吗替麦考酚酯对大鼠胚胎耳郭发育的影响

doi:10.12307/2023.446

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (24): 3818-3823.doi: 10.12307/2023.446

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

吗替麦考酚酯对大鼠胚胎耳郭发育的影响

陈倩，张杨，李高峰

湖南师范大学附属第一医院(湖南省人民医院)，湖南省长沙市 410013

收稿日期:2022-05-18 接受日期:2022-07-12 出版日期:2023-08-28 发布日期:2023-01-19
通讯作者: 李高峰，博士，主任医师，教授，硕士生导师，湖南师范大学附属第一医院(湖南省人民医院)，湖南省长沙市 410013
作者简介:陈倩，女，1999 年生，湖南省长沙市人，汉族，湖南师范大学在读硕士，医师，主要从事先天性小耳畸形发病机制研究。
基金资助:
湖南省自然科学基金(2021JJ30401)，项目负责人：李高峰

Effects of mycophenolate mofetil on the development of rat embryonic auricle

Chen Qian, Zhang Yang, Li Gaofeng

The First Affiliated Hospital of Hunan Normal University, Hunan Provincial People’s Hospital, Changsha 410013, Hunan Province, China

Received:2022-05-18 Accepted:2022-07-12 Online:2023-08-28 Published:2023-01-19
Contact: Li Gaofeng, MD, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, The First Affiliated Hospital of Hunan Normal University, Hunan Provincial People’s Hospital, Changsha 410013, Hunan Province, China
About author:Chen Qian, Master candidate, Physician, The First Affiliated Hospital of Hunan Normal University, Hunan Provincial People’s Hospital, Changsha 410013, Hunan Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Hunan Province, No. 2021JJ30401 (to LGF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

吗替麦考酚酯：是一种免疫抑制剂，是肾脏或肝脏移植后的主要用药之一，同时也广泛用于自身免疫性疾病。吗替麦考酚酯可有效治疗系统性红斑狼疮、原发性肾病综合征、IgA肾病、系统性小血管炎肾损害，同时也广泛用于自身免疫性疾病、青少年难治性自身免疫性肝炎、神经系统自身免疫性疾病、非感染性葡萄膜炎、不同类型的血管炎，以及常见的皮肤病如银屑病、特应性皮炎和寻常天疱疮。
颅神经嵴细胞：是一个暂时的多功能细胞团，参与颅颌面主要组织器官的形成，它的迁移、增殖和分化是耳郭发育的重要步骤。不同部位的颅神经嵴细胞具有精确的迁移路径，在体内微环境的诱导下，以细胞流的形式迁入颅面特定部位，进而分化为颅面不同器官。

背景：先天性小耳畸形发病机制尚不明确，目前研究认为小耳畸形与环境及遗传因素共同作用有关，药物致畸是环境因素中的一个重要方面。
目的：观察大鼠孕鼠暴露在不同剂量吗替麦考酚酯环境中的胚胎耳郭发育指标，以期建立一种药物诱导的小耳畸形模型，为进一步探讨小耳畸形的发病机制提供基础。
方法：将成年SD大鼠按雌雄比2∶1合笼，次日检查雌鼠，发现阴栓定为孕0 d。将32只SD大鼠孕鼠随机分为4组，分别记为对照组、吗替麦考酚酯50，100，200 mg/kg组，每组8只。孕9，10 d每天早上8点分别用50，100，200 mg/kg吗替麦考酚酯玉米油灌胃1次，对照组仅灌胃玉米油，于孕20.5 d麻醉后脱颈处死各组孕鼠，大体观察各组胚胎发育情况及耳郭发育指标，micro-CT影像学观察中耳及内耳发育情况，组织学检测耳郭软骨及软组织改变。

结果与结论：①与对照组相比，各吗替麦考酚酯组死胎数、吸收胎数增加，活胎数及活胎率降低；耳横长、耳纵长、耳纵长/耳横长、鼻枕距/双顶径、眼距、体长、体质量等指标存在明显统计学差异(P < 0.05)。吗替麦考酚酯50 mg/kg组与吗替麦考酚酯100，200 mg/kg组相比，各指标存在明显统计学差异(P < 0.05)。吗替麦考酚酯100 mg/kg组与吗替麦考酚酯200 mg/kg组相比，耳纵长、体长、体质量、鼻枕距存在明显统计学差异(P < 0.05)。②与对照组相比，吗替麦考酚酯组micro-CT影像学主要改变为颅骨发育不良、听泡发育不完整。③苏木精-伊红染色、甲胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化结果示吗替麦考酚酯影响软骨细胞增生、分化以及Ⅱ型胶原表达。④结果表明，吗替麦考酚酯可导致大鼠胚胎耳郭组织发育不良且呈剂量依赖性，可能是因为其阻止了软骨细胞增生、分化及Ⅱ型胶原表达，吗替麦考酚酯可诱导建立小耳畸形动物模型。

https://orcid.org/0000-0001-8211-6645 (陈倩)；https://orcid.org/0000-0003-3628-815X (李高峰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 吗替麦考酚酯, 大鼠, 耳畸形, 耳郭发育, 软骨细胞, Ⅱ型胶原

Abstract: BACKGROUND: The pathogenesis of congenital microtia is not clear. Current studies believe that microtia is related to the joint action of environmental and genetic factors, and drug teratogenesis is an important aspect of environmental factors.
OBJECTIVE: To observe the embryonic auricle development indexes of pregnant rats exposed to different concentrations of mycophenolate mofetil, in order to establish a drug-induced microtia model and provide a basis for further exploring the pathogenesis of microtia.
METHODS: Adult Sprague-Dawley rats were caged according to the ratio of male to female at 2:1, and the female rats were checked the next day. The presence of a vaginal plug was designated as gestational day 0. Thirty-two pregnant rats were randomized into four groups (n=8 per group): control group, 50, 100, and 200 mg/kg mycophenolate mofetil groups. Rats in the four groups were intragastrically given corn oil, and 50, 100, and 200 mg/kg mycophenolate mofetil corn oil respectively at 8 a.m. on gestational days 9 and 10. The pregnant rats in each group were decapitated under anesthesia on gestational day 20.5. The embryonic development and auricle development indexes were generally observed. The development of middle and inner ears was observed by micro-CT imaging. Auricle cartilage and soft tissue changes were histologically observed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the numbers of dead fetuses and absorbed fetuses were increased and the number and rate of live fetuses decreased in different mycophenolate mofetil groups. There were significant differences in ear transverse length, ear longitudinal length, ear longitudinal length/ear transverse length, nasal occipital distance/biparietal diameter, eye distance, body length and body mass between different mycophenolate mofetil groups and control group (P < 0.05). The above-mentioned indexes were significantly different in the 50 mg/kg mycophenolate mofetil group from 100 and 200 mg/kg mycophenolate mofetil groups (P < 0.05). There were also significant differences in ear length, body length, body mass, and nasal occipital distance between 100 and 200 mg/kg mycophenolate mofetil groups (P < 0.05). (2) Compared with the control group, the main micro-CT changes in each mycophenolate mofetil group were dysplasia of the skull and incomplete development of auditory vesicle. (3) The results of hematoxylin-eosin staining, toluidine blue staining and type II collagen immunohistochemistry staining showed that mycophenolate mofetil affected the proliferation and differentiation of chondrocytes and the expression of type II collagen. (4) To conclude, mycophenolate mofetil can cause the dysplasia of rat embryonic auricle in a dose-dependent manner, because mycophenolate mofetil may inhibit the proliferation and differentiation of chondrocytes and the expression of type II collagen. Mycophenolate mofetil can be used to establish an animal model of microtia.

Key words: mycophenolate mofetil, rat, ear deformity, auricle development, chondrocyte, type II collagen

中图分类号:

陈倩, 张杨, 李高峰. 吗替麦考酚酯对大鼠胚胎耳郭发育的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(24): 3818-3823.

Chen Qian, Zhang Yang, Li Gaofeng. Effects of mycophenolate mofetil on the development of rat embryonic auricle[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(24): 3818-3823.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析实验所选用32只SD大鼠孕鼠，随机分为4组，最终纳入对照组8只，吗替麦考酚酯50，100，200 mg/kg组各8，8，7只。
2.2 大体指标观察记录孕20.5 d时各组胚胎数量，测量各组活胎的发育指标，如表1所示，对照组孕鼠胚胎发育基本正常，随吗替麦考酚酯剂量增加，各实验组死胎数、吸收胎数增加，活胎数及活胎率降低，对照组与吗替麦考酚酯 50，100和200 mg/kg组相比，活胎数、死胎数、吸收胎数存在明显统计学差异(P < 0.05)。如表2所示，随吗替麦考酚酯剂量增加，吗替麦考酚酯组畸形胎数、耳畸形胎数增加，耳畸形胎率逐渐升高。如表3所示，对照组与吗替麦考酚酯100，200 mg/kg组相比，耳横长、耳纵长、耳纵长/耳横长存在明显统计学差异(P < 0.05)。如表4所示，对照组与吗替麦考酚酯 100，200 mg/kg组相比，体长、体质量、鼻枕距/双顶径、眼距等各指标存在明显统计学差异(P < 0.05)。吗替麦考酚酯 50 mg/kg组与吗替麦考酚酯 100，200 mg/kg组相比，各指标存在明显统计学差异(P < 0.05)。吗替麦考酚酯 100 mg/kg组与吗替麦考酚酯200 mg/kg组相比，耳纵长、体长、体质量、鼻枕距存在明显统计学差异(P < 0.05)。各组SD孕鼠胚胎第20.5天耳郭形态，见图1。

2.3 影像学检查结果 micro-CT检测孕20.5 d胚胎标本头颅，观察中耳及内耳发育情况。对照组颅骨、听泡结构发育完整，见图2A；吗替麦考酚酯50 mg/kg组听泡结构发育基本完整，见图2B；吗替麦考酚酯100 mg/kg组听泡结构不连续，见图2C；吗替麦考酚酯200 mg/kg组颅骨明显发育不良，听泡基本未发育，见图2D。

2.4 组织学检测结果
2.4.1 耳软骨苏木精-伊红染色观察结果孕20.5 d胚胎外耳标本苏木精-伊红染色，对照组与吗替麦考酚酯50 mg/kg组靠近软骨膜处软骨细胞较小，密度较高，软骨基质淡红，软骨中部细胞逐渐增大、稀疏，软骨陷窝周围基质内含大量弹性纤维。对照组软骨细胞较吗替麦考酚酯50 mg/kg组密集，见图3A，B。吗替麦考酚酯 100 mg/kg组软骨发育不良，细胞移行不明显，软骨基质减少，见图3C。吗替麦考酚酯200 mg/kg组软骨发育迟缓，软骨薄，细胞排列不规则，软骨基质明显减少，见图3D。

2.4.2 耳软骨甲苯胺蓝染色观察结果孕20.5 d胚胎外耳标本甲胺蓝染色，对照组靠骨膜处可见软骨细胞较小，单个分布，中部软骨细胞较大、密集，软骨陷窝内同源细胞多，软骨细胞增生活跃，见图4A。吗替麦考酚酯50 mg/kg组软骨与对照组相近，见图4B。吗替麦考酚酯100 mg/kg组软骨细胞较前两组少，从近骨膜处至中部软骨细胞移行不明显，见图4C。吗替麦考酚酯200 mg/kg组软骨细胞稀疏，排列不规则，软骨陷窝内同源细胞少，软骨增生不活跃，见图4D。

2.4.3 耳软骨Ⅱ型胶原免疫组化观察结果孕20.5 d胚胎外耳标本Ⅱ型胶原免疫组化检测，对照组软骨膜、软骨囊及细胞间质呈褐黄色均质状或颗粒状，呈阳性表现，靠近软骨膜、软骨囊处呈强阳性，靠近软骨中部表达逐渐减弱，见图5A。吗替麦考酚酯50 mg/kg组可见棕黄色颗粒，呈中等阳性表达，见图5B。吗替麦考酚酯100，200 mg/kg组可见淡黄色颗粒，呈弱阳性表达，各组Ⅱ型胶原分布均匀，见图5C，D。

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引言

吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil，MMF)是一种免疫抑制剂[1]，是肾脏或肝脏移植后主要用药之一，同时也广泛用于自身免疫性疾病，可有效治疗系统性红斑狼疮、原发性肾病综合征、IgA肾病、系统性小血管炎肾损害[2]、青少年难治性自身免疫性肝炎[3]、神经系统自身免疫性疾病[4]、非感染性葡萄膜炎[5]、不同类型的血管炎[6]，以及常见的皮肤病如银屑病、特应性皮炎和寻常天疱疮[7]。
先天性小耳畸形表现为耳郭先天发育不良，常伴发外耳道闭锁、中耳及颅颌面发育异常，以不同程度的颅面骨骼、眼、面部软组织的发育不良为主[8]，对患者的外在容貌、心理健康及社会交往造成较严重的影响[9]。先天性小耳畸形在中国的发病率高达3.09/10 000[10-11]，其中男性发病率多于女性。目前耳郭再造术是其主要的治疗方法[12]。耳郭再造术是整形外科手术中最具挑战性、最复杂的手术之一[13]，其手术过程几乎囊括了整形外科的基本操作，包括肋软骨的雕刻、皮瓣筋膜瓣的设计、皮片移植等，手术难度大，需多次手术，术后并发症可能性大，且患者满意度难以估计。学者们对耳郭再造手术进行了不断改进，从Tanzer及Brent四期法[14]、Nagata二期法[15]、皮肤软组织扩张器法[16]，发展到延迟皮瓣法[17-18]，虽然致力于提高再造耳外观真实性、减少患者痛苦、缩短治疗时间，但仍存在治疗周期长、难度较高、经费较贵、风险较大等风险，给患者及其家庭带来沉重的心理负担及经济压力[19]。先天性小耳畸形的发病机制尚不明确，目前研究认为小耳畸形与环境及遗传因素共同作用有关，药物致畸是环境因素中的一个重要方面[20]。
吗替麦考酚酯是目前引起小耳畸形比较明确的一种药物，查阅文献发现有较多孕期服用吗替麦考酚酯后出现产儿先天性小耳畸形的临床报道[21]。ALSEBAYEL等[22]报道了1例经肝移植并使用吗替麦考酚酯的孕妇，其婴儿为双侧小耳畸形并外耳道闭锁。ANDERKA等[23]报道了1名在受孕前至孕12周期间接受了吗替麦考酚酯治疗狼疮肾炎，其婴儿为双侧中度至重度小耳畸形、外耳道闭锁、双侧传导性听力损失。2017年PEREZ-AYTES等[24]总结了文献报道的吗替麦考酚酯所致的发育畸形病例，发现高达75%的暴露病例出现了耳畸形，包括单侧或双侧的小耳或无耳畸形以及外耳道闭锁。
由于目前小耳畸形的发病机制尚不明确，建立稳定的特异性小耳畸形动物模型是小耳畸形致病机制研究中的关键问题。用于研究小耳畸形的动物模型较多，主要为两大类，一是通过动物家系的筛选，找到较稳定的小耳畸形动物模型，研究其致病机制，进而找到相关的缺陷基因[25-26]；二是通过药物诱导小耳畸形动物模型。诱导方法主要分为2种，即体外培养模式及仿临床模式。体外培养能直接观察胚胎鳃弓及其衍生组织的发育过程[27]，仿临床模式动物则更接近于临床实际情况。仿临床模式动物通过灌胃、鼻胃插管或腹腔注射等方式给药，这与临床的实际情况更接近，也可通过已制备的动物模型行进一步的实验室研究，探索小耳畸形的发病机制。
该研究通过观察大鼠孕鼠暴露在不同剂量吗替麦考酚酯环境中的胚胎耳郭发育指标，探究吗替麦考酚酯对大鼠胚胎耳郭发育的影响，以期建立一种药物诱导的小耳畸形模型，为进一步探讨小耳畸形的发病机制提供基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，采用单因素方差分析比较多组间数据的差异，采用t检验及卡方检验进行多组间两两比较。
1.2 时间及地点实验于2020年1-5月在湖南师范大学附属第一医院(湖南省人民医院)综合楼中心实验室平台完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SD大鼠雌性32只(8周龄，体质量200-250 g)，SD大鼠雄性16只(8周龄，体质量250-300 g)，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，湖南师范大学附属第一医院(湖南省人民医院)动物实验室统一喂养。动物实验方案通过湖南师范大学附属第一医院(湖南省人民医院)医学科研伦理审查委员会批准(批准号：202022)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 实验主要药品、试剂吗替麦考酚酯胶囊(上海罗氏制药有限公司)；玉米油(山东三星玉米产业科技有限公司)；无水乙醇、二甲苯(湖南汇虹)；PBS(安恺立)；鼠/兔通用型试剂盒、DAB试剂盒(AURAGENE)；一抗(CRABP1)、二抗(抗-兔-IgG抗体-HP多聚体)(Proteintech 中国公司)。
1.3.3 实验主要仪器 YD-31切片机(浙江金华益迪试验器材公司)；BMJ-A包埋机(常州中威电子仪器公司)；TS-92摇床(其林贝尔公司)；DYY-6C恒温箱(北京六一公司)；DM2000 LED显微镜、M199切片刀(德国Leica仪器有限公司)；181311537游标卡尺(德国艾瑞泽)；Q/DHDZ001-2016电子秤(深圳帝衡)；Skyscan1174 Micro-CT(比利时Bruker公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验动物饲养及配对将成年SD大鼠适应性饲养1周。在雌性SD大鼠预期排卵期与雄性SD大鼠配对，晚8点将SD大鼠按雌雄比2∶1合笼，次日早上8点检查雌鼠，发现阴栓定为孕0 d(G0)。
1.4.2 分组和给药将32只SD大鼠孕鼠随机分为4组，分别记为对照组、吗替麦考酚酯50，100，200 mg/kg组，每组8只。于孕9-10 d每天早上8点分别用50，100，200 mg/kg吗替麦考酚酯玉米油灌胃1次，对照组于孕9-10 d每天早上8点用1.0 mL玉米油灌胃1次。
1.5 主要观察指标孕20.5 d麻醉后脱颈处死各组孕鼠，解剖子宫，取出胚胎。

1.5.1 大体指标观察观察各组胚胎总数、活胎数、死胎数、吸收胎数、活胎率，记录各组活胎的畸形胎数、耳畸形胎数、耳畸形胎率，测量包括耳横长、耳纵长、耳纵长/耳横长、鼻枕距/双顶径、眼距、体长、体质量等参数。

1.5.2 影像学检查各组胚胎标本头颅行micro-CT检测观察中耳及内耳发育情况。
1.5.3 组织学检测各组胚胎外耳标本行苏木精-伊红染色、甲胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色[28-29]，观察耳郭软骨及软组织改变。
1.6 统计学分析使用SPSS 22.0统计软件进行统计学处理，结果用x±s表示。先进行正态性和方差齐性检验，采用单因素方差分析比较多组间数据的差异，采用t检验及卡方检验进行多组间两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经湖南师范大学附属第一医院专家审核。

讨论

先天性小耳畸形临床亦称为半侧颜面短小征、眼-耳-脊柱序列征、Godenhar 综合征等，临床表现为耳郭结构的大部分缺失甚至无耳郭，其发病率在颅颌面畸形中位居第二，在各类人口出生缺陷中位居前十(《中国出生缺陷防治报告》)[30]。先天性小耳畸形的发病机制尚不明确，目前研究主要包括 3 个方面：①流行病学研究，目前研究认为小耳畸形与环境及遗传因素共同作用有关，孕妇吸烟、饮酒、服药、糖尿病、孕早期感染、受教育程度低等均为发病的环境危险因素[31]。②临床研究，取患者或尸体标本，通过全基因组关联研究、信号通路研究、染色体研究等，比较正常人与先天性小耳畸形患者的遗传学差异[32-33]。③建立动物模型，这是研究小耳畸形发生机制非常重要的手段。先天性小耳畸形的发病机制十分复杂，人体实验涉及自然因素、患者隐私、伦理及社会限制等，往往无法深入开展。动物模型可以基本代替人体试验，通过人为控制实验条件，排除干扰因素，筛选或诱导先天性小耳畸形动物，可对疾病的发病机制、发展规律、防治措施进行全面而深入的探究。因此，建立稳定的特异性小耳畸形动物模型仍是先天性小耳畸形发病机制研究中的关键问题。
大鼠与人类耳器官具有相似的解剖结构、遗传学特点、生理及病理特征，且其具有繁殖快、产仔多、生长发育快等特点，七八周达性成熟，可进行交配，性周期4 d且全年多发情，孕期为21-22 d，每胎产仔可达10余只，因此实验周期短、费用相对较低，是最常用的实验动物。适合做药物致畸模型的初步实验，因此该实验选择SD大鼠制备吗替麦考酚酯致小耳畸形动物模型。动物与人类对药物耐受性存在较大差别，用药前需进行换算。给药剂量可以通过2条途径获得：一是参考文献，根据前人的经验选择给药剂量，目前未见吗替麦考酚酯诱导大鼠小耳畸形的仿临床动物模型；二是通过计算，大鼠对致畸作用具有较强耐受性，根据吗替麦考酚酯使用说明书及致畸文献报道，孕妇使用后生产出小耳畸形患儿的剂量范围为0.5-2.0 g/d，根据人与动物等效剂量系数换算法，大鼠的等效剂量约为人类的6.3倍，因此该实验采用的剂量范围为 50-200 mg/kg。大鼠分娩后母鼠会吞食死胎、低活力胎，因此该实验于分娩前一两天，即孕 20.5 d处死孕鼠取胚胎，此时胚胎已基本发育成熟。
研究结果显示，从大体指标结果发现，对照组大鼠胚胎无畸形，活胎率为96.9%；吗替麦考酚酯50 mg/kg组胚胎活胎率为91.4%，胚胎畸形率为 10.5%，耳畸形率为9.3%，以小耳畸形、小眼畸形为主要异常表现；吗替麦考酚酯100 mg/kg组活胎率为72.3%，胚胎畸形率为45.2%，耳畸形率为39.7%，出现包括小耳畸形、小眼畸形、小颌畸形、脑膨出、小头畸形为主的多种畸形；吗替麦考酚酯200 mg/kg组活胎率为21.6%，胚胎畸形率为100.0%，耳畸形率为90.4%，畸形包括小耳、无耳、无眼、脑膨出、无脑等。对照组耳郭近似三角形，呈粉红色；吗替麦考酚酯50 mg/kg组耳郭近似三角形；吗替麦考酚酯100 mg/kg组耳郭近似圆弧、较小，皮肤菲薄；吗替麦考酚酯200 mg/kg组耳郭呈点状、条索状或未发育。通过比较各组耳郭形状及大小，发现吗替麦考酚酯干预组随药物剂量增加个体减小，同时耳郭也缩小。从micro-CT影像学结果发现，吗替麦考酚酯影响大鼠胚胎内耳及中耳发育，且与剂量相关。耳软骨组织学显示，吗替麦考酚酯影响软骨细胞增生、分化及Ⅱ型胶原表达，提示吗替麦考酚酯影响耳郭发育，且呈剂量依赖性。综合以上，作者认为吗替麦考酚酯可导致大鼠胚胎整体及耳郭组织发育不良，且呈剂量依赖性。
目前有较多吗替麦考酚酯致新生儿先天性小耳畸形的临床报道，但其致畸机制仍不明确。SCHMIDT等[34]利用胚胎体外培养技术探讨吗替麦考酚酯导致小耳畸形的机制，发现干预后大鼠胚胎出现鳃弓融合、眼囊泡及耳囊泡消失，推测其致畸机制与吗替麦考酚酯的药理作用相关，即抑制次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(IMPDH)，阻止了鸟嘌呤的合成。LAKE等[35]发现在神经嵴早期通过转基因技术去除IMPDH作用的小鼠出现高渗透性肠神经节病、颅面骨骼发育不全、心脏流出道和大血管畸形等缺陷，表明IMPDH2介导的鸟嘌呤核苷酸合成对于肠神经系统和其他神经嵴的正常发育至关重要。颅神经嵴细胞是一个暂时的多功能细胞团，参与颅颌面主要组织器官的形成，它的迁移、增殖和分化是耳郭发育的重要步骤[36]。不同部位的颅神经嵴细胞具有精确的迁移路径，在体内微环境的诱导下，以细胞流的形式迁入颅面特定部位，进而分化为颅面不同器官[37]，中脑后部颅神经嵴细胞参与上颌骨以及第一鳃弓的形成，迁入第一、二鳃弓的颅神经嵴细胞在内外胚层诱导下，发育形成耳郭软骨和部分外耳道[38]，软骨由软骨细胞和细胞外基质构成[39]，Ⅱ型胶原是软骨组织的特异性标志物[40]，主要功能是为软骨细胞的黏附提供基础，参与软骨细胞的分化调节，为软骨组织提供张力和承受力[41]。该实验耳软骨组织学显示，吗替麦考酚酯影响软骨细胞增生、分化及Ⅱ型胶原表达，所以，作者认为吗替麦考酚酯导致耳郭发育不良可能是因为其阻止了软骨细胞增生、分化及Ⅱ型胶原表达。
实验发现，吗替麦考酚酯50 mg/kg组活胎数为86只，耳畸形数为8只，活胎数多，出现耳畸形的胎数少，考虑药物剂量过小。吗替麦考酚酯200 mg/kg组活胎数为 21只，耳畸形数为 19只，耳畸形胎数增多，但活胎数总体少，死亡率高，考虑药物剂量过大。吗替麦考酚酯100 mg/kg组活胎数为 73只，耳畸形数为 24只，既能保证较多的活胎，又能诱导出相对较多的耳畸形胎。因此在该实验条件下，100 mg/kg 是吗替麦考酚酯诱导大鼠小耳畸形动物模型比较适宜的干预剂量。
该研究通过大鼠孕鼠暴露在不同剂量吗替麦考酚酯环境中，观察到了吗替麦考酚酯对耳郭发育的影响，初步确定吗替麦考酚酯可能诱导建立小耳畸形动物模型，为进一步探讨先天性小耳畸形的发病机制提供了实验室基础。但在实验过程中也发现一些局限性：吗替麦考酚酯干预时间窗难以精确，颅神经嵴细胞参与颅面主要器官的形成，当其受到环境因素干扰，可导致颅面多种畸形，亦可导致单一器官畸形，考虑颅神经嵴细胞在向不同器官迁移分化时，具有不同的具体的时间窗。因此，诱导单一耳畸形模型的精确的时间窗值得进一步探讨。吗替麦考酚酯干预剂量难以精确，该实验通过人与动物等效剂量系数换算法进行临床与大鼠之间的药物剂量换算，这是动物给药实验最常使用的换算方法，但动物种属、品系、药物种类、给药方法及测试指标等都会影响剂量换算的准确性。实验剂量过小出现耳畸形的胎数少，剂量过大导致死胎及吸收胎数增多，耳畸形胎数反而减少。因此，最佳给药剂量及给药时间仍值得进一步探讨。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

吗替麦考酚酯对大鼠胚胎耳郭发育的影响

Effects of mycophenolate mofetil on the development of rat embryonic auricle

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