脂多糖刺激小鼠MLO-Y4骨细胞白细胞介素6及核因子κB受体活化因子
配体的表达

doi:10.12307/2022.608

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (20): 3121-3126.doi: 10.12307/2022.608

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脂多糖刺激小鼠MLO-Y4骨细胞白细胞介素6及核因子κB受体活化因子配体的表达

刘奇奇1，刘敏2，杨健1，余科1

西南医科大学附属口腔医院，1种植科，2修复科，四川省泸州市 646000

收稿日期:2021-07-06 接受日期:2021-08-19 出版日期:2022-07-18 发布日期:2022-01-18
通讯作者: 余科，博士，副教授，西南医科大学口腔医学院附属口腔医院口腔种植科，四川省泸州市 646000
作者简介:刘奇奇，男，1994 年生，重庆市人，汉族，西南医科大学在读硕士，主要从事口腔种植临床与基础研究。
基金资助:
四川省教育厅2017年科研计划(17ZB0481)，项目负责人：余科；中国口腔医学会西部口腔医学临床研究基金(CSA-W2018-03)，项目负责人：余科；泸州市人民政府-西南医科大学战略合作项目(2020LZXNYDJ31)，项目负责人：余科

Lipopolysaccharide stimulates the expression of interleukin-6 and nuclear factor kappa B receptor activator ligand in mouse MLO-Y4 osteoblasts

Liu Qiqi1, Liu Min2, Yang Jian1, Yu Ke1

1Department of Oral Implantology, 2Department of Prosthodontics, School/Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2021-07-06 Accepted:2021-08-19 Online:2022-07-18 Published:2022-01-18
Contact: Yu Ke, MD, Associate professor, Department of Oral Implantology, School/Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Liu Qiqi, Master candidate, Department of Oral Implantology, School/Hospital of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the 2017 Scientific Research Plan of the Educational Department of Sichuan Province, No. 17ZB0481 (to YK); Western Stomatology Clinical Research Fund of Chinese Stomatological Association, No. CSA-W2018-03 (to YK); the Luzhou Municipal People’s Government - Southwest Medical University Strategic Cooperation Project, No. 2020LZXNYDJ31 (to YK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脂多糖：是革兰阴性细菌内毒素的主要活性成分，在炎症性骨吸收中发挥着重要作用，可诱导多种炎性细胞因子，如白细胞介素1/6、前列腺素等。脂多糖由类脂A、核心多糖、O-抗原组成，主要与存在于宿主细胞细胞膜表面的Toll样受体相结合，而Toll家族与炎性细胞因子表达有关，在炎症免疫中起着重要作用。
PI3K/AKT信号通路：在调控各种不同细胞功能(包括代谢、生长、增殖、存活、转录及蛋白质合成)方面发挥重要作用。PI3K是由调节亚基p85和催化亚基p110构成的二聚体，当它与细胞因子受体结合后可改变AKT的蛋白结构并使其活化，并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物及其他信号转导途径。在脂多糖的刺激下，PI3K/AKT信号通路可以介导多种炎性细胞因子的产生。

背景：前期研究证实，脂多糖刺激小鼠MLO-Y4骨细胞上调炎症相关细胞因子白细胞介素6的表达，白细胞介素6上调破骨细胞生成相关因子核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)的表达，而PI3K/AKT信号通路是骨代谢中的重要调节通路，验证其是否参与脂多糖诱导骨细胞炎症因子的产生，对研究细菌炎症性骨吸收的机制具有重要意义。
目的：验证PI3K/AKT信号通路是否参与脂多糖刺激下小鼠MLO-Y4 骨细胞白细胞介素6及RANKL的表达。
方法：①分别以0，100 µg/L的脂多糖刺激MLO-Y4骨细胞，1，2，4，6，8 h后，采用RT-qPCR检测白细胞介素6和RANKL的mRNA表达，Western blot法检测RANKL和p-AKT蛋白表达；②取对数生长期的MLO-Y4骨细胞，分7组处理：不做任何处理(对照组)、100 µg/L脂多糖、 1 µmol/L PI3K抑制剂+100 µg/L脂多糖、2.5 µmol/L PI3K抑制剂+100 µg/L脂多糖、5 µmol/L PI3K抑制剂+100 µg/L脂多糖、10 µmol/L PI3K抑制剂+100 µg/L脂多糖、20 µmol/L PI3K抑制剂+100 µg/L脂多糖，采用RT-qPCR检测白细胞介素6和RANKL的mRNA表达；③将MLO-Y4骨细胞分4组处理：不做任何处理(对照组)、100 µg/L脂多糖、二甲基亚砜+100 µg/L脂多糖、10 µmol/L PI3K抑制剂+100 µg/L脂多糖，采用RT-qPCR检测RANKL的mRNA表达，Western blot法检测RANKL与p-AKT蛋白表达。
结果与结论：①脂多糖刺激后，骨细胞内白细胞介素6与RANKL的mRNA表达呈先升高后降低的趋势，各时间点的两基因表达量均高于无脂多糖刺激组(P < 0.05)；骨细胞内RANKL和p-AKT蛋白表达呈先升高后降低的趋势，各时间点的两蛋白表达量均高于无脂多糖刺激组(P < 0.05)；②1-10 µmol/L的PI3K抑制剂呈浓度依赖性降低脂多糖诱导的骨细胞白细胞介素6和RANKL的 mRNA表达量升高，浓度越高降低效果越明显，当浓度达到20 µmol/L时降低效果与10 µmol/L无明显差异；③二甲基亚砜与PI3K抑制剂均可降低脂多糖刺激诱导的骨细胞RANKL蛋白与mRNA表达量的升高，降低脂多糖刺激诱导的骨细胞p-AKT蛋白表达，其中以PI3K抑制剂的降低效果更明显；④结果表明，PI3K/AKT信号通路参与了脂多糖刺激小鼠MLO-Y4骨细胞白细胞介素6和RANKL的表达。
缩略语：核因子κB受体活化因子配体：receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL

https://orcid.org/0000-0001-7677-9901 (刘奇奇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨细胞, 白细胞介素6, 脂多糖, PI3K/AKT, 核因子κB受体活化因子配体, 骨吸收, 磷酸化, PI3K抑制剂

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have confirmed that lipopolysaccharide could up-regulated the expression of interleukin-6, an inflammation-related cytokine, in mouse MLO-Y4 osteocytes, and interleukin-6 could further up-regulate the expression of receptor activator of nuclear factor κB ligand (RANKL), a factor related to osteoclastogenesis, in osteoblasts. PI3K/AKT signaling pathway is an important regulatory pathway in bone metabolism. Verifying whether this signaling pathway is involved in the production of inflammatory factors induced by lipopolysaccharides is greatly beneficial to studying the mechanism of bone resorption that is caused by bacterial inflammation.
OBJECTIVE: To verify whether PI3K/AKT signaling pathway is involved in the expression of interleukin-6 and RANKL in mouse MLO-Y4 osteocytes stimulated by lipopolysaccharides.
METHODS: MLO-Y4 osteoblasts were stimulated with 0 or 100 µg/L lipopolysaccharides for 1, 2, 4, 6, and 8 hours. Then the mRNA expressions of interleukin-6 and RANKL were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction, and the protein expression of RANKL and p-AKT were detected by western blot. MLO-Y4 osteocytes in logarithmic growth was divided into seven groups: no treatment group (control group), 100 µg/L lipopolysaccharide group, 1 µmol/L PI3K inhibitor+100 µg/L lipopolysaccharide group, 2.5 µmol/L PI3K inhibitor+100 µg/L lipopolysaccharide group, 5 µmol/L PI3K inhibitor+100 µg/L lipopolysaccharide group, 10 µmol/L PI3K inhibitor+100 µg/L lipopolysaccharide group, 20 µmol/L PI3K inhibitor+100 µg/L lipopolysaccharide group. Real-time quantitative polymerase chain reaction was used to detect the mRNA expression of interleukin 6 and RANKL. MLO-Y4 osteocytes were divided into four groups: no treatment group (control group), 100 µg/L lipopolysaccharide group, dimethyl sulfoxide+100 µg/L lipopolysaccharide group, and 10 µmol/L PI3K inhibitor+100 µg/L lipopolysaccharide group. Real-time quantitative polymerase chain reaction was used to detect the mRNA expression of RANKL, and western blot was used to detect the protein expression of RANKL and p-AKT.
RESULTS AND CONCLUSION: After lipopolysaccharide stimulation, the mRNA expression of interleukin-6 and RANKL in osteocytes was increased first and then decreased; however, the mRNA expression levels were higher than those in the control group at each time point (P < 0.05). After lipopolysaccharide stimulation, the protein expression of RANKL and p-AKT in osteocytes was significantly higher than that in the control group (P < 0.05) at each time point, although the protein expression in lipopolysaccharide groups was increased first and then decreased. PI3K inhibitor of 1-10 µmol/L could decrease the mRNA expression of interleukin 6 and RANKL in lipopolysaccharide-induced osteocytes in a concentration-dependent manner, while 20 and 10 µmol/L PI3K inhibitor showed similar effects. Both dimethyl sulfoxide and PI3K inhibitors could inhibit the increase in the protein and mRNA expression of RANKL and the protein expression of p-AKT in osteocytes induced by lipopolysaccharide. Furthermore, PI3K inhibitor showed the better inhibitory effect. These results indicate that lipopolysaccharide stimulates the expression of interleukin-6 and RANKL in mouse MLO-Y4 osteocytes through the PI3K/AKT signaling pathway.

Key words: osteocyte, interleukin-6, lipopolysaccharide, PI3K/AKT, receptor activator of nuclear factor-κB ligand, bone resorption, phosphorylation, PI3K inhibitor

中图分类号:

刘奇奇, 刘敏, 杨健, 余科. 脂多糖刺激小鼠MLO-Y4骨细胞白细胞介素6及核因子κB受体活化因子配体的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(20): 3121-3126.

Liu Qiqi, Liu Min, Yang Jian, Yu Ke. Lipopolysaccharide stimulates the expression of interleukin-6 and nuclear factor kappa B receptor activator ligand in mouse MLO-Y4 osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(20): 3121-3126.

图/表（结果） 6

2.1 脂多糖上调骨细胞白细胞介素6 和RANKL的mRNA表达脂多糖处理后，骨细胞白细胞介素6与RANKL 的mRNA表达显著升高，白细胞介素6 mRNA表达于2 h达峰值，RANKL mRNA表达于4 h达峰值，脂多糖处理不同时间点的细胞白细胞介素6与RANKL mRNA表达均高于对照组(P < 0.05)，并且脂多糖处理不同时间点间的细胞白细胞介素6与RANKL mRNA表达比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.2 脂多糖上调骨细胞RANKL和 p-AKT/AKT蛋白的表达脂多糖处理后，骨细胞RANKL与p-AKT蛋白表达显著升高，于6 h两种蛋白表达达峰值，脂多糖处理不同时间点的RANKL与p-AKT蛋白表达均高于对照组(P < 0.05)，脂多糖处理不同时间点的AKT蛋白与对照组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见图2。

由于AKT磷酸化激活PI3K/AKT信号途径，实验分析p-AKT/AKT蛋白比率以确定PI3K/AKT在脂多糖刺激白细胞介素6和RANKL表达中的作用。与对照组比较，脂多糖处理1 h后的p-AKT/AKT蛋白比率增加(P < 0.05)，6 h后的p-AKT/AKT蛋白比率显著高于其他时间点(P < 0.05)，然后p-AKT/AKT蛋白比率下降，各时间点间两两比较均差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图2。
2.3 PI3K抑制剂降低脂多糖诱导的骨细胞白细胞介素6和RANKL mRNA表达与对照组比较，脂多糖处理后骨细胞的白细胞介素6和RANKL mRNA表达显著升高(P < 0.05)。与单独脂多糖处理比较，不同浓度的LY294002预处理+脂多糖处理组骨细胞的白细胞介素6和RANKL mRNA表达显著降低(P < 0.05)；其中10 μmol/L LY294002预处理+脂多糖处理组与20 μmol/L LY294002预处理+脂多糖处理组骨细胞的白细胞介素6和RANKL mRNA表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但均低于其他浓度LY294002预处理+脂多糖处理组(P < 0.05)，见图3。

表明可以通过对PI3K的抑制可下调脂多糖刺激下白细胞介素6和RANKL的表达，见图4。

2.4 二甲基亚砜对骨细胞增殖的影响二甲基亚砜处理骨细胞不同时间点的增殖吸光度值与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

2.5 LY294002或二甲基亚砜对脂多糖诱导骨细胞RANKL表达与AKT磷酸化的影响与对照组比较，脂多糖组骨细胞的RANKL mRNA和蛋白表达显著升高(P < 0.05)，p-AKT蛋白表达升高(P < 0.05)。与脂多糖组比较，二甲基亚砜组骨细胞的RANKL mRNA和蛋白表达显著降低(P < 0.05)，p-AKT蛋白表达显著降低(P < 0.05)，但是并未降到对照组的水平，与对照组比较差异仍有显著性意义(P < 0.05)，说明二甲基亚砜部分阻断了PI3K/AKT信号通路。与脂多糖组比较，LY294002组骨细胞的RANKL mRNA和蛋白表达显著降低(P < 0.05)，p-AKT蛋白表达显著降低(P < 0.05)，但是RANKL表达并未降到对照组的水平，与对照组比较差异仍有显著性意义(P < 0.05)，说明10 μmol/L的LY294002可完全抑制AKT的磷酸化，但不能完全阻断脂多糖诱导的RANKL表达，见图6。

参考文献

[1] BRONZATO JD, DAVIDIAN MES, DE CASTRO M, et al. Bacteria and virulence factors in periapical lesions associated with teeth following primary and secondary root canal treatment. Int Endod J. 2021;54(5):660-671.
[2] 刘大勇,王梅蕊,兰玲玲,等.脂多糖干预卵巢切除小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力[J].中国组织工程研究,2014,18(14):2219-2225.
[3] 余科,吴湘楠,刘文佳,等. LPS刺激小鼠骨细胞RANKL/OPG和IL-6表达的实验研究[J].口腔医学研究,2016(3):220-223.
[4] YU K, MA Y, LI X, et al. Lipopolysaccharide increases IL-6 secretion via activation of the ERK1/2 signaling pathway to up-regulate RANKL gene expression in MLO-Y4 cells. Cell Biol Int. 2017;41(1):84-92.
[5] GALARRAGA-VINUEZA ME, DOHLE E, RAMANAUSKAITE A, et al. Anti-inflammatory and macrophage polarization effects of Cranberry Proanthocyanidins (PACs) for periodontal and peri-implant disease therapy. J Periodontal Res. 2020;55(6):821-829.
[6] LI G, LIU Y, MENG F, et al. LncRNA MEG3 inhibits rheumatoid arthritis through miR-141 and inactivation of AKT/mTOR signalling pathway. J Cell Mol Med. 2019; 23(10):7116-7120.
[7] ZHAO X, ALQWBANI M, LUO Y, et al. Glucocorticoids decreased Cx43 expression in osteonecrosis of femoral head: The effect on proliferation and osteogenic differentiation of rat BMSCs. J Cell Mol Med. 2021;25(1):484-498.
[8] KITAURA H, MARAHLEH A, OHORI F, et al. Osteocyte-Related Cytokines Regulate Osteoclast Formation and Bone Resorption. Int J Mol Sci. 2020;21(14):5169.
[9] FENG W, GUO J, LI M. RANKL-independent modulation of osteoclastogenesis. J Oral Biosci. 2019;61(1):16-21.
[10] AMIN N, BOCCARDI V, TAGHIZADEH M, et al. Probiotics and bone disorders: the role of RANKL/RANK/OPG pathway. Aging Clin Exp Res. 2020;32(3):363-371.
[11] Martin TJ, Sims NA. RANKL/OPG; Critical role in bone physiology. Rev Endocr Metab Disord. 2015;16(2):131-139.
[12] JIANG J, JIA Y, LU X, et al. Vitexin suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis and prevents lipopolysaccharide (LPS)-induced osteolysis. J Cell Physiol. 2019; 234(10):17549-17560.
[13] FANG L, WANG KK, HUANG Q, et al. Nucleolin Mediates LPS-induced Expression of Inflammatory Mediators and Activation of Signaling Pathways. Curr Med Sci. 2020;40(4):646-653.
[14] CHAE BS. Pretreatment of Low-Dose and Super-Low-Dose LPS on the Production of In Vitro LPS-Induced Inflammatory Mediators. Toxicol Res. 2018;34(1):65-73.
[15] LEE GL, YEH CC, WU JY, et al. TLR2 Promotes Vascular Smooth Muscle Cell Chondrogenic Differentiation and Consequent Calcification via the Concerted Actions of Osteoprotegerin Suppression and IL-6-Mediated RANKL Induction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2019;39(3):432-445.
[16] KIM HJ, KIM HJ, CHOI Y, et al. Zoledronate Enhances Osteocyte-Mediated Osteoclast Differentiation by IL-6/RANKL Axis. Int J Mol Sci. 2019;20(6):1467.
[17] MCGREGOR NE, MURAT M, ELANGO J, et al. IL-6 exhibits both cis- and trans-signaling in osteocytes and osteoblasts, but only trans-signaling promotes bone formation and osteoclastogenesis. J Biol Chem. 2019;294(19):7850-7863.
[18] BEZERRA MÉS, BARBERINO RS, MENEZES VG, et al. Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) promotes primordial follicle growth and reduces DNA fragmentation through the phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/AKT) signalling pathway. Reprod Fertil Dev. 2018;30(11):1503-1513.
[19] DENG S, DAI G, CHEN S, et al. Dexamethasone induces osteoblast apoptosis through ROS-PI3K/AKT/GSK3β signaling pathway. Biomed Pharmacother. 2019;110:602-608.
[20] MA Y, RAN D, ZHAO H, et al. Cadmium exposure triggers osteoporosis in duck via P2X7/PI3K/AKT-mediated osteoblast and osteoclast differentiation. Sci Total Environ. 2021;750:141638.
[21] DA Y, MOU Y, WANG M, et al. Mechanical stress promotes biological functions of C2C12 myoblasts by activating PI3K/AKT/mTOR signaling pathway. Mol Med Rep. 2020;21(1):470-477.
[22] SONG F, WANG Y, JIANG D, et al. Cyclic Compressive Stress Regulates Apoptosis in Rat Osteoblasts: Involvement of PI3K/Akt and JNK MAPK Signaling Pathways. PLoS One. 2016;11(11):e0165845.
[23] LI ST, DAI Q, ZHANG SX, et al. Ulinastatin attenuates LPS-induced inflammation in mouse macrophage RAW264.7 cells by inhibiting the JNK/NF-κB signaling pathway and activating the PI3K/Akt/Nrf2 pathway. Acta Pharmacol Sin. 2018; 39(8):1294-1304.
[24] ZHONG Z, CHEN A, FA Z, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells upregulate PI3K/AKT pathway and down-regulate NF-κB pathway by secreting glial cell-derived neurotrophic factors to regulate microglial polarization and alleviate deafferentation pain in rats. Neurobiol Dis. 2020;143:104945.
[25] PROSSOMARITI A, PIAZZI G, ALQUATI C, et al. Are Wnt/β-Catenin and PI3K/AKT/mTORC1 Distinct Pathways in Colorectal Cancer? Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2020;10(3):491-506.
[26] YAN L, LU L, HU F, et al. Piceatannol attenuates RANKL-induced osteoclast differentiation and bone resorption by suppressing MAPK, NF-κB and AKT signalling pathways and promotes Caspase3-mediated apoptosis of mature osteoclasts. R Soc Open Sci. 2019;6(6):190360.
[27] BONEWALD LF. Establishment and characterization of an osteocyte-like cell line, MLO-Y4. J Bone Miner Metab. 1999;17(1): 61-65.
[28] LIN CN, DING SJ, CHEN CC. Synergistic Photoantimicrobial Chemotherapy of Methylene Blue-Encapsulated Chitosan on Biofilm-Contaminated Titanium. Pharmaceuticals (Basel). 2021;14(4):346.
[29] DOUGALL WC, GLACCUM M, CHARRIER K, et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes Dev. 1999;13(18):2412-2424.
[30] MARAHLEH A, KITAURA H, OHORI F, et al. TNF-α Directly Enhances Osteocyte RANKL Expression and Promotes Osteoclast Formation. Front Immunol. 2019;10: 2925.
[31] KIM HN, XIONG J, MACLEOD RS, et al. Osteocyte RANKL is required for cortical bone loss with age and is induced by senescence. JCI Insight. 2020;5(19):e138815.
[32] UCHIBORI S, SEKIYA T, SATO T, et al. Suppression of tooth movement-induced sclerostin expression using β-adrenergic receptor blockers. Oral Dis. 2020;26(3): 621-629.
[33] ALQRANEI MS, CHELLAIAH MA. Osteoclastogenesis in periodontal diseases: Possible mediators and mechanisms. J Oral Biosci. 2020;62(2):123-130.
[34] TERAMACHI J, INAGAKI Y, SHINOHARA H, et al. PKR regulates LPS-induced osteoclast formation and bone destruction in vitro and in vivo. Oral Dis. 2017; 23(2):181-188.
[35] MENDOZA MC, ER EE, BLENIS J. The Ras-ERK and PI3K-mTOR pathways: cross-talk and compensation. Trends Biochem Sci. 2011;36(6):320-328.
[36] EVANGELISTI C, CHIARINI F, CAPPELLINI A, et al. Targeting Wnt/β-catenin and PI3K/Akt/mTOR pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia. J Cell Physiol. 2020;235(6):5413-5428.
[37] DE SANTIS MC, GULLUNI F, CAMPA CC, et al. Targeting PI3K signaling in cancer: Challenges and advances. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 2019;1871(2):361-366.
[38] JOHNSON GE, IVANOV VN, HEI TK. Radiosensitization of melanoma cells through combined inhibition of protein regulators of cell survival. Apoptosis. 2008;13(6):790-802.
[39] XIE Y, SHI X, SHENG K, et al. PI3K/Akt signaling transduction pathway, erythropoiesis and glycolysis in hypoxia (Review). Mol Med Rep. 2019;19(2):783-791.
[40] SUN K, LUO J, GUO J, et al. The PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in osteoarthritis: a narrative review. Osteoarthritis Cartilage. 2020;28(4):400-409.
[41] MANNING BD, TOKER A. AKT/PKB Signaling: Navigating the Network. Cell. 2017; 169(3):381-405.
[42] CHEN H, ZHOU L, WU X, et al. The PI3K/AKT pathway in the pathogenesis of prostate cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 2016;21:1084-1091.
[43] BAI L, GAO J, WEI F, et al. Therapeutic Potential of Ginsenosides as an Adjuvant Treatment for Diabetes. Front Pharmacol. 2018;9:423.
[44] HOARE A, SOTO C, ROJAS-CELIS V, et al. Chronic Inflammation as a Link between Periodontitis and Carcinogenesis. Mediators Inflamm. 2019;2019:1029857.

引言

脂多糖是革兰阴性细菌内毒素的主要活性成分，研究表明其与多种炎症性骨吸收有关，如慢性根尖周炎[1]、牙周炎[2]、种植体周围骨吸收[3-5]、类风湿性关节炎[6]、骨坏死[7]，然而，脂多糖引起炎性骨吸收的机制仍未完全清楚。骨吸收是由骨重建过程中成骨细胞和破骨细胞功能不平衡或溶解性疾病中破骨细胞活性增强引起的[8]，因此越来越多的研究集中于脂多糖如何诱导破骨细胞的生成。破骨细胞生成的关键因子有核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)[9-10]、肿瘤坏死因子家族成员[8]。RANKL主要来源于成骨谱系细胞，包括成骨细胞和骨细胞，但哪种成骨谱系细胞产生的RANKL水平更高仍存在争议[11]。研究表明脂多糖诱导的骨吸收可通过降低RANKL的表达来抑制[12]，因此可以认为RANKL是炎性骨吸收中的关键细胞因子。
虽然已有研究证实脂多糖可诱导骨细胞表达RANKL[4]，但该过程中涉及的信号传导途径仍未完全清楚。基于现有研究，Toll样受体是各种细胞中(包括成骨细胞和骨细胞)脂多糖的经典受体，当脂多糖与成骨谱系细胞中的Toll样受体结合时一系列信号通路被激活，并且诱导骨重塑细胞因子的表达，例如白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8、骨涎蛋白、前列腺素E2、肿瘤坏死因子α和基质金属蛋白酶[13-14]。其中白细胞介素6可以诱导骨组织中的RANKL表达[15]，并通过促进RANKL活性来增强骨细胞介导的破骨细胞生成[16-17]，因此，骨细胞中脂多糖-白细胞介素6-RANKL途径成为研究脂多糖诱导骨吸收疾病的焦点。前期研究证实ERK1/2信号通路参与了脂多糖诱导骨细胞白细胞介素6的分泌，白细胞介素6通过自分泌的方式进一步刺激骨细胞表达RANKL[4]；然而，当ERK1/2信号通路被阻断时，脂多糖诱导骨细胞中白细胞介素6和RANKL表达的上调未被完全抑制，表明可能还有其他信号通路参与其中[4]。
PI3K/AKT信号通路是骨生物学中与细胞凋亡[18]、成骨细胞增殖和分化[19]、破骨细胞产生和活化有关的重要信号转导途径[20]，该途径由机械应力[21]、循环压缩力[22]、脂多糖激活[23]，随后激活下游核因子κB信号通路[24]，并表现出与经典Wnt/β-连环蛋白信号传导途径的串话[25]。研究表明，PI3K/AKT不仅与脂多糖诱导的白细胞介素6表达有关，而且与RANKL的产生有关，当脂多糖刺激的AKT活化被抑制时白细胞介素6在成骨样细胞中的表达也被抑制[26]。鉴于PI3K/AKT信号通路在骨代谢中的重要性，实验将验证其是否参与了脂多糖刺激骨细胞白细胞介素6和RANKL的表达，以丰富脂多糖诱导的炎症性骨吸收的机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，计量资料采用单因素ANOVA分析。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2021年2月在西南医科大学口腔颌面修复重建和再生实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞细胞系MLO-Y4来源于Lynda F.Bonewald博士(密苏里州堪萨斯城密苏里大学口腔生物学系，美国)惠赠[27]，该细胞系为Y4小鼠长骨中分离的骨细胞。
1.3.2 主要试剂 α-MEM培养基购自美国HyClone公司；小牛血清和胎牛血清均购自杭州四季青公司；胰酶和LY294002 (PI3K抑制剂)购自上海碧云天生物技术有限公司；胶原购自美国Biosciences公司；脂多糖、链霉素和青霉素均购自美国Sigma Aldrich公司；抗RANKL抗体、抗β-肌动蛋白抗体及二抗均购自美国Abcam公司；RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；qPCR RT Master Mix购自日本TOYOB公司；qPCR Master Mix购自上海生工生物工程股份有限公司；CCK-8试剂盒、RIPA裂解液及蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；ECL显影液购自北京英格恩生物科技有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞的培养复苏MLO-Y4细胞后，加入含89% α-MEM培养基、体积分数5%胎牛血清、体积分数5%小牛血清和1%双抗(100 g/L链霉素和100 U/mL青霉素)的完全培养基培养，培养于37 ℃、体积分数95%空气和5%CO2组成的潮湿环境中。将MLO-Y4细胞以1×109 L-1的细胞浓度接种在单独的培养瓶中，待细胞长到90%时用磷酸盐缓冲盐水(pH=7.4)洗涤2次并进行传代，加入0.25%胰酶消化液1 mL ，37 ℃消化约3 min，显微镜下观察细胞已呈流沙样脱落，再加入2.5 mL完全培养基终止消化后，1 000 r/min离心5 min，弃上清后加入新鲜完全培养基重悬细胞，平均分装到新的培养瓶中。
1.4.2 脂多糖对骨细胞的白细胞介素6、RANKL表达及AKT磷酸化的影响将MLO-Y4细胞以 1×109 L-1的细胞浓度接种于6孔板中，每孔2.5 mL，待细胞贴壁后分2组处理：实验组加入含脂多糖(使其质量浓度为100 µg/L)[4]，对照组不做处理。培养1，2，4，6，8 h后提取细胞总RNA和总蛋白，采用RT-qPCR检测白细胞介素6和RANKL的mRNA表达，Western blot法检测RANKL和p-AKT/AKT蛋白表达。
1.4.3 不同浓度LY294002对脂多糖诱导骨细胞白细胞介素6、RANKL表达的影响将对数生长期的MLO-Y4细胞以 1×109 L-1的细胞浓度接种于6孔板中，每孔2.5 mL，每孔分别加入一定量的LY294002溶液(溶于二甲基亚砜中)，使其浓度分别为1，2.5，5，10，20 µmol/L。培养1 h后，每孔加入脂多糖使其质量浓度为100 µg/L，处理2 h或4 h。设置单独脂多糖处理组与对照组(不做任何处理)。提取细胞总RNA，采用RT-qPCR检测白细胞介素6和RANKL的mRNA表达。
1.4.4 二甲基亚砜对骨细胞增殖的影响将MLO-Y4细胞以 1×109 L-1的细胞浓度接种于96孔板中，每孔0.1 mL，实验组加入1 µL二甲基亚砜，对照组未加入二甲基亚砜。24，48，72 h后，采用CCK-8法检测细胞增殖情况。
1.4.5 LY294002或二甲基亚砜对脂多糖诱导骨细胞RANKL表达与AKT磷酸化的影响将MLO-Y4细胞以 1×109 L-1的细胞浓度接种于6孔板中，每孔2.5 mL，分4组处理：对照组不做任何处理，培养4 h或6 h；脂多糖组加入脂多糖(质量浓度为100 µg/L)处理4 h或6 h；二甲基亚砜组加入二甲基亚砜(与LY294002组加入的二甲基亚砜量相同)处理1 h，随后加入脂多糖(质量浓度为100 µg/L)处理4 h或6 h；LY294002组加入LY294002溶液(浓度为10 µmol/L)处理1 h，随后加入脂多糖(质量浓度为100 µg/L)处理4 h或6 h。提取细胞总RNA和总蛋白，采用RT-qPCR检测RANKL的mRNA表达，Western blot法检测RANKL与p-AKT/AKT蛋白表达。
1.4.6 相关指标检测方法

RT-qPCR检测：磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞2次后，用RNA提取试剂盒严格按照说明书从细胞中提取总RNA，并用Rever traAce®qPCR RT Master Mix反转录成cDNA。用2×SG Fast qPCR Master Mix在ABI PRISM 7300 Fast Real-Time PCR System中进行PCR扩增引物。PCR引物，见表1。

倍数变化计算为2-ΔΔCt，其中 ΔΔCt=ΔCt实验组–ΔCt对照组，以及ΔCt= Ct目的基因-CtGAPDH。所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。每次实验取3孔平均值为样本检测值，每组重复实验3次。
Western blot法检测：用低温的磷酸缓冲盐溶液(pH=7.4)洗涤细胞3次，使用总蛋白提取试剂盒在冰上提取总蛋白，4 ℃下13 000 r/min离心15 min，使用BCA方法定量测定上清液蛋白浓度，以SDS样品缓冲液(0.125 mol/L Tris-HCl，pH=6.8；10%甘油；2%β-巯基乙醇；2%SDS；0.1%溴酚蓝)稀释来自每个样品的等量蛋白质(20 μg)，再沸水浴8 min，通过SDS-PAGE分离样品并转移到PVDF膜上。将膜与50 g/L牛血清白蛋白TBST(10 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0；150 mmol/L NaCl；0.05%Tween20)在室温下孵育2 h来阻断非特异性蛋白质结合，随后将膜分别与抗AKT、抗磷酸化AKT、抗RANKL或抗β-actin抗体在4 ℃过夜。将膜用TBST洗涤3次，每次5 min，并与辣根过氧化物酶结合的二抗在室温下孵育1 h。再次将膜在TBST中洗涤3次(每次5 min)以除去过量的二抗。滴加 ECL显色液，根据说明书推荐，使用美国GE Healthcare公司ECL系统检测可视化蛋白条带，使用美国Bio-Rad公司Quantity OneV.4.6.6软件分析条带。每个结果重复实验3次。
1.5 主要观察指标脂多糖对骨细胞的白细胞介素6、RANKL表达及AKT磷酸化的影响，不同浓度LY294002对脂多糖诱导骨细胞白细胞介素6、RANKL表达的影响，以及10 µmol/L LY294002对脂多糖诱导骨细胞RANKL表达与AKT磷酸化的影响。
1.6 统计学分析所有数据均以x±s表示。使用SPSS 22软件(IBM，美国)通过单因素ANOVA分析数据，并使用SNK测试进行样品之间的多重比较。以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

脂多糖在炎症性骨吸收中起关键作用，特别是在口腔感染性疾病中如种植体周围炎、牙周炎和根尖周炎[19，28]，常引起严重的牙槽骨吸收，导致牙脱落或种植体失败。因此，迫切需要通过进一步的研究来对脂多糖所致的炎症性骨吸收提供新的治疗选择和理论依据，然而脂多糖诱导骨吸收的机制仍未完全清楚。目前有较多的研究集中于脂多糖诱导成骨谱系细胞产生白细胞介素6和RANKL的机制。白细胞介素6属于常见的炎症因子，拥有多种细胞效性，可激活多种下游信号通路[16]。RANKL不仅存在于病理性骨吸收中，也在正常的生理性骨重塑中发挥重要作用[29]。成骨谱系细胞作为RANKL的重要来源已被许多研究证实[30-32]。许多因素都可以刺激成骨细胞表达RANKL，例如机械刺激、脂多糖和炎性因子[21-23]，在这些因素中，脂多糖是引起局部免疫应答重要的初始刺激，它在微生物入侵时与许多细胞(包括成骨细胞和骨细胞)中表达的Toll样受体结合引发免疫反应。许多研究证实，在炎症过程中脂多糖和Toll样受体的相互作用可上调RANKL的表达，从而启动破骨细胞的生成过程[8，33-34]，这一结论再次得到此次实验的证实。然而，脂多糖诱导骨细胞中RANKL表达的机制仍不清楚，特别是RANKL和其他细胞因子之间的复杂关系及参与的相关信号传导途径仍然未知，这些均是治疗炎性骨吸收的挑战。
前期研中证实，脂多糖通过ERK1/2通路上调白细胞介素6的表达，但当ERK1/2通路被抑制时，脂多糖诱导的白细胞介素6和RANKL表达虽有降低但仍然高于正常水平[4]，因此推测还有其他一个或多个通路涉及此过程。首先考虑PI3K/AKT信号通路参与这一过程是因为：已有研究证实在骨细胞中PI3K/AKT和ERK1/2两个通路共同参与了循环压缩力诱导的白细胞介素6分泌[23]，此外PI3K/AKT和ERK信号传导途径表现出串联和代偿的关系[35]。PI3K/AKT信号通路严格控制整个身体的细胞存活、生长和增殖[36]，各种分子包括胰岛素、葡萄糖、多种生长因子和细胞因子都能启动PI3K/AKT信号传导[37]。其他信号传导途径也表现出与PI3K/AKT的串联关系，例如核因子κB和Wnt/β-连环蛋白[24-25，38]。实验结果也表明，PI3K/AKT确实参与了脂多糖诱导的白细胞介素6和RANKL的表达。
PI3K/AKT是成骨细胞和破骨细胞中的重要信号转导系统，在骨生物学中发挥重要作用，并与骨组织中的MAPK亚家族(ERK、p38、JNK)、GSK3β和Wnt相互作用以调节骨代谢[39-40]。当成骨细胞中PI3K/AKT被抑制时可以观察到3种细胞表型的自主异常：对细胞凋亡的易感性增加，分化和功能受到抑制，RANKL表达降低[26]。有研究表明，在成骨细胞中PI3K/AKT是脂多糖激活的核因子κB信号传导中的重要中间途径，其介导许多炎性细胞因子的产生[24]。实验结果显示，当PI3K被LY294002抑制时脂多糖诱导的RANKL表达降低，这有利于抑制破骨细胞生成。在破骨细胞中，PI3K/AKT是RANKL活化的重要信号传导途径，当AKT被抑制时，RANKL诱导的破骨细胞形成受到抑制[41]。因此，在成骨细胞和破骨细胞中PI3K/AKT信号传导途径的抑制有利于阻止破骨细胞的活化，减少脂多糖诱导的炎症性骨吸收。
实验以脂多糖诱导MLO-Y4骨细胞RANKL表达的峰值时间明显晚于白细胞介素6，这个发现有两种可能的解释：第一，RANKL的表达与白细胞介素6之间无任何联系；第二，RANKL是白细胞介素6的下游。前期研究中抑制白细胞介素6下游的STAT3途径导致RANKL表达显著降低[4]，这表明RANKL是脂多糖刺激下骨细胞白细胞介素6的下游因子。在加入PI3K抑制剂LY294002后，白细胞介素6和RANKL的mRNA表达水平都出现了明显降低，这表明PI3K/AKT可能既存在于白细胞介素6的上游来影响白细胞介素6的表达，也存在于白细胞介素6的下游来影响RANKL的表达。白细胞介素6与PI3K/AKT的联系在多种疾病研究中已经被证实，如慢性炎症、糖尿病、前列腺癌[42-44]，其中Toll样受体和PI3K/AKT在免疫细胞的聚集和多种炎症递质所导致的组织损伤中发挥了重要作用[44]。
综上所述，脂多糖与骨细胞中的Toll样受体结合后同时激活PI3K/AKT和其他信号途径以诱导白细胞介素6和RANKL的表达，这一发现为骨细胞中脂多糖和RANKL的相互关联提供了另一条线索，但脂多糖诱导骨细胞中RANKL表达的机制仍需进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

脂多糖刺激小鼠MLO-Y4骨细胞白细胞介素6及核因子κB受体活化因子配体的表达

Lipopolysaccharide stimulates the expression of interleukin-6 and nuclear factor kappa B receptor activator ligand in mouse MLO-Y4 osteoblasts

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[1]	吴聪, 贾全忠, 刘伦. 成年关节软骨碎块化后转化生长因子β1表达与软骨细胞迁移的关系[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1167-1172.
[2]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[3]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[4]	温小雨, 孙玉浩, 夏猛. 五脏温阳化瘀汤含药血清干预阿尔茨海默症细胞模型磷酸化tau蛋白的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1068-1073.
[5]	刘伊依, 邱俊强, 衣龙燕, 周财亮. 接受抗阻训练中老年人白细胞介素6与C-反应蛋白变化的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 804-812.
[6]	胡维帆, 郑力, 李大地, 孙阳, 赵凤朝. 过表达miR-25通过 NFATc1信号通路调控钛颗粒诱导的破骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 682-687.
[7]	林旭晨, 祝海年, 王增顺, 祁腾民, 刘立民, 索南昂秀. 黄腐酚对骨关节炎模型小鼠炎性因子及关节软骨的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 676-681.
[8]	李为明, 许青文, 李奕俊, 孙岩波, 崔进, 徐鹏远. 深层海水通过激活PI3K/Akt通路促进糖尿病小鼠创伤的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 724-729.
[9]	许磊, 韩晓强, 张锦涛, 孙海飚. 关节软骨细胞周围透明质酸产生、转化和功能特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 768-773.
[10]	何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨生, 季平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.
[11]	魏舟丹, 李文晋, 朱莉, 王瑜, 赵娇阳, 陈亚楠, 郭栋, 郝敏. 拔牙后富血小板血纤蛋白作为牙槽嵴位点保留材料可显著减少牙槽骨高度及宽度的吸收：一项Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 643-648.
[12]	廖军, 徐普. 纳米淡水珍珠粉对成骨相关基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(27): 4325-4329.
[13]	米健国, 乔荣勤, 刘少津. 补肾健脾活血方干预骨质疏松模型大鼠骨代谢、氧化应激及自噬的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4147-4152.
[14]	孙锦鹏, 刘军, 白云峰, 华峰, 王浩然, 郑宏瑞, 吴涛. 细胞信号转导抑制因子3影响青少年特发性脊柱侧凸畸形软骨内的成骨活性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4160-4165.
[15]	宫雨晴, 姚蔚, 李然. 肿瘤坏死因子α在牙槽骨改建中的骨免疫学效应[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4242-4251.

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