2.1  破骨细胞诱导鉴定

抗酒石酸酸性磷酸酶染色：镜下见RAW264.7细胞较小，呈圆形或多角形，只含有1个细胞核，被染成黄色，抗酒石酸酸性磷酸酶染色阴性；破骨样细胞体积较大，呈椭圆形或不规则形，含有3个及以上的细胞核，被染成灰色，抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性。抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果显示诱导液5 d后，RAW264.7诱导成功，见图1，2。培养5 d后，10 mmol/L乳酸组的抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数高于其他3组(P < 0.01)，见图3。

2.2  CCK-8法检测乳酸对细胞增殖的影响  细胞增殖曲线见图4，细胞贴壁后，对照组和5 mmol/L乳酸组经过  30 h的潜伏期开始进入对数生长期，36-42 h附近增殖速率趋近于平稳，增殖曲线呈“S”型，而10 mmol/L乳酸组和20 mmol/L乳酸组没有明显进入对数生长期的节点，整个生长曲线近乎呈直线型；培养18-30 h，10 mmol/L乳酸组和20 mmol/L乳酸组细胞增殖率高于对照组和   5 mmol/L乳酸组，而36 h后20 mmol/L乳酸组增殖率明显低于其他3组(P < 0.05)；42 h 20 mmol/L乳酸组增殖率仍然最低(P < 0.05)，而5 mmol/L乳酸组增殖率明显高于  10 mmol/L乳酸组和20 mmol/L乳酸组(P < 0.05)；不同时间点10 mmol/L乳酸组和对照组的增殖率差异无显著性意义。

2.3  RT-PCR检测乳酸对酸性磷酸酶5、活化T细胞核因子c1、RANK mRNA表达的影响  见图5。

与对照组相比，随着乳酸浓度的升高，5，10，20 mmol/L乳酸组酸性磷酸酶5、活化T细胞核因子c1、RANK的mRNA相对表达水平显著升高(P < 0.05)，且有先升高后降低的趋势；在10 mmol/L乳酸培养条件下RAW264.7细胞3种基因的mRNA平均表达量均最高。不同乳酸浓度条件下各组mRNA的相对表达量见表3。

2.4  Western Blot检测乳酸对组织蛋白酶K、活化T细胞核因子c1蛋白表达的影响  见图6。

与对照组相比，5，10，20 mmol/L乳酸组的组织蛋白酶K蛋白相对表达量随乳酸浓度的升高而升高，各组之间比较差异均有显著性意义(P < 0.01)；5，10，20 mmol/L乳酸组活化T细胞核因子c1蛋白的相对表达量随乳酸浓度的升高而降低，对照组、5，10 mmol/L乳酸组之间比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，且当乳酸达到10 mmol/L以上，活化T细胞核因子c1的相对表达量趋近于0。

骨缺损的修复是一个漫长且复杂的过程^[1-2]。在骨缺损、骨替代材料整合改建过程中，免疫效应细胞首先产生免疫应答以启动骨整合进程，单核细胞作为早期被募集的骨免疫效应细胞之一，通过分泌白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎性免疫调控因子，正反馈促进单核细胞融合为破骨细胞样多核细胞^[3]。破骨细胞是一种由单核巨噬细胞分化而来的具有骨再吸收能力的多核细胞，受成骨细胞的严格调控^[4]。RANK/RANKL信号通路是破骨细胞分化过程中最关键的调节途径^[5]。成骨细胞产生大量的巨噬细胞集落刺激因子和RANKL，而破骨前体细胞表面有巨噬细胞集落刺激因子受体和RANKL的受体RANK。在巨噬细胞集落刺激因子和RANKL刺激下，破骨前体细胞转录活化T细胞核因子c1，产生的活化T细胞核因子c1去磷酸化，进入细胞核，促进组织蛋白酶K和抗酒石酸酸性磷酸酶抗酒石酸酸性磷酸酶等靶点的转录^[6]。

聚乳酸是一种具有良好力学性能和生物降解特性的聚合物^[7]，其水解主要产物为乳酸，在骨组织工程领域有着广泛的应用^[8]。作者所在课题组前期研究发现，使用聚乳酸-羟基乙酸复合磷酸钙骨水泥可促进骨缺损的修复，提高骨密度，效果与颗粒状骨粉相似，可有效保存缺损区的骨质^[1，9]。聚乳酸微球复合磷酸钙骨水泥植入骨缺损区后，聚乳酸微球多能被快速吸收，而磷酸钙骨水泥材料吸收较慢，影响了骨再生的进程。对于其他骨组织工程材料，如去蛋白牛骨颗粒(商品名Bio-Oss®)、生物活性玻璃、三磷酸钙颗粒等，植入动物体内的长期观察都可以发现这些材料的降解极慢，甚至可长达2-2.5年未降解^[10-11]。许多实验表明，聚乳酸与多种骨组织工程材料复合后，均能提高骨改建速率^[12-15]，但局部复杂的微环境使乳酸对骨改建的影响并不完全清楚。聚乳酸对骨改建的作用除骨引导外，主要是通过其水解后生成的乳酸对局部组织产生影响。骨改建是骨吸收与骨形成同步进行的过程^[16]，要提高骨改建效率就需要有与成骨效率对等的骨吸收效率来制造成骨空间。以往的研究多只关注于对新骨形成的调控，而对加速骨组织工程材料的降解研究较少。此次实验的目的在于研究乳酸浓度增加对破骨细胞形成的影响，为提高骨组织工程材料的降解速率提供参考依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  对比观察细胞实验。

1.2  时间及地点  于2019年1至5月在广西医科大学口腔颌面修复与重建研究重点实验室及广西医科大学医学科学实验中心完成。

1.3  材料

实验用试剂：小鼠巨噬细胞株 RAW264.7(ATCC公司，美国)，DMEM培养液(维森特，加拿大)，胎牛血清(Glibco，美国)，乳酸(solarbio，中国)，抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒(南京建成，中国)，一步法凝胶制备试剂盒(弗德生物，中国)，中强度RIPA裂解液(弗德生物，中国)，蛋白Marker(GenStar，中国)，Western一抗稀释液(百智生物，中国)，Western二抗稀释液(百智生物，中国)，10×Western Blot转膜液(百智生物，中国)，10×TBST缓冲液(百智生物，中国)，BCA蛋白定量试剂盒(弗德生物，中国)，GAPDH小鼠多克隆抗体(proteintech，中国)，羊抗小鼠二抗(proteintech，中国)，羊抗兔二抗(proteintech，中国)，RNA分离试剂盒(TaKaLa，日本)，反转录试剂盒(TaKaLa，日本)，RANKL(R&D system，美国)，0.22 μm聚偏二氟乙烯PVDF膜(Amresco，美国)，甲醇(科隆，中国)，CCK-8试剂盒(东仁化学科技，中国)。

仪器：CO₂细胞培养箱(Tliermo Scientific，美国)，倒置像差显微镜(Olympus，日本)，超净工作台(上海智城，中国)，自动双蒸水蒸馏器(上海玻璃仪器厂，中国)，医用超低温冰箱(Thermo Forma，美国)，台式高速大容量冷冻离心机(Thermo SCIENTIFIC，美国)，iMark自动酶标仪(BIio-Rad，美国)，HYA型恒温摇床(武汉科学仪器厂，中国)，移液器(Eppendcxrf，德国)，低速台式大容量离心机(上海安亭科学仪器厂，中国)，T100 PCR扩增仪(Bio-Rad，美国)，CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad，中国)，电泳仪(Bio-Rad，美国)，蛋白转膜槽，蛋白电泳槽(Bio-Rad，美国)，ChemiDoc MP全能型成像系统(Bio-Rad，美国)，NanoDrop分光度计(Thermo Fisher Scientific，德国)。

1.4  实验方法

1.4.1  实验准备  将DMEM培养液与胎牛血清按体积比9∶1配制成DMEM完全培养基；将乳酸与DMEM完全培养基混合，分别配制成含0，5，10，20 mmol/L浓度乳酸的DMEM完全培养基。将小鼠RAW264.7细胞按5.0×10⁷ L^-1接种于6孔板，分组方式见表1，使用DMEM完全培养基培养。6 h后待细胞全部贴壁，弃原培养液，每孔分别加入1 mL含0，5，10，20 mmol/L乳酸的DMEM完全培养基，同时每组均加入50 μg/L RANKL，37 ℃，体积分数5%CO₂条件下继续培养5 d，隔日换液。

1.4.2  抗酒石酸酸性磷酸酶染色  细胞培养5 d后，根据抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒说明书使用钙钴法对4组细胞进行染色，200倍镜下观察细胞分化情况，具有3个及3 个以上细胞核的多核细胞认定为破骨样细胞。对每组细胞随机选取5个视野进行破骨细胞计数。

1.4.3  乳酸对细胞活性的影响  细胞培养超过42 h以后，镜下可见有少量多核细胞形成，已经不属于单核细胞增殖过程，故采用42 h内细胞增殖曲线。将小鼠RAW264.7细胞按5.0×10⁷ L^-1细胞浓度接种于96孔板，平均分为4组，每组21个副孔，6 h后待细胞完全贴壁，去原培养液，每孔分别加入100 μL含0，5，10，20 mmol/L乳酸的DMEM完全培养基继续培养，同时每组均加入50 ng RANKL，37 ℃，体积分数5%CO₂条件下继续培养，隔日换液。每隔6 h，每组选3个孔，均加入100 μL CCK-8，37 ℃避光孵育1 h，使用酶标仪在450 nm波长下读取吸光度值，重复3次，绘制细胞增殖曲线。

1.4.4  乳酸对酸性磷酸酶5、活化T细胞核因子c1、RANK mRNA表达的影响  小鼠RAW264.7细胞培养、分组同表1。使用TaKaLa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒按说明书提取RNA，吸光度法测量每个样品的浓度，各样品取500 μg RNA，根据反转录试剂盒的操作说明生成cDNA，采用Real Time PCR检测破骨向分化相关基因酸性磷酸酶5、活化T细胞核因子c1、RANK的mRNA相对表达情况，重复3次。β-actin作为内参，待反应结束后，根据PCR仪上测得的Ct值，通过计算机软件得出mRNA的相对表达量。相关PCR引物序列见表2。

1.4.5  乳酸对组织蛋白酶K、活化T细胞核因子c1蛋白表达的影响  小鼠RAW264.7细胞培养、分组同表1。配置含   1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液。使用PBS清洗后，6孔板每孔加入150 μL裂解液，充分裂解后收集到离心管中，  12 000×g离心5 min，取上清。根据BCA蛋白定量试剂盒说明书测定样品蛋白浓度。将上清液与上样缓冲溶液按照体积比4∶1混合。在100 ℃水浴条件下保持5 min，转入-80 ℃冷藏。使用一步法凝胶制备试剂盒制胶，每孔蛋白上样量为40 μg，200 V恒压电泳45 min，200 A恒流转膜  90 min，5%脱脂牛奶封闭90 min，4 ℃孵一抗过夜，室温孵二抗40 min，使用化学发光法检测组织蛋白酶K、活化T细胞核因子c1蛋白的表达，重复3次。

1.5  主要观察指标  ①不同乳酸浓度条件下，小鼠RAW264.7细胞的破骨向诱导结果；②不同乳酸浓度条件下，小鼠RAW264.7细胞的增殖能力；③不同乳酸浓度条件下，小鼠RAW264.7细胞酸性磷酸酶5、活化T细胞核因子c1、RANK mRNA的表达；④不同乳酸浓度条件下，小鼠RAW264.7细胞组织蛋白酶K、活化T细胞核因子c1蛋白的表达。

1.6  统计学分析  实验数据运用SPSS 20.0软件进行统计和分析，结果用x(_)±s表示，对数据先做正态和方差齐检验，符合者用样本独立样本t 检验分析比较。若不符合正态分布或方差不齐者，用非参数检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

相关基因的转录过程，也影响了相关蛋白的翻译过程，活化T细胞核因子c1的翻译过程受到了抑制。活化T细胞核因子c1是核因子κB信号通路中重要的调节位点，实验中结果中活化T细胞核因子c1的翻译过程被抑制而仍然出现大量破骨细胞分化，提示乳酸可能抑制活化T细胞核因子c1的翻译过程，并可以绕过活化T细胞核因子c1这一调节位点，直接影响活化T细胞核因子c1下游的信号通路，或许还存在着新的信号通路。有文献报道激活Cot基因可以通过磷酸化过程提高活化T细胞核因子c1蛋白的稳定性，并通过Ca²⁺信号通路对活化T细胞核因子c1的转录起促进作用^[19]。WILCHES-BUITRAGO等^[34]的研究表明，糖酵解的中间产物1，6-二磷酸果糖可以抑制RANKL介导的核因子κB信号通路中活化T细胞核因子c1的表达，进而抑制破骨向分化。在此次实验中，随着乳酸浓度的升高，会反向抑制糖酵解反应的进行，而培养液中加入的RANKL则会刺激RAW264.7细胞破骨向分化，刺激细胞糖酵解反应正向进行，二者的综合作用可以影响活化T细胞核因子c1的表达。组织蛋白酶K为活化T细胞核因子c1下游的信号通路，随着乳酸浓度的升高，组织蛋白酶K和活化T细胞核因子c1的蛋白表达水平呈相反的趋势，也可以表明乳酸可以绕过活化T细胞核因子c1的调控而直接影响其下游的信号通路。

综合以上研究，在PETER等^[18]和DIETL等^[31]的实验中，细胞培养时间较短，细胞浓度不高，考虑到没有形成缺氧微环境，这可能是没有促进破骨细胞形成的原因之一。而在此次实验中，细胞培养的时间较长，与TANG等^[33]的细胞培养时间接近，在培养后期培养板中细胞密度极高，培养基中的溶解氧以极快的速度消耗，造成缺氧的微环境，在乳酸浓度适当的情况下就可能演变成促进破骨细胞形成的有利条件。当乳酸浓度超过20 mmol/L，乳酸的细胞毒性作用进一步增强，糖酵解的抑制作用被加强，造成破骨细胞的分化被抑制。但临床治疗骨缺损的过程中，聚乳酸复合材料植入后局部缺氧的状况会在较长时间内持续存在，而局部乳酸的浓度则会从短期内突释转变为较长时间的低浓度持续状态，整体微环境向着低氧低乳酸的方向发展，有助于破骨细胞形成，进而加快聚乳酸复合材料的骨改建速率。

总之，乳酸对促进单核细胞破骨向分化过程除了受自身浓度的影响外，还会受到作用时间、培养基氧含量等多重因素的影响。单核细胞的糖酵解过程是这些影响因素的重要作用途径之一，可能会成为乳酸促进单核细胞破骨向分化机制的突破点。此实验中乳酸的加入抑制了核因子κB信号通路中重要的调节位点的表达，提示当使用聚乳酸复合材料修复骨缺损时，采用常规思路影响核因子κB信号通路促进骨组织工程材料的降解可能会产生较大的系统误差，因此需要寻找新的作用靶点。作者所在课题组正继续探索相关信号通路，希望能够通过在基因水平上提高骨组织工程材料的降解速率来加速骨改建进程，研究结果将用于新药研发以及指导骨组织工程材料的选择和研制。未来对乳酸的研究，可以不局限于仅作为一种致孔剂或载药缓释材料；将聚乳酸直接作为药用成分进一步加工成定量缓释体系，进而促进骨组织工程材料的降解，也不失为一种新的解决路径。

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文题释义：
聚乳酸复合骨组织工程材料：聚乳酸是大量乳酸分子通过脱水缩合反应形成的聚合物，具有良好的机械性能和生物相容性，是理想的绿色高分子材料。聚乳酸的降解速率一般较与其复合的骨组织工程材料更快，其水解产物为乳酸。聚乳酸材料与其他骨组织工程材料复合后植入机体，可以起到骨引导作用，局部乳酸浓度从爆发式升高到逐渐降低，对局部骨组织的再生造成影响。
活化T细胞核因子c1：是属于NFAT家族的一种转录因子，受Ca2+和钙调神经磷酸酶CaN调节。静息状态下活化T细胞核因子c1处于细胞质中，呈高度磷酸化状态，并不具有活性；当细胞受到刺激，胞外Ca2+内流或细胞内的Ca2+被释放出来，激活钙调神经磷酸酶CaN，促进活化T细胞核因子c1去磷酸化，并转移到细胞核中，与核内的协同蛋白共同调节基因的转录过程。

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目前临床常见的骨组织工程材料降解缓慢，导致成骨过程与材料降解过程不能同步进行，影响美观、功能及进一步治疗过程。使用聚乳酸复合骨组织工程材料可降解出乳酸，并加速降解过程。本文通过探索乳酸浓度对单核细胞破骨向分化的影响，找到了促进破骨向分化的最佳浓度，并发现了相关基因和蛋白的表达趋势具有不同步的特点，结果与已知的核因子κB信号通路有差别。这启示其中可能隐藏着某些新的信号通路，进一步研究将对新药研发以及指导骨组织工程材料的选择和研制均具有指导意义。

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