2.1   实验动物数量分析   研究共有50只大鼠(假手术组25只，模型组25只)完成实验。
2.2   模型大鼠神经病理性疼痛及抑郁样行为   两组大鼠术前机械刺激缩足阈值差异无显著性意义(P > 0.05)。假手术组大鼠术后1-5周机械刺激缩足阈值略有下降，考虑与手术切口、切口缝合有关。与术前比较，模型组大鼠术后1周机械痛敏缩足阈值显著降低，且明显低于假手术组(P < 0.05)，术后第2周机械痛敏缩足阈值继续下降，与术后1周及假手术组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，提示模型组大鼠术后1周即出现明显神经病理性疼痛，第2周疼痛持续加重；术后3-5周模型组大鼠机械痛敏缩足阈值仍显著低于假手术组，但机械痛敏缩足阈值未再持续降低，提示神经病理性疼痛程度未再加重，相对稳定，见表1和图3A。




两组大鼠糖水偏爱度及游泳不动时间在术前差异无显著性意义(P > 0.05)。假手术组大鼠术后1-5周糖水偏爱度及游泳不动时间较术前差异无显著性意义，观察期间整体波动很小，提示无明显抑郁样行为。模型组大鼠糖水偏爱度术后一两周较术前及假手术组差异无显著意义，自术后3周开始下降，且明显低于术前及假手术组(P < 0.05)，术后第4，5周糖水偏爱度继续下降。模型组大鼠游泳不动时间自术后2周开始明显延长，且在术后3-5周持续延长，并显著高于假手术组。以上结果提示坐骨神经慢性压迫性损伤模型大鼠在神经病理性疼痛出现两三周才开始出现明显的抑郁样行为；尽管实验后期疼痛相对稳定，而抑郁样行为在逐渐加重，见图3B，C。



2.3   模型大鼠坐骨神经功能及结构    两组大鼠坐骨神经功能指数在术前差异无显著性意义(P > 0.05)。假手术组大鼠坐骨神经功能指数术后1-5周较术前差异均无显著性意义；而模型组大鼠在术后1周坐骨神经功能指数下降明显，术后2周继续下降至最低值，术后3-5周坐骨神经功能指数值有轻度上升，但仍显著低于假手术组(P < 0.05)，见表2，见图4。







假手术组大鼠右侧坐骨神经组织结构清晰完整，周围髓鞘呈空网状，排列密集整齐，各轴突表面神经内膜轮廓清晰，未见明显病理变化。模型组大鼠术后1周的坐骨神经结构完整清晰，纤维组织结构轻度排列紊乱，髓鞘轻度肿胀和变性，形态和大小排列略不规则，神经束膜有少许炎细胞浸润；第2，3周，轴索中度肿胀，神经纤维排列紊乱、变性坏死，见坏死神经纤维发生溶解，神经纤维间血管扩张，轻微充血；第4，5周，以上病理改变明显逐渐加重，纤维束结构不清，发生溶解乃至完全消失，轴突重度排列紊乱，轴索肿胀形成空泡呈空网状，神经纤维重度肿胀和变性，神经束膜炎细胞浸润，见图5。



2.4   模型大鼠右侧坐骨神经对[18]氟脱氧葡萄糖摄取增加   两组大鼠在术前各项指标差异无显著性意义(P > 0.05)；第1-5周，两组大鼠双侧大脑半球[18]氟脱氧葡萄糖均摄取对称、均匀，未见异常浓聚/稀疏区，平均标准化摄取值差异无显著性意义(P > 0.05)。术后第1周，模型组大鼠右侧坐骨神经/肝脏平均标准化摄取值与假手术组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；术后第2-4周，模型组大鼠右侧坐骨神经/肝脏平均标准化摄取值较假手术组明显增加(P < 0.05)，提示模型组大鼠损伤的坐骨神经局部糖摄取明显增加，见图6，7。








2.5   模型大鼠左侧无粒型岛叶皮质背侧区mGluR5和NMDAR2B表达水平增高   术后第5周，与假手术组相比，模型组大鼠左侧无粒型岛叶皮质背侧区中mGluR5和NMDAR2B表达水平明显升高(P < 0.05)，见图8。

[1] MORI N, HOSOMI K, NISHI A, et al. Analgesic Effects of Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation at Different Stimulus Parameters for Neuropathic Pain: A Randomized Study. Neuromodulation. 2022;25(4):520-527. [2] ZHANG W, SUO M, YU G, et al. Antinociceptive and anti-inflammatory effects of cryptotanshinone through PI3K/Akt signaling pathway in a rat model of neuropathic pain. Chem Biol Interact. 2019;305:127-133. [3] SAMPSON SM, KUNG S, MCALPINE DE, et al. The use of slow-frequency prefrontal repetitive transcranial magnetic stimulation in refractory neuropathic pain. J ect. 2011;27(1):33-37. [4] 郭铁成, 许惊飞. 低频和高频重复经颅磁刺激对大鼠神经病理性疼痛及背根神经节内nNOS的影响[J]. 中华物理医学与康复杂志,2014,36(11): 823-8273. [5] BOUHASSIRA D. Neuropathic pain: Definition, assessment and epidemiology. Rev Neurol (Paris). 2019;175(1-2):16-25. [6] HSU JH, DASKALAKIS ZJ, BLUMBERGER DM. An Update on Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation for the Treatment of Co-morbid Pain and Depressive Symptoms. Curr Pain Headache Rep. 2018;22(7):51. [7] LI J X. Pain and depression comorbidity: a preclinical perspective. Behav Brain Res. 2015;276:92-98. [8] HUMO M, LU H, YALCIN I. The molecular neurobiology of chronic pain-induced depression. Cell Tissue Res. 2019;377(1):21-43. [9] SEMINOWICZ DA, DE MARTINO E, SCHABRUN SM, et al. Left dorsolateral prefrontal cortex repetitive transcranial magnetic stimulation reduces the development of long-term muscle pain. Pain. 2018;159(12):2486-2492. [10] SEMINOWICZ D A, MOAYEDI M. The Dorsolateral Prefrontal Cortex in Acute and Chronic Pain. J Pain. 2017;18(9):1027-1035. [11] LAUBACH M, AMARANTE L M, SWANSON K, et al. What, If Anything, Is Rodent Prefrontal Cortex? eNeuro. 2018;5(5):ENEURO.0315-18.2018. [12] 祝建平. 束缚-浸水应激大鼠内侧前额叶皮质对胃机能的调控作用及机制的研究[D].济南:山东师范大学,2015. [13] OBARA I, GOULDING SP, HU JH, et al. Nerve injury-induced changes in Homer/glutamate receptor signaling contribute to the development and maintenance of neuropathic pain. Pain. 2013;154(10):1932-1945. [14] LARSSON M, BROMAN J. Synaptic plasticity and pain: role of ionotropic glutamate receptors. Neuroscientist. 2011;17(3):256-273. [15] PEREIRA V, GOUDET C. Emerging Trends in Pain Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors. Front Mol Neurosci. 2018;11:464. [16] GONG K, KUNG L H, MAGNI G, et al. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PLoS One. 2014;9(4):e95491. [17] GIORDANO C, CRISTINO L, LUONGO L, et al. TRPV1-dependent and -independent alterations in the limbic cortex of neuropathic mice: impact on glial caspases and pain perception. Cereb Cortex. 2012;22(11):                  2495-2518. [18] INQUIMBERT P, BARTELS K, BABANIYI OB, et al. Peripheral nerve injury produces a sustained shift in the balance between glutamate release and uptake in the dorsal horn of the spinal cord. Pain. 2012;153(12):2422-2431. [19] XIE JD, CHEN SR, PAN HL. Presynaptic mGluR5 receptor controls glutamatergic input through protein kinase C-NMDA receptors in paclitaxel-induced neuropathic pain. J Biol Chem. 2017;292(50):20644-20654. [20] FONSECA-RODRIGUES D, AMORIM D, ALMEIDA A, et al. Emotional and cognitive impairments in the peripheral nerve chronic constriction injury model (CCI) of neuropathic pain: A systematic review. Behav Brain Res. 2021;399:113008. [21] AUSTIN PJ, WU A, MOALEM-TAYLOR G. Chronic constriction of the sciatic nerve and pain hypersensitivity testing in rats. J Vis Exp. 2012;(61):3393. [22] MEDEIROS P, DOS SANTOS IR, JÚNIOR IM, et al. An Adapted Chronic Constriction Injury of the Sciatic Nerve Produces Sensory, Affective, and Cognitive Impairments: A Peripheral Mononeuropathy Model for the Study of Comorbid Neuropsychiatric Disorders Associated with Neuropathic Pain in Rats. Pain Med. 2021;22(2):338-351.  [23] IÑIGUEZ SD, FLORES-RAMIREZ FJ, RIGGS LM, et al. Vicarious Social Defeat Stress Induces Depression-Related Outcomes in Female Mice. Biol Psychiatry. 2018; 83(1):9-17. [24] LIU M Y, YIN C Y, ZHU LJ, et al. Sucrose preference test for measurement of stress-induced anhedonia in mice. Nat Protoc. 2018;13(7):1686-1698. [25] MORENO-SANTOS B, MARCHI-COELHO C, COSTA-FERREIRA W, et al. Angiotensinergic receptors in the medial amygdaloid nucleus differently modulate behavioral responses in the elevated plus-maze and forced swimming test in rats. Behav Brain Res. 2021;397:112947. [26] CUI M, LIANG J, XU D, et al. NLRP3 inflammasome is involved in nerve recovery after sciatic nerve injury. Int Immunopharmacol. 2020;84:106492. [27] TSUANG FY, CHEN MH, LIN FH, et al. Partial enzyme digestion facilitates regeneration of crushed nerve in rat. Transl Neurosci. 2020;11(1):251-263. [28] KREMER M, BECKER LJ, BARROT M, et al. How to study anxiety and depression in rodent models of chronic pain?. Eur J Neurosci. 2021;53(1): 236-270. [29] LI Q, YUE N, LIU SB, et al. Effects of chronic electroacupuncture on depression- and anxiety-like behaviors in rats with chronic neuropathic pain. Evid Based Complement Alternat Med. 2014;2014:158987. [30] LI Y, CHEN C, LI S, et al. Ginsenoside Rf relieves mechanical hypersensitivity, depression-like behavior, and inflammatory reactions in chronic constriction injury rats. Phytother Res. 2019;33(4):1095-1103. [31] FUKUHARA K, ISHIKAWA K, YASUDA S, et al. Intracerebroventricular 4-methylcatechol (4-MC) ameliorates chronic pain associated with depression-like behavior via induction of brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Cell Mol Neurobiol. 2012;32(6):971-977. [32] GARG S, DESHMUKH VR, PRASOON P. Possible modulation of PPAR-γ cascade against depression caused by neuropathic pain in rats. J Basic Clin Physiol Pharmacol. 2017;28(6):593-600. [33] WANG C, CHEN P, LIN D, et al. Effects of varying degrees of ligation in a neuropathic pain model induced by chronic constriction injury. Life Sci. 2021;276:119441. [34] CHERIF F, ZOUARI HG, CHERIF W, et al. Depression Prevalence in Neuropathic Pain and Its Impact on the Quality of Life. Pain Res Manag. 2020;2020:7408508. [35] LEUNG A, METZGER-SMITH V, HE Y, et al. Left Dorsolateral Prefrontal Cortex rTMS in Alleviating MTBI Related Headaches and Depressive Symptoms. Neuromodulation. 2018;21(4):390-401. [36] BRIGHINA F, DE TOMMASO M, GIGLIA F, et al. Modulation of pain perception by transcranial magnetic stimulation of left prefrontal cortex. J Headache Pain. 2011;12(2):185-191. [37] DE MARTINO E, SEMINOWICZ DA, SCHABRUN SM, et al. High frequency repetitive transcranial magnetic stimulation to the left dorsolateral prefrontal cortex modulates sensorimotor cortex function in the transition to sustained muscle pain. Neuroimage. 2019;186:93-102. [38] ZHU CZ, WILSON SG, MIKUSA JP, et al. Assessing the role of metabotropic glutamate receptor 5 in multiple nociceptive modalities. Eur J Pharmacol. 2004;506(2):107-118. [39] CHUNG G, KIM SJ, KIM SK. Metabotropic Glutamate Receptor 5 in the Medial Prefrontal Cortex as a Molecular Determinant of Pain and Ensuing Depression. Front Mol Neurosci. 2018;11:376. [40] CHUNG G, KIM CY, YUN YC, et al. Upregulation of prefrontal metabotropic glutamate receptor 5 mediates neuropathic pain and negative mood symptoms after spinal nerve injury in rats. Sci Rep. 2017;7(1):9743. [41] 车银伟, 蔡国洪, 王鑫,等. 神经病理性痛条件下前额叶皮质内代谢型谷氨酸受体第5亚型的表达及分布变化[J]. 神经解剖学杂志,2016, 32(3):301-306. [42] 王云霞, 付淼, 罗芳. 脉冲射频对坐骨神经慢性压迫模型大鼠的痛觉过敏及脊髓背角NR2B亚基表达的作用[J]. 中国康复理论与实践,2016, 22(9):1020-1023. [43] WANG XY, ZHOU HR, WANG S, et al. NR2B-Tyr phosphorylation regulates synaptic plasticity in central sensitization in a chronic migraine rat model. J Headache Pain. 2018;19(1):102. [44] NIU Y, ZENG X, ZHAO L, et al. Metabotropic glutamate receptor 5 regulates synaptic plasticity in a chronic migraine rat model through the PKC/NR2B signal. J Headache Pain. 2020;21(1):139. [45] 黄敏, 许涛, 江伟. 代谢型谷氨酸受体5与N-甲基-D-天冬氨酸受体的关系及其在疾病中的作用[J]. 上海交通大学学报(医学版),2018,38(7): 825-828. [46] HOOKER JM, CARSON RE. Human Positron Emission Tomography Neuroimaging. Annu Rev Biomed Eng. 2019;21:551-581. [47] KIM C E, KIM Y K, CHUNG G, et al. Large-scale plastic changes of the brain network in an animal model of neuropathic pain. Neuroimage. 2014; 98:203-215. [48] BEHERA D, JACOBS KE, BEHERA S, et al. (18)F-FDG PET/MRI can be used to identify injured peripheral nerves in a model of neuropathic pain. J Nucl Med. 2011;52(8):1308-1312. [49] LEE S H, SEO HG, OH BM, et al. (18)F-FDG positron emission tomography as a novel diagnostic tool for peripheral nerve injury. J Neurosci Methods. 2019;317:11-19.

[1]	李梦菲, 仉 红, 赵少剑, 殷广浩, 王其宝. 叉头样转录因子3在粪肠球菌感染模型大鼠难治性根尖周炎病变中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1187-1192.
[2]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣 慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[3]	廖益东, 明 江, 宋文学, 王梓力, 张 宇, 廖一飞, 徐卡娅, 杨 华. 一种同时培养原代皮质及海马神经元的实验方法[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 897-902.
[4]	李晓寅, 杨晓青, 陈淑莲, 李正超, 王梓琪, 宋 震, 朱达仁, 陈旭义. 胶原/丝素蛋白支架联合神经干细胞治疗创伤性脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 890-896.
[5]	杨 恒, 郑丽英, 刘志立, 王勤章, 郝志强, 王敬珅, 汪 渊, 李永乐, 谭明辉, 邹晓峰, 张国玺, 黄若辉, 江 波, 钱 彪. 结扎不同部位输精管大鼠睾丸的生理功能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 720-725.
[6]	王金玲, 黄夏荣, 屈萌艰, 黄福锦, 尹林伟, 钟培瑞, 刘 静, 孙光华, 廖 阳, 周 君. 运动训练老年骨质疏松大鼠骨量及骨微结构的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 676-682.
[7]	刘运琴, 林 丽, 肖文昊, 戢秋明, 刘燕芹. 淫羊藿苷对精神分裂症模型大鼠认知及海马组织NRG1/ErbB信号通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3236-3241.
[8]	税晓平, 李春莹, 李明娟, 李顺昌, 孙君志, 苏全生. 有氧和抗阻运动干预2型糖尿病模型大鼠海马抗氧化应激指标和脑源性神经营养因子表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 264-269.
[9]	陈晓驷, 谭小艳, 刘田丰, 韩登鹏, 魏 波, 胡资兵, 吴少科. 积雪草酸对骨质疏松模型大鼠生物力学特性与骨小梁面积及Runx2蛋白的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 246-251.
[10]	王欢欢, 王 青, 唐 鹏, 张 睿, 闵红巍. 体外冲击波干预骨关节炎大鼠软骨细胞的增殖和自噬[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 252-257.
[11]	娄旭佳, 阮 蓉, 金其贯, 胡玉龙. 白藜芦醇干预运动性疲劳模型大鼠线粒体动力学的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(17): 2625-2630.
[12]	战 莹, 武晓丹, 郝珊瑚. 放射性131Ⅰ 诱导的甲状腺功能减退大鼠模型的构建[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(17): 2631-2636.
[13]	王 京, 卢思彤, 吴印林, 刘玉东, 邹维艳, 孙美群. 新生SD大鼠大脑皮质神经元的原代培养及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2344-2349.
[14]	徐明奎, 许日明, 林业武, 罗原泰, 张熙辉, 周 理, 袁仕国. 柚皮素调控巨噬细胞极化和肌卫星细胞增殖修复骨骼肌损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(14): 2133-2138.
[15]	胡金龙, 全桦红, 王静成, 张 佩, 张家乐, 陈鹏涛, 梁 远. 温敏性水凝胶Pluronic F127载硫化铜纳米颗粒修复大鼠感染性创面[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(12): 1927-1931.

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是由躯体感觉神经系统疾病或损伤所引起的难治性慢性疼痛，严重损害患者身体、心理、情绪和社会功能[1-5]。研究表明，神经病理性疼痛患者极易伴有抑郁、焦虑等情绪障碍，而抑郁状态可能会加剧疼痛[6]。然而，疼痛和抑郁之间动态相互作用及潜在机制仍不完全清楚[7]。疼痛和抑郁的密切关系可能是由于两者具有共同的潜在生物学机制，例如表观遗传修饰、转录因子、代谢型谷氨酸受体、去甲肾上腺素等，是目前国内外研究的热点[8]。 研究表明，神经病理性疼痛会导致产生持久的前额叶皮质功能障碍，尤其是背外侧前额叶皮质(The dorsolateral prefrontal cortex，DLPFC)与疼痛、认知、情感体验和情绪调制有关，可能参与了神经病理性疼痛及神经病理性疼痛致抑郁过程[9-10]。灵长类背外侧前额叶皮质在啮齿动物中没有直接同源物，但大鼠大脑具有功能划分的前额叶皮质，不仅包括灵长类动物内侧和眼眶区域的特征，还包括背外侧前额叶皮质的特征[11]。在大鼠前额叶区具有背外侧前额叶皮质功能的区域主要包括岛状颗粒状皮质(无粒型岛叶皮质背侧和腹侧区)和前额叶皮质区域2[12]。
前额叶皮质参与周围神经损伤所致神经病理性疼痛与外周及中枢敏化有关，过程包括外周和中枢神经系统内谷氨酸的释放、兴奋性神经元放电的增加以及伤害性网络的重组等[13-14]。目前研究显示，谷氨酸在疼痛感觉和传播中起着关键作用，谷氨酸受体有望是缓解疼痛的重要潜在靶标[15]。其中，Gq/o偶联的代谢型谷氨酸受体5(Metabotropic glutamate receptors 5，mGluR5)以及(或与)离子型N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-Methyl-D-Aspartic acid receptor，NMDAR)与伤害性感受密切相关[13，16]。研究发现坐骨神经分支选择性损伤小鼠模型中，大脑边缘前和边缘下皮质谷氨酸能刺激谷氨酸能神经元中NMDAR2B和mGluR5激活发挥抗伤害感受性作用，增强神经兴奋性[17]；同时，神经损伤后调节谷氨酸稳态的内在机制会受到严重破坏，细胞外谷氨酸升高与mGluR5激活相关，促使谷氨酸释放进一步增强[18]。此外，mGluR1/5和NMDAR能够相互作用与影响，共同维持并增强兴奋性突触传递[19]。然而前额叶皮质中mGluR5和NMDAR在神经病理性疼痛-抑郁中的作用机制尚不完全清楚。因此，此次研究拟以坐骨神经慢性压迫性损伤模型大鼠为研究对象，探索疼痛与抑郁样行为的特点及其相互作用，并观察神经病理性疼痛大鼠左侧无粒型岛皮质背侧区mGluR5和NMDAR2B蛋白表达情况，初步探索其可能的机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，采用重复测量方差分析和独立样本t检验进行统计学分析，研究采用盲法评估。
1.2   时间及地点   实验于2020年10月至2021年3月在西南医科大学动物实验中心及临床医学研究中学心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验试剂   戊巴比妥钠、体积分数75%医用乙醇(广州宝汇生物科技有限公司)；40 g/L多聚甲醛固定液(天津福晨化学试剂有限公司)；AR级无水乙醇(成都海兴化工试剂厂)；AR级二甲苯(天津致远化学试剂有限公司)；苏木素染液、伊红染液(武汉塞维尔生物科技有限公司)；封片试剂(Biosharp公司)；细胞裂解液(碧云天公司)；PVDF膜(Sigmaaldrich公司)；Glycine、SDS、甘氨酸、十二烷基磺酸钠(德国Biofroxx公司)；mGluR5、NMDAR2B、β-actin抗体(abcam公司)；[18]氟脱氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose，[18]F-FDG)(西南医科大学附属医院核医学与分子影像四川省重点实验室)。
1.3.2   实验仪器   立体定位仪(玉研仪器公司)；Von Frey纤维丝(Aesthesio，RED)；电子天平(厦门莱斯德科学仪器)；转轮式切片机(德国徕卡-2016)；JT-12S自动组织脱水机(武汉俊杰电子有限公司)；BMJ-A型包埋机、RS36型全自动染色机(常州派斯杰医疗设备公司)；micro-PET/CT(SIEMENS Inveon MM)；ECL发光试剂盒(Affinity公司)；PAGE凝胶快速制备试剂盒(上海雅酶生物公司)；数码三目摄像显微镜(Panthera，麦克奥迪公司)；涡旋振荡仪(海门其林贝尔)；手持匀浆机(上海泸析)；离心机(德国Eppendorf公司)；C-DigitR化学发光检测仪(Gene公司)；电泳仪(北京君意东方电泳设备公司)；化学发光凝胶成像仪5200(上海天能科技有限公司)。
1.3.3   实验动物   选取50只清洁级雄性SD大鼠，体质量220-240 g，8周龄。大鼠采购并饲养于西南医科大学动物实验中心，实验动物质量合格证号：SYXK(川)2018-065。
实验方案经西南医科大学动物实验伦理委员会批准(批准号为2020412)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.4   实验方法   
1.4.1   实验流程   将50只大鼠通过随机数字表法分为坐骨神经慢性压迫性损伤模型组即模型组 (n=25)和假手术组(n=25)，实验流程图见图1。造模后分别从两组大鼠中随机选取5只大鼠进行标记，并饲养至实验结束，在术后1-5周每周测量机械痛敏缩足阈值(the paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)、糖水偏爱测试、强迫游泳测试和坐骨神经功能指数(sciatic nerve function index，SFI)；5周时完成上述测试后行micro-PET/CT显像、坐骨神经苏木精-伊红染色和大脑Western-blot；术后1-4周每周从两组剩余20只大鼠中各随机选取5只大鼠行micro-PET/CT显像及坐骨神经苏木精-伊红染色。 

1.4.2   建立坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠模型   采用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔内注射麻醉大鼠后脱去右下肢后外侧毛发，在股骨下方3.0-4.0 mm处皮肤上作一平行切口，钝性分离皮下结缔组织、臀浅肌和股二头肌，拉开肌肉暴露出坐骨神经干后在坐骨神经三叉处近端用双结结扎4个环，每个环相距1 mm。结扎松紧适宜，以观察到肌肉短暂抽搐为宜。假手术组大鼠仅暴露坐骨神经干，不予结扎，其余操作与模型组相同，见图2。

1.4.3   机械痛敏缩足阈值测定   于术前1 d(0周)、术后1-5周每周对大鼠进行机械痛敏缩足阈值测试，所有测试均在日间上午(08：00-12：00 h)进行。测试方法：将大鼠放置在一个带有金属丝网底部的塑料笼中，行为适应约15 min，直到笼子探索和其余行为活动停止为止。测试的区域是坐骨神经分布的足底中央后爪，避免了较不敏感的脚垫[21]。利用Von Frey纤维丝垂直于足底表面，用足够的力量使之轻微弯曲在脚掌上，并保持大约5 s，以几秒钟的间隔重复刺激，观察大鼠对刺激的行为反应。如果爪子迅速撤回或者出现舔足行为则被认为是阳性反应。如果大鼠对5个刺激中的至少3个没有反应，那么就测试下一个更硬的细丝，直到出现阳性反应。出现3次以上阳性反应的刺激克数定为机械痛敏缩足阈值[22]。
1.4.4   抑郁样行为测试   糖水偏爱测试常用于测量大鼠的快感缺失，即大鼠无法从奖励或愉快的活动中体验快乐[23]。 对于人类来说，快感缺失是抑郁症的核心症状[24]。此外，常使用强迫游泳测试用于评估大鼠的行为绝望/焦虑样效应(类似抑郁的行为)[25]。
(1) 糖水偏爱测试：于术前1 d(0周)、术后1-5周每周对大鼠进行糖水偏爱测试。进行测试之前需进行糖水适应：2个瓶子均装满1%蔗糖溶液放置于笼内，大鼠自由活动12 h；随后，将2瓶蔗糖溶液换成1瓶装自来水，1瓶装1% 蔗糖溶液，大鼠自由活动6 h后调换水瓶的位置(即左或右)，再次适应6 h。测试前禁食禁水24 h，测试时将预先称质量的2个瓶子分别装纯水和1%蔗糖溶液，消耗液体1 h；随后调换水瓶和蔗糖瓶的位置，继续消耗液体1 h。测试结束后，计算糖水偏好度，公式：
糖水偏好(%) =蔗糖消耗量/(蔗糖消耗量+水消耗量)
若该比值降低，表明大鼠快感降低。
(2)强迫游泳测试：于术前1 d(0周)、术后1-5周每周对大鼠进行强迫游泳测试。将大鼠置于30 cm深、盛满自来水(温度：25-27 ℃)的水缸(高45 cm，直径20 cm)自由游泳6 min，记录后5 min内静止不动时间。在正式测试前需进行预游泳15 min，然后用毛巾和暖炉将大鼠干燥并返回其家笼。24 h后，对大鼠进行6 min的游泳测试，记录后5 min内的静止不动时间。测试完1只大鼠后换水后再进行下一次测试，防止气味、毛发等干扰其余大鼠的测试结果。不动定义为大鼠保持直立在水中漂浮并停止挣扎或只有鼻子露出水面，3只爪子运动迟缓，只有第4只爪子有最小的运动。
1.4.5   坐骨神经功能指数测试   分别于术前1天(0周)、术后1-5周每周对大鼠进行坐骨神经功能指数测试。坐骨神经功能指数被广泛应用于测定小鼠和大鼠坐骨神经损伤后运动功能恢复情况[26]。准备一狭长纸盒(9 cm×10 cm×60 cm)，两侧用塑料板围起，尽头放置一个深色的纸箱，地面覆盖一条8.6 cm×59.4 cm的干净白纸，大鼠足跖蘸墨水，被放在跑道入口处，径直穿过跑道进入纸箱，使其在白纸上留下脚印，从每只大鼠的一连串脚印中选择3个清晰的脚印，并用直尺测量正常(N)和实验(E)后爪的3个足迹参数：①第3趾到脚跟的纵向距离(分别为NPL和EPL)；②第1趾到第5趾的横向距离(分别为NTS和ETS)；③第2趾到第4趾的横向距离(分别为NIT和EIT)。将参数带入以下公式计算得出坐骨神经功能指数(SFI)：SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EITS-NITS)/NITS]-8.8 “SFI=0”表示完全正常，“SFI=-100”表示完全损伤，SFI绝对值越高，提示坐骨神经功能损伤越严重[27]。
1.4.6   micro-PET/CT扫描   术后1-5周每周分别对两组各5只大鼠进行micro-PET/CT显像。显像前大鼠禁食12 h，麻醉后经尾静脉注射[18]氟脱氧葡萄糖剂量14.8-22.2 MBq，体积约0.2 mL。注射后静置30 min，将大鼠头部向内放置在俯卧位成像床上，先进行头部静态PET扫描20 min并连续进行CT扫描20 min，后进行下肢扫描。图像采集为软件为SIEMEN Inveson Research Workplace v4.2，分析软件为ASI Pro VM。对所采集图像进行视觉和半定量分析，视觉评估主要对大鼠左侧无粒型岛叶皮质背侧区和右下肢坐骨神经对[18]氟脱氧葡萄糖摄取，半定量分析主要测量[18]氟脱氧葡萄糖平均标准化摄取值(standardized uptake value，SUV)，并计算靶区/非靶区(以肝脏摄取为标准)值。
1.4.7   苏木精-伊红染色   术后1-5周每周分别处死两组各5只大鼠进行坐骨神经苏木精-伊红染色，观察其病理表现。取坐骨神经(结扎处前后1 mm，长度为1 cm)放入40 g/L多聚甲醛固定后用全自动脱水机进行脱水、包埋、切片、染色处理，对切片进行图像采集。
1.4.8   免疫印迹   使用立体定位仪对大鼠左侧无粒型岛叶皮质背侧区进行定位，在术后5周时取两组剩余大鼠左侧无粒型岛叶皮质背侧区组织提取总蛋白和核蛋白。转膜封闭1 h后将PVDF膜放入一抗溶液mGluR5(1∶5 000)、NMDAR2B(1∶1 000)和β-actin(1∶100 000)中4 ℃孵育过夜，洗涤后放入二抗(稀释浓度：1∶5 000)中室温孵育2.0-3.0 h。洗膜、显影和定影，用Tanon GIS底盘控制软件V2.0对试条进行曝光和分析，计算mGluR5和NMDAR2B蛋白的相对表达量。
1.5   主要观察指标   ①大鼠行为学观察；②坐骨神经功能及结构；③损伤的坐骨神经局部糖摄取情况；④左侧无粒型岛叶皮质背侧区中mGluR5和NMDAR2B的表达水平。
1.6   统计学分析   采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，数值均以x±s表示。采用重复测量方差分析、独立样本t检验等统计学分析方法。取P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经由西南医科大学生物统计学专家审核。

此次研究采用坐骨神经慢性压迫性损伤模型诱导神经病理性疼痛模型，探索了坐骨神经慢性压迫性损伤模型术后神经病理性疼痛及抑郁样行为出现的时序特点，并发现术后神经病理性疼痛及抑郁样行为并存时，左侧无粒型岛叶皮质背侧区mGluR5和NMDAR2B表达水平均增高；此外，还发现，模型组大鼠损伤的坐骨神经局部糖摄取明显增加。
神经病理性疼痛、炎症性疼痛和纤维肌痛是目前用于研究慢性疼痛-抑郁共病的3种主要疼痛类型[28]，其中，神经病理性疼痛最常用的动物模型包括坐骨神经慢性压迫性损伤模型、重物砸伤致脊髓损伤等[28]。坐骨神经慢性压迫性损伤模型是目前最常用的慢性神经病理性疼痛-抑郁共病造模方式之一，以往研究显示坐骨神经慢性压迫性损伤模型后大鼠出现抑郁样行为的时间不尽一致，2-8周均有可能，这可能与各研究中坐骨神经慢性压迫性损伤模型造模时坐骨神经压迫程度不同、检测抑郁样行为方法不同等因素有关[28-32]。
此次研究造模时，坐骨神经压迫程度以观察到肌肉抽搐为准；研究显示，此时坐骨神经压迫14%-15%，能诱发出典型的神经病理性疼痛症状[33]，而此次研究中发现大鼠机械痛觉过敏在术后1周即很明显，提示造模成功。而抑郁情绪的发生明显延迟，糖水试验及游泳不动时间提示直到术后两三周大鼠才开始出现抑郁样状态，这一结果与以往部分研究类似，提示早期神经病理性疼痛可能通过某种机制诱发了抑郁样行为。模型组大鼠术后3周时，机械痛敏缩足阈值仍显著低于假手术组，但未再进行性加重，提示神经病理性疼痛较为稳定；而糖水偏爱度持续降低、游泳不动时间继续延长，提示抑郁样行为持续加重，此时，坐骨神经慢性压迫性损伤模型大鼠神经病理性疼痛和抑郁行为均较明显，可作为一种神经病理性疼痛-抑郁样行为共病模型。目前，神经病理性疼痛-抑郁共病越来越受到临床医生及研究者的关注。临床研究发现，神经病理性疼痛患者中抑郁和焦虑分别占 65.6% 和 73.7%，神经病理性疼痛合并抑郁患者疼痛程度更高(P= 0.001)，SF-12和BPI测得的生活质量更差[34]。尽管目前临床上已有针对性应用于神经病理性疼痛的药物，如普瑞巴林、加巴喷丁等，但并不总是能取得满意的疗效。有研究认为，情绪障碍是解释神经病理性疼痛管理复杂性的主要原因之一，神经病理性疼痛症状控制欠佳有可能是因为忽略了疼痛的情感成分[34]。此次研究结果可为神经病理性疼痛及疼痛所致抑郁样行为的临床前研究提供一定参考，在观察神经病理性疼痛早期干预疗效、或预防神经病理性疼痛所致抑郁样行为时，建议在造模后1周左右、抑郁样行为出现之前予疼痛干预；而研究疼痛-抑郁样行为共病或抑郁情绪对治疗神经病理性疼痛的影响，则建议在造模后3周后干预更为合适。
目前普遍认为，神经病理性疼痛与抑郁之间密切的相互关系可能是由于两者在遗传、皮质功能重组、转录调节因子、神经递质等层面具有某些共同的神经生物学机制[8]。作者发现术后5周时大鼠左侧无粒型岛叶皮质背侧区中mGluR5和NMDAR2B表达水平均增高，此时大鼠疼痛和抑郁行为均存在，提示左侧无粒型岛叶皮质背侧区mGluR5和NMDAR2B可能参与了坐骨神经慢性压迫性损伤模型后神经病理性疼痛及抑郁的发生机制。大鼠无粒型岛叶皮质背侧区属于功能性背外侧前额叶皮质区，其是认知，情感和感觉处理等脑网络的关键节点。既往一些功能成像研究的证据表明左侧背外侧前额叶皮质在神经病理性疼痛患者与情绪障碍的中具有重要作用。以往研究已揭示了背外侧前额叶皮质在疼痛-抑郁共病中的关键作用可能具有“自上而下”的抑制方式，沿着中脑-丘脑-扣带回路径通过前额皮质的下行纤维来抑制神经元耦合[35-36]。而在慢性疼痛和/或抑郁发展过程中，背外侧前额叶皮质内神经回路的各种变化与谷氨酸能传递相关[37]。其中，mGluR5广泛分布于前额叶皮质及痛觉相关的体感神经轴，可控制神经元放电[38-39]。多项研究表明，慢性神经病理性疼痛可导致大鼠前额叶皮质mGluR5的表达显著上调，而慢病毒介导的mGluR5过表达也可诱导大鼠神经病理性疼痛和负面情绪[40-41]。此次研究结果与上述研究相似，提示mGluR5可能是促进疼痛和消极情绪行为的关键分子之一。mGluR5激活后会通过偶联不同神经元群体中不同的细胞内信号通路来增强NMDAR活性，如基于蛋白激酶C(PKC)介导海马神经元NMDAR电流增强，提高NMDAR通道开放率，促进NMDAR转运[19]。而NMDAR是研究较多的与抑郁相关的谷氨酸受体，近年来的研究发现，其也可能参与了神经病理性疼痛的发生发展，尤其NR2B亚基是疼痛过程中的关键因子之一[42- 43]。mGluR5还可与NMDAR相互作用调节神经突触可塑性，如通过PKC / NR2B信号调节突触可塑性参与慢性偏头痛的中枢敏化[44-45]。此次实验中，除mGluR5增加外，左侧无粒型岛叶皮质背侧区NMDAR2B也显著增加，提示mGluR5和NMDAR2B均参与了神经病理性疼痛及抑郁的发生机制，下一步可通过检测左侧无粒型岛叶皮质背侧区中枢敏化相关指标及突触可塑性进一步明确具体机制。
神经影像学能够用于研究探索神经系统对疼痛信息的感知及处理过程，尤其是在大脑层面的变化，是目前神经病理性疼痛领域的研究热点。PET可以利用特定的放射性示踪剂，获得时间相关三维分布的成像数据，能够反映出被测局部活动情况，可以用于研究参与神经病理性疼痛发生发展的特定大脑区域[46]。尽管术后5周时大鼠左侧无粒型岛叶皮质背侧区中mGluR5和NMDAR2B表达水平增高，提示左侧无粒型岛叶皮质背侧区可能参与了神经病理性疼痛及抑郁的发生，但此次研究中PET/CT未发现术后坐骨神经慢性压迫性损伤模型大鼠大脑皮质区域[18]氟脱氧葡萄糖代谢的差异。原因之一可能是因为无法使用多元模式分析。与传统单变量方法相比，多元模式分析能通过考虑大脑活动的空间分布模式检测到细微差异[47]；另一方面，可能是由于试验条件受限，此次研究采用的是[18]氟脱氧葡萄糖示踪剂，因为大脑代谢旺盛，FDG会聚集在代谢旺盛区域，缺乏特异性，这为精确定位以区别局部代谢差异带来一定的困难。CHUNG等[40]曾用mGluR5选择性放射性示踪剂11C ABP688对慢性神经病理性疼痛模型大鼠脑进行PET扫描，发现大鼠内侧前额叶皮质的前叶区mGluR5表达显著上调。第三，还可能与样本量、CT分辨率等有关，未来可能需要对实验手段进行优化，如利用PET/MRI。此次研究中PET/CT发现坐骨神经慢性压迫性损伤模型大鼠术后坐骨神经葡萄糖摄取显著增高。[18]氟脱氧葡萄糖是PET常用的代谢活性标志物，研究认为其是神经损伤和神经性疼痛情况下神经元活性增加的重要标记。BEHERA等[48]利用PET/MRI发现周围神经损伤致神经病理性疼痛大鼠中，损伤神经处[18]氟脱氧葡萄糖也增加，并且与异常疼痛行为存在显著相关性[49]，此次研究结果与之类似，提示损伤坐骨神经代谢增加，这可能是由于疼痛神经元自发性放电增加，其是对神经损伤的反应之一，包括神经元应力和神经再生过程，如轴突芽生和蛋白质合成[48]。
此次研究还存在一定局限性。临床实践中，有时难以确定抑郁与神经病理性疼痛强度之间的因果方向和时间顺序，研究中大鼠在出现抑郁情绪后总体上机械痛敏缩足阈值未明显增加，但由于实验中样本量偏小，不能根据大鼠是否出现抑郁样行为分组分析神经病理性疼痛强度的变化，下一步可增加样本量进一步观察。此外，尽管观察到坐骨神经慢性压迫性损伤模型大鼠大脑左侧无粒型岛叶皮质背侧区mGluR5和NMDAR表达增加，但未继续观察两者相互作用过程及影响神经病理性疼痛及抑郁的具体机制，下一步可通过检测左侧无粒型岛叶皮质背侧区中枢敏化相关指标及突触可塑性进一步明确具体机制。
综上，坐骨神经慢性压迫性损伤模型大鼠术后可早期出现神经病理性疼痛，并可诱发明显抑郁样行为，可表现为神经病理性疼痛-抑郁共病，同时坐骨神经慢性压迫性损伤模型大鼠大脑左侧无粒型岛皮质背侧区中mGluR5和NMDAR2B表达水平明显增高，可能是神经病理性疼痛-抑郁共病发生机制之一。然而，目前尚不清楚mGluR5和NMDAR在左侧无粒型岛叶皮质背侧区中是如何促进神经病理性疼痛和抑郁样行为的发生发展，未来需要更多的研究来探索这一问题。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

#br#

文题释义：

无粒型岛叶皮质背侧区：灵长类动物背外侧前额叶皮质(The dorsolateral prefrontal cortex，DLPFC)在啮齿动物中没有直接同源物，但大鼠大脑具有功能划分的前额叶皮质，主要分为内侧前额叶、眶额叶和DLPFC；DLPFC 包括岛叶无颗粒皮质区(Al，主要包括背侧区和腹侧区)和额前皮质2区(FR2)。
抑郁样行为：大鼠表现出以兴趣缺失、心境低落、绝望和无价值感等为主要特征的行为，检测方法主要包括糖水偏爱、强迫游泳、新奇物体探索、新奇环境摄食抑制、旷场、悬尾、获得性无助等。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

神经病理性疼痛动物模型是开发有效镇痛药物和治疗方法的基础和重要工具，能再现人类经历神经病理性疼痛的主要过程和症状。目前，使用最广泛的模型之一是1988年Bennett等人提出的坐骨神经慢性压迫性损伤模型(CCI模型)，这是第一个重现人类观察到的疾病相关的复杂性慢性神经病理性疼痛模型，操作相对简单。坐骨神经慢性压迫性损伤术后，大鼠受伤后爪表现出异常姿势(脚趾并拢，足底弯曲，脚掌外翻)，并反复颤抖、大鼠会保护和舔受伤后爪，提示存在自发性疼痛，并能持续2两个月。长期疼痛易引发神经/精神症状如焦虑和抑郁。研究表明，抑郁和神经病理性疼痛之间有显著的共病，据估计大约有30%-60%患者两种疾病会同时发生。因此，CCI模型不仅可以作为周围神经损伤后所致神经病理性疼痛或慢性疼痛首选模型，也可作为疼痛-焦虑或抑郁动物模型常用方式。构建该模型的关键在于结扎神经的松紧度(图1为结扎部位示意图。来自：AUSTIN PJ, WU A, MOALEM-TAYLOR G. Chronic constriction of the sciatic nerve and pain hypersensitivity testing in rats. J Vis Exp.2012; (61).)，结扎太松达不到损伤坐骨神经的要求，而结扎太紧可能会使动物发生“自残行为”即动物有攻击肢体的倾向(图2为大鼠发生“自残行为” )，最常发生于术后10 d，从咬伤爪尖开始，一直到爪根部流血为止。这一现象的发生可能是由于神经末梢神经瘤中异常脉冲放电的产生，会影响疼痛过敏反应的测试结果。然而，自残行为不完全是有弊的，当用于有关研究麻醉、灼烧痛和某些人类神经损伤相关的疼痛综合征时，有自残行为的啮齿动物可能会是一种有用的动物模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

	阅读次数
	全文
	摘要