold change)|≥1作为筛选标准，筛选出数据集中类风湿性关节炎和骨关节炎的疾病基因，并保存为“disease.txt”文本格式备用。
1.5 获取药物和疾病的共有靶标使用R(4.0.2版本)软件中的微阵列数据包VennDiagram包(VennDiagram；http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/VennDiagram.html)对“drug.txt”和“disease.txt”两个文本文件取交集，筛选出疾病和药物的共有靶标。
1.6 PPI的构建筛选核心靶点 STRING(http：//string-db.org/；Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins)数据库的目标是收集、评分和整合所有公开的蛋白质-蛋白质相互作用信息来源，实现一个全面和客观的互作网络，包括直接(物理)和间接(功能)交互(10)。以中置信度(medium confidence) > 0.4为标准，使用STRING构建PPI互作网络，通过Cytoscape软件可视化，运用cytoscape的CytoNCA插件筛选出PPI网络中的核心蛋白。
1.7 共有靶标的GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析 GO(Gene Ontology)是一个重要的生物信息学工具，用于注释基因和分析其生物过程，包括生物过程(biological process，BP)，细胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)三大类。KEGG是一个通过高通量实验技术产生的大规模分子数据集来理解高级功能和生物系统的数据库资源。在此次研究中，使用R软件的对疾病和药物的共有靶标做GO富集分析和KEGG信号通路富集分析。
1.8 分子对接采用分子操作平台软件MOE(molecule operating environment)进行对接。目标蛋白的三维结构从RCSB-PDB数据库(http://www.pdb.org)下载。通过pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)制备相应配体。用MOE-Dock模块,将配体与受体进行半柔性对接，放置函数选用Triangle Matcher打分函数选用London dG，其余采用默认参数[9]，分别得受体对接得分值，得分值越低，配体与受体结合越稳定，将通过得分值的高低和与氨基酸残基结合的数目评价化合物与靶点的结合活性。

讨论

“异病同治”是中医治病的法则[19]。异病可以同治，关键疾病的发生发展有共同的病机，当病机相同，方可采用相同的治疗法则。中医学一般将骨关节炎归属“骨痹”“痹症”“筋痹”等范畴，类风湿性关节炎在中医学统属于“痹证”范畴，根据其临床表现，与中医古籍所记载的“历节病”“白虎历节”“骨痹”“顽痹”“鹤膝风”等相似，二者在中医上均属于“骨痹”的范畴，因此，骨关节炎与类风湿性关节炎之间可能存在共性病理机制。该研究使用生物信息学、网络药理学和分子对接的方法研究类风湿性关节炎和骨关节炎之间的蛋白基因、有效化学成分和相关的生物过程，以阐明桃红四物汤“异病同治”类风湿性关节炎和骨关节炎潜在的机制。
通过对桃红四物汤的药物有效活性成分和类风湿性关节炎、骨关节炎相应的疾病靶标进行搜索、筛选，得到符合标准的有201个共同靶标。进一步构建“药物-成分-共同靶点”的网络图，发现常春藤苷、杨梅酮、芍药苷、槲皮素、木犀草素、β-胡萝卜素、豆甾醇、山奈酚、黄芩素、赤霉素7这10种有效化学成分与共同治疗疾病的相关性较高，通过查阅相关文献报道[20-22]，这10种有效药物成分大多数与成骨或软骨细胞的代谢、抗氧化作用、改善内环境作用等炎症反应机制有关。例如槲皮素具有抗炎、抗氧化的作用，于维汉等[20]的研究证实了槲皮素具有促进成骨分化的作用，同时也可以抑制骨的吸收；裴凌鹏等[21]的实验证实了β-胡萝卜素能改善H2O2对成骨细胞损伤的影响；也有实验证实了山奈酚能够增加骨密度，改善骨微结构[22]。因此，桃红四物汤治疗类风湿性关节炎和骨关节炎的主要有效成分可能为常春藤苷、杨梅酮、芍药苷、槲皮素、木犀草素、β-胡萝卜素、豆甾醇、山奈酚、黄芩素、赤霉素7。通过分子对接验证实验可知，桃红四物汤可能主要通过常春藤素、杨梅酮、芍药苷、β-胡萝卜素、豆甾醇等有效化合物发挥治疗类风湿性关节炎和骨关节炎的作用。
通过PPI网络分析可知，AKT1、IL6、CASP3、TP53、JUN、EGF、MAPK1、MAPK8、TNF、VEGFA这10种蛋白质超过所有度值的2倍中位数，这说明桃红四物汤的活性成分与这些蛋白具有较高的结合活性。检索查阅相关文献可知，RAC-α丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1)通过激活下游mTORC1/S6K1效应蛋白抑制破骨细胞的生长及促进成骨细胞分化，从而达到治疗骨性疾病的目的。PENG等[23]通过敲除小鼠的AKT1基因，发现被敲除AKT1基因的小鼠骨化延迟，严重破坏骨的生长发育。近来研究发现，骨质疏松的发生和发展都与免疫系统功能失常而产生炎症反应直接关联[24]。
肿瘤坏死因子α是一种由单核-巨噬细胞、B细胞、NK细胞等分泌产生，具有多功能的炎性免疫细胞因子，在炎症反应、骨代谢异常等多种生物过程中起到关键性的作用[25-26]。肿瘤坏死因子α可作用于破骨细胞前体细胞，增强坏死骨的吸收，抑制成骨细胞的生成，从而影响骨重建功能；还通过调节机体免疫影响骨质疏松症的发生、发展[27-28]。MURAD等[29]通过实验证实了肿瘤坏死因子α与骨质疏松有密切的关系，因此血清中的肿瘤坏死因子α表达水平可作为评价骨质疏松症和未来脆性骨折风险的潜在的生物指标。肿瘤坏死因子α也可通过促进合成和释放白细胞介6等炎性因子，促进炎症发展，影响骨代谢微环境，促进破骨细胞增殖、分化，导致骨质疏松症。IL-6是一种能够在自身免疫性疾病或感染患者中引起发热的内源性热原蛋白，它与多种炎症状态呈正相关，在炎性疾病中，白细胞介素6从炎性部位分泌到血清中，并通过白细胞介6受体α诱导转录形成炎症反应[30]。
通过以上分析，由PPI网络筛选到的核心蛋白靶点可能与类风湿性关节炎和骨关节炎的发生发展有关。因此，AKT1、IL6、CASP3、TP53、JUN、EGF、MAPK1、MAPK8、TNF、VEGFA可能为桃红四物汤治疗类风湿性关节炎与骨关节炎的潜在的关键靶点蛋白。
通过GO富集分析发现，桃红四物汤治疗类风湿性关节炎和骨关节炎疾病靶点涉及的生物过程主要与对氧化应激的反应、对脂多糖的反应、对活性氧的反应、对氧气水平的反应、细胞对氧化应激的反应有关。糖皮质激素是免疫调节类药物，大量使用可以打破体内正常的免疫调节状态，破坏免疫内环境的稳态，激活炎症信号通路发挥免疫允许及免疫增强作用，引起免疫联级效应[31-32]。研究证实激素可以诱导经典炎症通路——TLR4信号通路异常激活并干扰免疫反应，增强破骨细胞活性和促进增殖，破坏骨代谢平衡[33]。长期大量使用激素会导致红细胞变形能力下降、血黏度增高，导致细胞处于缺氧状，从而引起骨细胞遭受破坏，引起类风湿性关节炎和骨关节炎的发生发展。
通过KEGG富集分析发现，桃红四物汤治疗类风湿性关节炎和骨关节炎疾病靶点涉及的信号通路主要与IL-17信号通路、AGEs/AGE- RAGE信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路有关。AGEs/AGE- RAGE信号通路是2000年由YAMAMOTO等首先提出来的[34]。循环中的AGEs通过活化的促分裂蛋白激酶( MAPKs) 信号转导途径致使RAGE被激活，AGEs与RAGE相互作用后，可引起细胞内氧化应激并通过激活p21ras及MAP激酶途径，激活NF-κB信号通路[35]。NF-κB可使肿瘤坏死因子α、血管内皮生长因子( VEGF)，白细胞介素1α、白细胞介素6[36]、胞内黏附分子1 (ICAM- 1)、血管细胞黏附分子1 (VCAM- 1)等多种炎症因子的表达增加[37]。NF-κB信号通路在调控破骨细胞的形成和活化起到至关重要的作用[38]。在正常的生理功能情况下，p65或p50与IκBα形成共聚体存在于细胞质中，当受到RNAKL、脂多糖等细胞外信号的刺激时，IκBα发生磷酸化并降解，p65或p50进入细胞核，促进破骨细胞形成和活化相关信号分子的转录，促进破骨细胞的形成和活化[39]。MAPK通路主要参与转导胞外刺激(环境压力、生长因子、细胞因子等)引起细胞生长、分化和凋亡。研究发现MAPKs在骨骼发育和骨代谢中起着重要作用，大部分研究均指向p38和ERK，JNK在成骨分化中所起的作用尚有一定的争议。如通过化学抑制JNK或siRNA干扰其表达，均引起矿化减少、成骨标志物表达下降，而其活性状态下促进成骨生成[40-41]。但也发现在人间充质干细胞抑制JNK后碱性磷酸酶的活性增加而成骨加强[42]。冉庆林等[43]的实验通过检测胸腰椎压缩性骨折老年肺部感染的患者血清中白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素8、白细胞介素10、C-反应蛋白和肿瘤坏死因子α的表达，以及对患者血清中CD4+、CD8+免疫细胞和IgG、IgA、IgM的免疫抗体进行分析，然后探讨白细胞介素17(IL-17)信号通路的变化，从而发现胸腰椎压缩性骨折老年患者肺部感染可以抑制TLR7的表达，从而促进IL-23/IL-17信号通路的活化。
综上所述，桃红四物汤治疗类风湿性关节炎和骨关节炎是通过IL-17信号通路、AGEs/AGE- RAGE信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路等信号通路，促使促凋亡和抗凋亡信号之间的平衡，减少炎症细胞因子的分泌，从而延缓或改善骨关节软骨的退变。
展望：该研究通过网络药理学、生物信息学以及分子生物学的方法，根据异病同治的中医治疗原则，对桃红四物汤治疗类风湿性关节炎和骨关节炎疾病的物质基础及其作用机制进行探析。构建了其主要有效成分、作用靶点和通路、治疗疾病的复杂网络，一定程度上揭示了桃红四物汤活血化瘀功效在临床上异病同治的作用网络，体现了桃红四物汤对疾病的治疗特点是通过多成分-多靶点-多途径，分析结果与文献报道一致。此外，该文还对桃红四物汤的有效成分与疾病药物靶点进行分子对接分析，结果发现常春藤素、杨梅酮、芍药苷、β-胡萝卜素、豆甾醇与疾病药物共同靶点的关键靶点有良好的结合，特别是与AKT1，EGF，MAPK1，TNF等因子的相对稳定，进一步为桃红四物汤治疗类风湿性关节炎和骨关节炎提供了新的思路。
然而筛选得到的有效成分只是考虑其活性和入血情况，未考虑血脑屏障的问题，且并未衡量其在复方中各味中药的含量等问题，且只通过分子对接对主要成分和关键靶点进行了验证。所以在此基础上，可进一步通过体内、外实验来验证药物的时效性、药效性等与疾病靶点之间的作用关系，为桃红四物汤的药效物质学基础和作用机制的科学内涵。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

桃红四物汤“异病同治”类风湿性关节炎和骨关节炎的网络药理学及分子对接分析

Network pharmacology and molecular docking analysis on Taohong Siwu Decoction for rheumatoid arthritis and osteoarthritis based on the concept of “Treating Different Diseases with the Same Therapeutic Principle”

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