网络药理学结合分子对接技术揭示桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的潜在分子机制

doi:10.12307/2022.040

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (2): 245-252.doi: 10.12307/2022.040

• 组织构建相关数据分析 Date analysis of organization construction • 上一篇下一篇

网络药理学结合分子对接技术揭示桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的潜在分子机制

章晓云1，2，李华南1，陈锋2，柴源2，甘斌1，李松1，陈丁鹏1

1江西中医药大学临床医学院，江西省南昌市 330004；2广西中医药大学附属瑞康医院骨科，广西壮族自治区南宁市 530011

收稿日期:2020-09-27 修回日期:2020-09-30 接受日期:2020-10-24 出版日期:2022-01-18 发布日期:2021-10-27
通讯作者: 李华南，博士，博士生导师，主任中医师，江西中医药大学临床医学院，江西省南昌市 330004
作者简介:章晓云，男，1986年生，江西省德安县人，汉族，江西中医药大学在读博士，副主任中医师，主要从事骨伤疾病中医药临床与基础工作。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81860857，82060871)，项目负责人：李华南；江西省自然科学基金(20202BAB206071)，项目负责人：李华南；国家中医药管理局第四批全国中医(临床、基础)优秀人才研修项目[国中医药人教发(2017)24号]，项目负责人：李华南；江西省卫生和计划生育委员会中医药科研基金项目(2016A077)，项目负责人：李华南；江西省卫生和计划生育委员会中医药科研基金重点项目(2017Z010)，项目负责人：李华南；江西科技计划项目(20142BBG70084)，项目负责人：李华南

Potential molecular mechanism of Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction in the treatment of gouty arthritis based on network pharmacology and molecular docking

Zhang Xiaoyun1, 2, Li Huanan1, Chen Feng2, Chai Yuan2, Gan Bin1, Li Song1, Chen Dingpeng1

1School of Clinical Medicine, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China; 2Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2020-09-27 Revised:2020-09-30 Accepted:2020-10-24 Online:2022-01-18 Published:2021-10-27
Contact: Li Huanan, MD, Doctoral supervisor, Chief physician, School of Clinical Medicine, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China
About author:Zhang Xiaoyun, MD candidate, Associate chief physician, School of Clinical Medicine, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, Jiangxi Province, China; Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81860857 and 82060871 (both to LHN); Jiangxi Provincial Natural Science Foundation, No. 20202BAB206071 (to LHN); the Fourth Batch of National Chinese Medicine (Clinical, Basic) Excellent Talent Research and Training Project, No. (2017) 24 (to LHN); Chinese Medicine Research Fund Projects of Jiangxi Provincial Health and Family Planning Commission, No. 2016A077 and 2017Z010 (both to LHN); Jiangxi Science and Technology Planning Project, No. 20142BBG70084 (to LHN)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
网络药理学：基于系统生物学和药理分子学阐释中药对疾病治疗作用的关键靶点及涉及的生物学过程和信号通路，从微观与整体水平探讨中药与疾病之间的关系。
分子对接：通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法，主要研究分子间相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。近年来，分子对接方法已成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术。
背景：临床研究表明桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎效果显著，但其分子作用机制尚未明确。
目的：基于网络药理学及分子对接技术探讨桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的潜在分子机制。
方法：利用中药系统药理学数据库及分析平台筛选桂枝芍药知母汤的活性成分及对应靶点，整合Gene Cards，OMIM和DigSee数据库的查询结果获取痛风性关节炎相关靶点，然后利用Venny平台进行映射取交集得到桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的潜在作用靶点。利用Cytoscape软件构建桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的“单味药-活性成分-作用靶点”网络和蛋白质相互作用网络，并使用David数据库对桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的作用靶点进行GO和KEGG通路富集分析。最后采用Autodock软件对桂枝芍药知母汤的主要活性成分与核心蛋白基因进行分子对接。
结果与结论：①桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎相关的活性成分有180个，其中槲皮黄素、芒柄花黄素、木犀草素、3’-甲氧基光甘草定和花旗松素为关键活性成分；②共获得24个关键靶点，其中肿瘤蛋白P53、神经营养酪氨酸受体激酶1、泛素连接酶CUL3蛋白、雌激素受体1和泛素C为核心靶点；③分子对接显示桂枝芍药知母汤关键活性成分与治疗痛风性关节炎的关键作用靶点具有较好的结合活性；④GO分析结果显示，关键作用靶点主要参与脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、细胞对生物刺激的反应、氧化应激反应、炎症反应的调节和对活性氧的反应等生物学过程；⑤KEGG分析结果显示桂枝芍药知母汤主要作用于白细胞介素17通路、肿瘤坏死因子通路、AGE-RAGE通路、NOD样受体通路、核转录因子κB通路和Toll样受体通路等发挥治疗痛风性关节炎的作用；⑥结果证实，桂枝芍药知母汤以多成分-多靶点-多通路方式减轻免疫-炎症反应、抑制软骨细胞凋亡、提高人体抗氧化应激反应能力，从而发挥治疗痛风性关节炎的作用。通过药效成分的筛选，未来可将其进行蛋白支架载药缓释系统进行口服或者局部用药，可有利于病情的缓解。

https://orcid.org/0000-0002-2572-0229(章晓云)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 关节, 痛风, 关节炎, 中医药, 高尿酸血症, 分子机制, 网络药理学, 信号通路

Abstract: BACKGROUND: Clinical studies have shown that Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction is effective in treating gouty arthritis, but its pharmacological mechanism is not yet clear.
OBJECTIVE: To explore the potential molecular mechanism of Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction in the treatment of gouty arthritis based on network pharmacology and molecular docking.
METHODS: The active components and corresponding targets of Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction was screened by TCMSP database. The related targets of gouty arthritis were obtained by the query results of Gene Cards, OMIM and DigSee databases. The potential targets of Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction in the treatment of gouty arthritis were obtained by mapping intersection by Venny platform. The network of “single drug-active target-potential target” and the protein interaction network of Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction in the treatment of gouty arthritis were constructed by Cytoscape software. The action targets of Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction were analyzed by David database including the gene ontology (GO) analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analysis. Finally, molecular docking between key active ingredients and key targets was performed using Autodock software.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 180 active components and 24 targets related to the treatment of gouty arthritis by Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction. The key active components were quercetin, formononetin, luteolin, 3'-methoxyglabridin, taxifolin. The key targets were P53, neurotrophic receptor tyrosine kinase 1, Cullin3, estrogen receptor 1, and ubiquitin C. Molecular docking results showed that the key active components showed good binding activity with the key targets of gouty arthritis treatment. GO analysis showed that the key targets were mainly involved in many biological processes such as lipopolysaccharide reaction, bacterial derived molecules response, cell response to biological stimulation, oxidative stress response, regulation of inflammatory response, and response to reactive oxygen species. KEGG pathway analysis showed that Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction mainly acted on interleukin-17 pathway, tumor necrosis factor pathway, AGE-RAGE pathway, NOD like receptor pathway, nuclear factor-κB pathway, and Toll like receptor pathway. To conclude, Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction could reduce immune-inflammatory reaction, inhibit chondrocyte apoptosis and improve the ability of anti-oxidation stress response by multi-component, multi-target and multi-pathway, so as to play a role in the treatment of gouty arthritis. The protein scaffold drug delivery system can be used orally or locally in the future by screening of effective components, which is conducive to the remission of the disease.

Key words: joint, gout, arthritis, traditional Chinese medicine, hyperuricemia, molecular mechanism, network pharmacology, signaling pathway

中图分类号:

章晓云, 李华南, 陈锋, 柴源, 甘斌, 李松, 陈丁鹏. 网络药理学结合分子对接技术揭示桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的潜在分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 245-252.

Zhang Xiaoyun, Li Huanan, Chen Feng, Chai Yuan, Gan Bin, Li Song, Chen Dingpeng. Potential molecular mechanism of Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction in the treatment of gouty arthritis based on network pharmacology and molecular docking[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(2): 245-252.

图/表（结果） 11

2.1 药物活性化合物筛选结果通过TCMSP数据库检索共获得桂枝芍药知母汤活性化学成分1 917个，其中桂枝220个、白芍85个、甘草375个、麻黄483个、生姜265个、白术70个、知母106个、防风228个和附子85个，再以OB≥30%和DL≥0.18为过滤条件对其进行筛选，共得到201个活性成分。其中有21个交集化合物，删除重复项后剩余180个活性成分，基本信息见表2。

2.2 桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎潜在作用靶点预测结果利用TCMSP数据库获得桂枝芍药知母汤中活性成分靶点241个；在Gene Cards，OMIM和DigSee数据库中获得痛风性关节炎相关靶点211个，最后通过Venny平台得到桂枝芍药知母汤与痛风性关节炎共有基因24个，即桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎潜在作用靶点有24个，见图1。

2.3 构建的“单味药-活性成分-作用靶点”网络运用Cytoscape软件中“merge”功能构建“桂枝芍药知母汤单味药-活性成分-作用靶点”网络见图2。结果显示桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的排名前五的关键活性成分为槲皮黄素(quercetin)、芒柄花黄素(formononetin)、木犀草素(luteolin)、3’-甲氧基光甘草定(3’-Methoxyglabridin)和花旗松素(taxifolin)等，这些成分对治疗痛风性关节炎具有重要的作用，见表3。

2.4 PPI网络及网络拓扑分析结果利用Cytoscape中的Bisogenet插件构建PPI网络图，见图3，结果表明肿瘤蛋白P53(Tumor Protein P53，TP53)、神经营养酪氨酸受体激酶1(Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 1，NTRK1)、泛素连接酶CUL3蛋白(Cullin3，CUL3)、雌激素受体1、泛素C (Ubiquitin C，UBC)排名靠前，它们在整个网络中起着关键作用，同时这些蛋白基因所对应的靶点在桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎中具有重要地位，可能是桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的关键靶点。

2.5 GO富集分析和KEGG富集分析结果利用DAVID数据库对潜在靶点进行GO及KEGG功能富集分析，见图4。GO富集分析共确定了846个与痛风性关节炎发生发展过程密切相关的条目，其中805条生物学过程的相关条目主要包括对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、细胞对生物刺激的反应、氧化应激反应、炎症反应的调节和对活性氧的反应等；9个细胞成分的相关条目主要包括膜筏、微域膜和膜区等；共32个分子功能的相关条目主要包括血红素结合、四吡咯结合、丝氨酸型内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性、磷酸酶结合、丝氨酸水解酶活性、铵离子结合、MAP激酶活性和激活转录因子结合等。KEGG通路结果表明，桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎可能的作用机制通路主要涉及白细胞介素17通路，肿瘤坏死因子通路、AGE-RAGE通路、NOD样受体通路、核转录因子κB通路和Toll样受体通路等，其中白细胞介素17通路图见图5。

2.6 KEGG关系网络构建通过Cytoscape 3.7.2软件对靶点-信号通路关系网络进行可视化分析，构建“KEGG关系网络图”，见图6，图中相关信号通路信息详见表4。结果显示桂枝芍药知母汤的各有效成分是通过多靶点、多信号通路共同发挥治疗痛风性关节炎的作用。

2.7 分子对接结果以结合能≤-5.0 kJ/mol为标准，对关键活性成分和关键靶点进行分子对接验证。结果显示二者对接的亲和力远小于-5.0 kJ/mol，由此表明关键活性成分与关键靶点间具有较好的结合活性，证明该研究的预测较为可靠，结果见表5。选取亲和力最低的木犀草素和雌激素受体1进行分子对接展示，见图7。

参考文献

[1] TATSIY O, MAYER TZ, CARALHO OLIVEIRA V, et al. Cytokine production and NET formation by monosodium urate-activated human neutrophils involves early and late events, and requires upstream TAK1 and Syk. Front Immunol. 2020. doi: 10.3389/fimmu.2019.02996.
[2] HSIEH CY, LI LH, LAM Y, et al. Synthetic 4-hydroxy auxarconjugatin b, a novel autophagy inducer, attenuates gouty inflammation by inhibiting the NLRP3 inflammasome. Cells. 2020;9(2):279.
[3] 舒建龙,李凤珍,覃裕旺.痛风病理及临床中西医治疗的研究进展[J].中国实验方剂学杂志, 2020,26(2):218-227.
[4] 黄聪,彭伟,牟茂婷,等.基于“肢节痹病”的桂枝芍药知母汤的现代药理作用探讨[J].时珍国医国药,2019,30(4):949-950.
[5] 乔晓涵.桂枝芍药知母汤加减方治疗急性痛风性关节炎疗效观察[D].沈阳:辽宁中医药大学, 2019.
[6] LI G, XU Q, HAN K, et al. Experimental evidence and network pharmacology-based analysis reveal the molecular mechanism of Tongxinluo capsule administered in coronary heart diseases. Biosci Rep. 2020;40(10):BSR20201349.
[7] SAKLE NS, MORE SA, MOKALE SN. A network pharmacology-based approach to explore potential targets of Caesalpinia pulcherima: an updated prototype in drug discovery. Sci Rep. 2020;10(1):17217.
[8] ZHANG Q, LI R, PENG W, et al. Identification of the active constituents and significant pathways of Guizhi-Shaoyao-Zhimu decoction for the treatment of diabetes mellitus based on molecular docking and network pharmacology. Comb Chem High Throughput Screen. 2019; 22(9):584-598.
[9] 汪选斌,陆金健.中药药理规范研究的思考[J].世界科学技术-中医药现代化,2019,21(9):1846-1854.
[10] GUO Q, MAO X, ZHANG Y, et al. Guizhi-Shaoyao-Zhimu decoction attenuates rheumatoid arthritis partially by reversing inflammation-immune system imbalance. J Transl Med. 2016;14(1):165.
[11] ZHANG Q, PENG W, WEI S, et al. Guizhi-Shaoyao-Zhimu decoction possesses anti-arthritic effects on type II collagen-induced arthritis in rats via suppression of inflammatory reactions, inhibition of invasion & migration and induction of apoptosis in synovial fibroblasts. Biomed Pharmacother. 2019;118:109367.
[12] ZHANG KH, WANG MQ, WEI LL, et al. Investigation of the effects and mechanisms of dendrobium loddigesii rolfe extract on the treatment of gout. Evid Based Complement Alternat Med. 2020; 2020:4367347.
[13] ZHOU Q, SUN HJ, LIU SM, et al. Anti-inflammation effects of the total saponin fraction from Dioscorea nipponica Makino on rats with gouty arthritis by influencing MAPK signalling pathway. BMC Complement Med Ther. 2020;20(1):261.
[14] ZHOU M, ZE K, HUA L, et al. Cyr61 promotes inflammation of a gouty arthritis model in rats. Mediators Inflamm. 2020;2020:8298615.
[15] 李建,张洁瑛,孙鹏,等.平胃散合桂枝芍药知母汤加减治疗慢性痛风性关节炎的疗效机制[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(1):180-185.
[16] RUIZ-MIYAZAWA KW, STAURENGO-FERRARI L, MIZOKAMI SS, et al. Quercetin inhibits gout arthritis in mice: induction of an opioid-dependent regulation of inflammasome. Inflammopharmacology. 2017;25(5):555-570.
[17] FU X, QIN T, YU J, et al. Formononetin ameliorates cognitive disorder via pgc-1α pathway in neuroinflammation conditions in high-fat diet-induced mice. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2019;18(7):566-577.
[18] WANG S, CAO M, XU S, et al. Luteolin alters macrophage polarization to inhibit inflammation. Inflammation. 2020;43(1):95-108.
[19] LI P, LI Y, JIANG H, et al. Glabridin, an isoflavan from licorice root, ameliorates imiquimod-induced psoriasis-like inflammation of BALB/c mice.Int Immunopharmacol. 2018;59:243-251.
[20] 李想,李冀.甘草提取物活性成分药理作用研究进展[J].江苏中医药,2019,51(5):81-86.
[21] Wu SC, YANG ZQ, LIU F, et al. Antibacterial effect and mode of action of flavonoids from licorice against methicillin-resistant staphylococcus aureus. Front Microbiol. 2019;10:2489.
[22] YUAN X, LI N, ZHANG M, et al. Taxifolin attenuates IMQ-induced murine psoriasis-like dermatitis by regulating T helper cell responses via Notch1 and JAK2/STAT3 signal pathways. Biomed Pharmacother. 2020;123:109747.
[23] HAUGEN J, CHANDYO RK, BROKSTAD KA, et al. Cytokine concentrations in plasma from children with severe and non-severe community acquired pneumonia. PLoS One. 2015;10(9):e0138978.
[24] PISANI LP, ESTADELLA D, RIBEIRO DA. The role of toll like receptors (TLRs) in oral carcinogenesis. Anticancer Res. 2017;37(10):5389-5394.
[25] CHEN Y, WU D, SUN L. Clinical Significance of High-Mobility Group Box 1 Protein (HMGB1) and Nod-Like Receptor Protein 3(NLRP3) in Patients with Ulcerative Colitis. Med Sci Monit. 2020;26:e919530.
[26] FREUDENSTEEIN D, LITCHFIELD C, CARAMIA F, et al. TP53 status, patient sex, and the immune response as determinants of lung cancer patient survival. Cancers (Basel). 2020;12(6):1535.
[27] DONG Z, CHEN W, CHEN C, et al. CUL3 deficiency causes social deficits and anxiety-like behaviors by impairing excitation-inhibition balance through the promotion of cap-dependent translation. Neuron. 2020;105(3):475-490.
[28] EDREES MAH, LUO J, SUN F, et al. Ubc9 deficiency selectively impairs the functionality of common lymphoid progenitors (CLPs) during bone marrow hematopoiesis. Mol Immunol. 2019;114:314-322.
[29] 黄聪,彭伟,牟茂婷,等.基于“肢节痹病”的桂枝芍药知母汤的现代药理作用探讨[J].时珍国医国药,2019,30(4):949-950.
[30] SAKELLARIOU G, SCIRE CA, ADINOLFI A, et al. Differential diagnosis of inflammatory arthropathies by musculoskeletal ultrasonography: a systematic literature review. Front Med (Lausanne). 2020;7:141.
[31] FENG K, CHEN Z, PENGCHENG L, et al. Quercetin attenuates oxidative stress-induced apoptosis via SIRT1/AMPK-mediated inhibition of ER stress in rat chondrocytes and prevents the progression of osteoarthritis in a rat model. J Cell Physiol. 2019;234(10):18192-18205.
[32] CHO IA, KIM TH, LIM H, et al. Formononetin antagonizes the interleukin-1β-induced catabolic effects through suppressing inflammation in primary rat chondrocytes. Inflammation. 2019;42(4):1426-1440.
[33] FEI J, LIANG B, JIANG C, et al. Luteolin inhibits IL-1β-induced in?ammation in rat chondrocytes and attenuates osteoarthritis progression in a rat model. Biomed Pharmacother. 2019;109:1586-1592.
[34] YAMAMOTO S, IWAKUMA T. Regulators of oncogenic mutant TP53 gain of function. Cancers (Basel). 2018;11(1):4.
[35] UHLMANN C, KUHN LM, TIGGES J, et al. Efficient modulation of TP53 expression in human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2020;52(1):e102.
[36] CAO L, BASUDAN A, SIKORA MJ, et al. Frequent amplifications of ESR1, ERBB2 and MDM4 in primary invasive lobular breast carcinoma. Cancer Lett. 2019;461:21-30.
[37] KONG Y, WANG Z, HUANG M, et al. CUL7 promotes cancer cell survival through promoting Caspase-8 ubiquitination. Int J Cancer. 2019;145(5):1371-1381.
[38] HWANG HS, LEE MH, CHOI MH, et al. NOD2 signaling pathway is involved in fibronectin fragment- induced pro-catabolic factor expressions in human articular chondrocytes. BMB Rep. 2019;52(6):373-378.
[39] PAN H, DAI H, WANG L, et al. MicroRNA-410-3p modulates chondrocyte apoptosis and inflammation by targeting high mobility group box 1 (HMGB1) in an osteoarthritis mouse model. BMC Musculoskelet Disord. 2020;21(1):486.
[40] 吴剑静,胡洛爽,叶天申,等.桂枝芍药知母汤加减结合微针刀治疗急性痛风性关节炎疗效观察[J].实用中医药杂志,2020,36(3):279-280.
[41] LI R, JIA Z, ZHU H. Regulation of Nrf2 signaling. React Oxyg Species (Apex). 2019;8(24):312-322.
[42] YANG SC, CHEN PJ, CHANG SH, et al. Luteolin attenuates neutrophilic oxidative stress and inflammatory arthritis by inhibiting Raf1 activity. Biochem Pharmacol. 2018;154:384-396.

引言

近年来，随着现代生活水平的提高和饮食结构的改变，痛风性关节炎发病率呈逐年上升趋势[1]。目前治疗痛风性关节炎的药物主要有非类固醇抗炎药、秋水仙碱和糖皮质激素等，但都存在诸多毒副反应和禁忌证[2]。随着中西医结合在痛风性关节炎治疗中的深入研究，人们逐渐开始意识到中医药在痛风性关节炎治疗中的重要性。因此发掘一种疗效确切、安全有效的治疗痛风性关节炎的方药具有非常重要的现实意义。
古籍中有关桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的记载由来已久，《金匮要略•中风历节病》篇中“诸肢节疼痛，身体魁羸，脚肿如脱，头眩短气，温温欲吐，桂枝芍药知母汤主之”。传统中医认为桂枝芍药知母汤具有温经散寒、通络止痛的作用[3]，现代药理研究表明其可通过降低血尿酸水平及炎症指标，从而改善患者关节肿痛等症状[4-5]。
虽然临床上应用桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎已取得了很好的临床疗效，但其药理作用分子机制及药效物质基础尚未明确，因此对桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的作用机制进行系统、整体研究具有非常重要的临床意义，通过药效成分的筛选，未来可将其进行蛋白支架载药缓释系统进行口服或者局部用药，可有利于患者病情的缓解，有利于中医药组织工程技术在痛风性关节炎中的临床应用。由于桂枝芍药知母汤活性成分众多，通路与靶点间关系网复杂，现有检测手段花费高及灵敏度低，故而无法精准揭示其分子药理学机制。
近些年，网络药理学方法的成熟为进一步研究中药复方潜在的有效成分与作用靶点的互作关系提供了新思路[6-8]，但与以往研究不同，文章从“单成分-单靶点”向“多基因-多靶点”的模式转变，综合分析药物-疾病-基因-靶点之间的关系，从整体角度揭示药物的作用机制，这与中医的整体观念不谋而合[9]。因此文章借助网络药理学和分子对接技术，从微观角度分析治疗痛风性关节炎的分子机制，以期为下一步研究桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的基础药理学提供方向和参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 软件与数据库见表1。

1.2 方法
1.2.1 活性成分筛选通过检索中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional
Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，对桂枝芍药知母汤(成分包括桂枝、白芍、甘草、麻黄、生姜、白术、知母、防风和附子)中每味中药的所有成分进行了筛选及构建，其中筛选条件为口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和药物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18，最终确定桂枝芍药知母汤中生物活性成分的集合。
1.2.2 活性成分靶点预测在TCMSP数据库中检索桂枝芍药知母汤中每个活性成分对应靶蛋白，并通过蛋白质数据库(Universal Protein，UniProt)查询各靶蛋白名(protein ID)，选择物种为“人类(Homo Sapiens)”，获取每个靶蛋白所对应的靶基因名(gene ID)，最后将得到的靶基因名进行合并，删除重复基因只保留惟一项，所得结果即为活性成分的预测靶点。
1.2.3 潜在作用靶点预测采用“gouty arthritis”作为关键词对常用数据库(包括GeneCards，OMIM和DigSee等)进行已知疾病靶点的检索及筛选，整合查找结果并删除重复的靶点，保留惟一项即为痛风性关节炎发病过程已知靶点。然后运用Venny平台将桂枝芍药知母汤中主要活性成分作用靶点与痛风性关节炎治疗靶点进行映射取交集，得到潜在作用靶点。
1.2.4 “单味药-活性成分-作用靶点”网络构建先分别建立每种单味药的活性成分、活性成分作用靶点、靶点与痛风性关节炎相互作用关系，并导入到Cytoscape 3.7.2 软件中，再利用该软件的“merge”工具将9种单味药的网络进行合并，构建桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的“单味药-活性成分-作用靶点”网络图。

1.2.5 蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络构建及网络拓扑分析将桂枝芍药知母汤的作用靶点导入到Bisogenet中，限定研究物种为“Homo Sapiens”获得蛋白互作关系，并运用Cytoscape软件中CytoNCA插件，设置
DC> 61和BC > 200，筛选富集程度高的蛋白互作关系，构建PPI核心网络图。
1.2.6 GO富集分析与KEGG富集分析利用DAVID数据库对潜在靶点进行基因本体论(GO)功能富集分析，研究桂枝芍药知母汤散治疗痛风性关节炎的主要生物功能；对潜在靶点进行基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，研究桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的主要信号通路，P < 0.05代表富集结果显著。最后利用R语言绘制GO及KEGG富集分析气泡图。
1.2.7 KEGG关系网络构建先分别建立通路与基因之间的相互作用关系和节点属性与基因之间的相互作用关系，并导入Cytoscape 3.7.2软件中，选取前20个KEGG信号通路，构建桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的“KEGG-基因”关系网络图。
1.2.8 分子对接利用Chem Office软件制作关键化合物的3D结构，再从PDB数据库下载核心蛋白基因的3D结构，利用PyMOL软件对蛋白质进行去水、去磷酸根等操作，利用Auto Dock 1.5.6软件将化合物及核心蛋白基因pdb格式转为pdbqt格式并寻找活性口袋，最后运行Vina进行对接。根据结合能大小来评估两者的结合活性，选取结合能≤
−5.0 kJ/mol作为筛选依据，以评价网络分析预测的可靠性。
1.3 主要观察指标 ①桂枝芍药知母汤活性成分及其作用靶点；②“单味药-活性成分-作用靶点”网络；③关键靶点的PPI网络、GO和KEGG富集结果；④关键靶点在桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎相关通路中的分布情况；⑤关键活性成分和关键靶点。

讨论

中医学将痛风性关节炎归属于“痹症”范畴，首见于《内经》，且在《素问·痹论篇》中记载“风、寒、湿三气杂至，合而为痹”，描述其病因病机为风寒湿邪滞留。张仲景《金匮要略·中风历节病》篇：“诸肢节疼痛，身体魁羸，脚肿如脱，头眩短气，温温欲吐，桂枝芍药知母汤主之”。临床上桂枝芍药知母汤用于治疗痛风性关节炎由来已久，其可通过降低血尿酸水平及炎症指标，从而改善患者关节肿痛等症状，但作用机制尚未明确，因此文章借助网络药理学和分子对接技术，从微观角度分析治疗痛风性关节炎的分子机制，以期为下一步研究桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的基础药理学提供方向和参考。
文章初步筛选获得桂枝芍药知母汤201个潜在活性成分和24个桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的潜在作用靶点。单味药-活性成分-作用靶点网络显示槲皮黄素、芒柄花黄素、木犀草素、3’-甲氧基光甘草定和花旗松素能匹配到较多靶点。蛋白互作网络表明TP53、NTRK1、CUL3、雌激素受体1和UBC可能是桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的关键靶点。分子对接结果显示关键活性成分与关键靶点间具有较好的结合活性，进一步验证了该研究的预测较为可靠。KEGG通路富集结果分析，白细胞介素17通路、肿瘤坏死因子通路、AGE-RAGE通路、NOD样受体通路、核转录因子κB通路和Toll样受体通路等直接或者间接参与痛风性关节炎的形成。与以往研究不同，文章根据GO分析结果获得的846个与痛风性关节炎发生发展过程密切相关细胞成分，分子功能及作用的生物学过程，并结合既往痛风性关节炎发病现代机制及桂枝芍药知母汤治疗关节炎的文章[10-13]，总结归纳出桂枝芍药主要通过参与调控免疫-炎症反应、软骨细胞增殖分化与凋亡、抗氧化应激反应能力3大作用机制，从而发挥治疗痛风性关节炎的作用。
痛风性关节炎是一种滑膜组织中MSU晶体沉积介导的免疫炎性疾病，这是痛风发作的关键病理因素，其炎症的发生与白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6等炎症因子密切相关。因此，调控免疫-炎症反应是改善痛风性关节炎患者临床症状的主要途径[14]。有临床研究表明桂枝芍药知母汤可有效减轻痛风性关节炎患者机体炎症因子反应[15]，但具体分子机制尚未明确。主要活性成分槲皮黄素、芒柄花黄素、木犀草素、3’-甲氧基光甘草定和花旗松素均可抑制白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α等炎症细胞因子的产生和表达，从而提高人体免疫应答，达到镇痛和抗炎作用[16-21]。GO分析结果显示，桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的机制涉及对脂多糖的反应及对细菌来源分子的反应、细胞对生物刺激的反应、炎症反应的调节等，这些反应也均与人体免疫炎症反应息息相关。结果显示白细胞介素17通路可调控白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和核转录因子κB等炎症因子的表达从而发挥治疗痛风性关节炎的作用。肿瘤坏死因子通路通过介导嗜酸性粒细胞、淋巴细胞可调控白细胞介素1和白细胞介素6等炎症因子，从而影响机体炎症反应程度[22]。AGE-RAGE通路与炎症的发生有着密切联系，它可上调MAPK磷酸化水平，促进肿瘤坏死因子α、白细胞介素1和白细胞介素6等炎症因子的表达[23]。NOD样受体通路、核转录因子κB通路、Toll样受体通路均与炎性疾病有着非常紧密的关系，这些通路激活可促进白细胞介素1和肿瘤坏死因子α等炎症细胞因子的表达[24-25]。蛋白互作网络获取的核心蛋白TP53与细胞免疫浸润水平密切相关，直接影响人体免疫应答能力[26]，CUL3突变会激活ikkβ/核转录因子κB等信号通路，改善炎症相关疾病的临床症状[27]，UBC缺失会损害骨髓中淋巴样祖细胞的发育，干扰它们分化为淋巴细胞的潜能，从而减少了外周血T/B细胞数量，降低人体的免疫及免疫调节等功能[28]。因此，作者认为桂枝芍药知母汤主要在炎症和免疫调节方面发挥作用，通过作用于多成分-多靶点-多通路来调控血液中的炎症因子、调整人体免疫功能，同时抑制人体炎症反应，从而达到治疗痛风性关节炎效果。
现代药理学研究表明桂枝芍药知母汤具有抗骨损伤、调控细胞凋亡等作用，从而达到保护骨关节、缓解骨关节损伤的作用[29]。软骨细胞对于关节软骨基质的分泌、功能维持具有至关重要的作用，研究表明在痛风性关节炎发展过程中关节软骨常受到破坏，软骨细胞的凋亡与关节软骨基质分泌减少密切相关[30]。有研究证明槲皮黄素可通过消除软骨变性和减少膝关节软骨细胞凋亡从而达到保护关节的作用[31]，芒柄花黄素与木犀草素均可有效促进关节软骨基质分泌，抑制白细胞介素1β诱导的炎症分解代谢作用，改善关节软骨蜕变[32-33]。TP53通过对细胞分裂和增殖进行调控，影响多种细胞的应激反应和靶基因表达，诱导细胞衰老和凋亡[34-35]，而雌激素受体1基因异常表达会使TP53靶基因激活，进一步加快细胞凋亡速度[36]。研究表明痛风性关节炎发生时会引起软骨细胞凋亡，从而导致关节软骨基质分泌减少引起关节退变[37]，因此作者认为TP53与雌激素受体1可能通过调节软骨细胞凋亡延缓痛风性关节炎关节退变，减轻关节疼痛。而在调节通路方面，桂枝桂枝芍药主要调节NOD样受体通路、核转录因子κB通路和Toll样受体通路以调控软骨细胞增殖、分化与凋亡。NOD2信号通路及TLR-2信号通路可影响关节软骨细胞分解代谢，两者之间的交叉调节通路可能是预防关节炎发展和进展的有用靶标[38]，同时核转录因子κB通路可调控软骨细胞凋亡从而影响骨关节炎的发展[39]。因此，作者认为桂枝芍药知母汤可通过调控软骨细胞增殖、分化与凋亡，从而缓解痛风性关节炎患者关节软骨破坏情况，同时也可以缓解软骨细胞凋亡产生的内毒素诱发的脂多糖反应，从而进一步缓解痛风性关节炎的炎症反应，显著改善患者临床症状。
临床研究表明桂枝芍药知母汤加减结合微针刀可提高机体抗氧化应激反应，减低痛风石形成的概率，提高临床治疗效果，改善痛风性关节炎患者的临床症状[40]。痛风性关节炎患者往往会出现血尿酸升高，而血尿酸升高会激活核转录因子κB信号途径，核转录因子κB蛋白在受到血尿酸升高因素刺激时，第一时间激活体内氧化应激反应，上调Toll受体4表达激活巨噬细胞，释放炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素8，从而进一步激活白细胞介素17通路、肿瘤坏死因子通路和Toll样受体通路的表达，诱发炎症反应，因此提高人体抗氧化应激能力在痛风性关节炎发生发展过程中起着关键作用。人体抗氧化应激能力大小则受抗氧化剂基因表达水平的调节，而核因子E2相关因子2已被确定为多种抗氧化剂基因的主要调节剂，其活性受到核转录因子κB、TP53和CUL3蛋白水平的影响[41]，上述3种蛋白恰好是桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的关键靶点蛋白。文章筛选得到桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的主要活性成分槲皮素、芒柄花黄素、花旗松素及木犀草素均可提高人体细胞的抗氧化应激能力，从而减轻炎症反应和关节软骨退变情况[31-32，42]。
此外该研究尚存在一些缺点：首先，由于筛选条件的限制，只能分析桂枝芍药知母汤的主要作用靶点，在一定程度上使得研究结果具有局限性；其次，通过网络药理学虽然能够筛选出大量靶点和通路，但仍需结合体内外实验进一步验证，以阐明桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的分子作用机制，促进中医药临床研究的科学化，加快中药现代化发展。
总之，通过网络药理学和分子对接技术对桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的潜在作用机制进行分析，结果表明桂枝芍药知母汤各有效成分与其作用的靶点之间存在密切的协同关系、良好的结合活性，为今后研究桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的分子机制提供新的思路和方向，桂枝芍药知母汤中各有效成分有望成为治疗痛风性关节炎的新型有效药物；同时从侧面反映出中医药治疗疾病具有多成分、多靶点、多信号通路的特色，这提示在临床治疗痛风性关节炎的过程中，除了对关键通路及靶点蛋白进行干预的同时，还要结合疾病病因，患者所处环境等进行多因素、多靶点干预，这与中医药辨证论治，治病求本的特点相符。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

网络药理学结合分子对接技术揭示桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的潜在分子机制

Potential molecular mechanism of Guizhi Shaoyao Zhimu Decoction in the treatment of gouty arthritis based on network pharmacology and molecular docking

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 11

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王建平, 张晓辉, 余进伟, 魏绍亮, 张新民, 许幸新, 曲海军. 三维图像配准及坐标变换膝关节运动分析在机构学中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-5.
[2]	谭新访, 郭艳幸, 秦晓飞, 张斌清, 赵东亮, 潘琨琨, 李瑜卓, 陈皓宇. 顺轴疲劳运动对兔髌股关节软骨损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(在线): 1-6.
[3]	张吉超, 董跃福, 牟志芳, 张震, 李冰言, 徐祥钧, 李佳意, 任梦, 董万鹏. 骨关节炎患者在不同步态角度下膝关节内部生物力学变化的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1357-1361.
[4]	白子兴, 曹旭含, 孙承颐, 杨艳军, 陈思, 温建民, 林新晓, 孙卫东. 步态周期中踝关节有限元模型的构建及生物力学分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1362-1366.
[5]	薛亚东, 周新社, 裴立家, 孟繁宇, 李键, 王金子. 自体髂骨块联合钛板重建Paprosky Ⅲ型髋臼骨缺损为假体提供坚强的初始固定#br#[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1424-1428.
[6]	庄至坤, 吴荣凯, 林行会, 龚志兵, 张前进, 魏秋实, 张庆文, 吴昭克. 稳定增强型内衬髋关节系统在偏瘫老年股骨颈骨折全髋关节置换中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1429-1433.
[7]	金涛, 刘林, 朱晓燕, 史宇悰, 牛建雄, 张同同, 吴树金, 杨青山. 骨关节炎与线粒体异常[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1452-1458.
[8]	张立创, 徐浩, 马迎辉, 熊梦婷, 韩海慧, 鲍嘉敏, 翟伟韬, 梁倩倩. 免疫调控淋巴回流功能治疗类风湿关节炎的机制及前景[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1459-1466.
[9]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[10]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[11]	吴冰霜, 汪志, 唐懿, 唐晓俞, 李棋. 前交叉韧带重建：从腱骨止点到腱骨愈合的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1293-1298.
[12]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[13]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[14]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[15]	高俞锦, 彭双麟, 马治超, 陆诗, 曹花月, 王浪, 肖金刚. 糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 999-1004.