2.1   多孔钽材料形貌观察   多孔钽材料为圆片状(直径15 mm，厚度3 mm)，呈深灰黑色，表面较粗糙，有多个微小孔隙，见图2A、B，扫描电镜下可见许多微孔结构，孔径为400-600 μm，孔与孔之间相互连通，构成三维立体结构，见图2C、D。




2.2   大鼠软骨细胞形态观察   倒置相差显微镜下观察可见，原代大鼠软骨细胞贴壁生长，细胞呈多角形或不规则形，散在生长，镜下可见少量漂浮的圆形透亮死亡细胞，见图3A。传代后，细胞体积逐渐增大，散在生长，胞质饱满，见图3B、C。到第3代可见细胞数量增多，呈多角形，彼此相互连接，胞质更加饱满，轮廓清晰，胞浆向外伸展形成突起，见图3D。



2.3   软骨细胞鉴定结果    Ⅱ型胶原免疫荧光染色后，荧光显微镜下可见第3代软骨细胞散在分布，胞浆丰富，Ⅱ型胶原红染，细胞核蓝染，核仁清晰，核仁明显，见图4A；阿利新蓝染色后，倒置显微镜下观察第3代软骨细胞胞质和胞膜均呈现淡蓝色，胞核深染，见图4B。



2.4   静态培养条件下软骨细胞在材料上的生长状态   选择C组进行观察，倒置显微镜下可见，培养3 d时，软骨细胞数量较少，少量细胞与材料边缘结合，见图5A；培养5 d时，细胞数量逐渐增多，与多孔钽结合紧密，见图5B；培养7 d时，细胞数量增多，材料边缘黏附较多软骨细胞，见图5C。扫描电镜下观察可见随培养时间的延长，细胞数量逐渐增多，并逐渐覆盖材料表面，见图6。







2.5   各组软骨细胞蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、SOX9分泌量   培养第5天，C组Ⅱ型胶原分泌量高于A、B组(P < 0.05)，A、B组Ⅱ型胶原分泌量比较差异无显著性意义(P > 0.05)；A、B、C组间蛋白聚糖、SOX9分泌量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

D组与E组蛋白聚糖、Ⅱ型胶原分泌量比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，E组SOX9分泌量高于D组(P < 0.05)，见表2。

静态与动态培养环境下的蛋白聚糖、Ⅱ型胶原分泌量比较差异均有显著性意义(F=1041，P=0.000；F=76.221，P=0.000)，B组蛋白聚糖、Ⅱ型胶原分泌量低于D组(P < 0.05)，C组蛋白聚糖、Ⅱ型胶原分泌量低于E组(P < 0.05)；静态与动态培养环境下的SOX9分泌量比较差异无显著性意义(F=0.023，P=0.883)。

透明质酸对3因子影响明显，透明质酸复合前后蛋白聚糖(F=92.881，P=0.000)、Ⅱ型胶原(F=9.565，P=0.015)、SOX9(F=6.721，P=0.032)分泌量比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。
2.6   各组软骨细胞蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、SOX9蛋白表达量    见图7。

培养第5天，C组Ⅰ型胶原蛋白表达量高于B组(P < 0.05)，其余组间Ⅰ型胶原蛋白表达量比较差异无显著性意义(P > 0.05)；A、B、C组间蛋白聚糖SOX9蛋白表达量比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3，图8。

D、E组蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、SOX9蛋白表达量比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表4，图9。

静态与动态培养环境下的蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达量比较差异均有显著性意义(F=9.045，P=0.017；F=392.689，P=0.000)，D组蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达量高于B组(P < 0.05)，E组蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达量高于C组(P < 0.05)；静态与动态培养环境下的SOX9蛋白表达量比较差异无显著性意义(F=0.331，P=0.581)。

透明质酸对3因子蛋白表达量影响明显，透明质酸复合前后蛋白聚糖(F=6.683，P=0.032)、Ⅱ型胶原(F=17.422，P=0.003)、SOX9(F=5.721，P=0.043)蛋白表达量比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。

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临床上由于创伤、感染及退行性变等原因导致的关节软骨损伤十分常见[1]，关节软骨损伤后可引起疼痛、关节功能障碍，造成病患行动不便[2]。由于关节软骨损伤后很难自行修复[3]，若不及时治疗将导致关节退化[4]。目前自体游离骨膜移植是临床常见的关节软骨缺损修复方法，但取材有限、固定困难。近期有研究发现，多孔钽、纤维蛋白和兔软骨细胞复合体植入裸鼠皮下可促进软骨细胞增殖和软骨组织形成，在复合体的结构中可产生透明软骨，具有治疗软骨缺损的潜力[5]。

多孔金属材料因具备孔隙率高、弹性模量低、抗压强度佳及良好的生物相容性，已被广泛应用于骨组织工程[6]。美国Zimmer公司生产的多孔钽已被广泛应用于临床[7-9]。国产多孔钽由中国重庆润泽医疗器械有限公司采用真空高温煅烧工艺制备，孔径为400-600 μm，孔隙率65%-80%，具备特有的相互连通的微孔结构及良好的渗透性。透明质酸属于糖胺聚糖家族一员，可刺激蛋白多糖合成，降低可溶性促炎递质和降解酶的产生，抑制软骨细胞凋亡，同时有研究发现，体外培养环境下透明质酸可明显影响细胞活力及功能 [10-11]。MUJEEB等[12]采用水凝胶支架培养牛软骨细胞发现，在二维静态培养环境下细胞活力减低、糖胺聚糖明显减少，在三维动态培养时细胞活力及糖胺聚糖含量变化不明显。三维动态培养细胞环境利用具备三维结构的材料作为载体，并与细胞共同培养，配合动态环境，使细胞生长更接近于体内生长模式，便于营养物质、气体的运输交换，可保持细胞良好的形态和活力[12-14]。

此次实验通过对比、动静态环境下透明质酸与国产多孔钽复合后对大鼠软骨细胞增殖及Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9表达的影响，为临床骨移植材料的研究提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

1.1   设计   对比观察实验，组间比较进行单因素方差分析、秩和检验和方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2018年1月至2019年6月在华北理工大学医学实验研究中心完成。
1.3   材料
1.3.1   支架材料   国产多孔钽片：直径15 mm，厚度：2 mm，购自重庆润泽医疗器械有限公司。
1.3.2   实验试剂   透明质酸(相对分子质量为1.5×106-1.8×106，Sigma，美国)；兔抗大鼠蛋白聚糖抗体(Gene Tex，美国)；兔抗大鼠Ⅱ型胶原抗体(Abcam，美国)；兔抗大鼠 SOX9抗体(Abclonal，美国)；兔抗大鼠透明质酸(Sigma，美国)；山羊抗兔抗体(北京中杉金桥有限公司)；BCA 蛋白浓度测定试剂盒(Multi Sciences，美国)；0.25%胰蛋白酶、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)；标准阿利新蓝染色液试剂盒、甲苯胺蓝染色液(Solarbio，美国)；BSA封闭液(Biovogen，美国)；CCK-8 试剂盒(苏州赛业生物科技有限公司)；DMEM培养基、胎牛血清(Biolegend，美国)。
1.3.3   实验动物   三四周龄雄性SD大鼠2只，体质量180-200 g，由北京华阜康生物提供，许可证编号：SCXK(京)2018-0174。普通饲料饲养，自由进食，饲养环境温度20-25 ℃、相对湿度40%-70%、12 h光照/12 h黑暗交替。动物实验获得华北理工大学动物实验伦理委员会批准。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待动物的指导意见》。
1.4   实验方法   
1.4.1   材料处理   将多孔钽片放入无水乙醇中浸泡12 h脱脂，置于超声清洗仪中纯水超声清洗3次，30 min/次，清洗后烘干箱内烘干，再次脱脂12 h，超声清洗30 min，高压蒸汽灭菌烘干备用。
1.4.2   软骨细胞的提取及培养   取SD大鼠，10%乌拉坦腹腔注射麻醉后颈椎脱臼法处死，参考张振等[15]软骨细胞分离培养方法，取大鼠双侧膝关节，离断含软骨组织部位，用含青/链霉素双抗液的PBS冲洗，分离组织，保留透明软骨，PBS冲洗后移入生物安全柜；将软骨组织剪碎至1 mm3大小，装入培养瓶，加入0.2%Ⅱ型胶原酶，37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中消化1 h后观察；机械吹打再次分离组织后静置取上清，低温离心(1 500 r/min离心10 min)离心后所得的上清液，重新加入培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养，3 d后首次换液，之后每天换液一次，   7-9 d细胞融合度达到90%左右后传代。

1.4.3   软骨细胞鉴定

Ⅱ型胶原免疫荧光染色：第3代软骨细胞转入加有盖玻片的6孔板内，细胞浓度为1×108 L-1，正常培养3 d；去除孔板中培养基，PBS清洗，5 min×3次；40 g/L多聚甲醛固定20 min，0.3%Tritonx-100穿透细胞膜5 min，PBS再次清洗，5 min×3次；5%BSA封闭液30 min；滴加Ⅱ型胶原(1∶100)一抗，4 ℃过夜；次日，PBS清洗后，加入山羊抗兔二抗(1∶100)37 ℃避光孵育1 h；PBS清洗后，取出盖玻片加入DAPI封固；荧光显微镜下观察，采集图片。

甲苯胺蓝染色：细胞处理方式同上，按说明书步骤操作，进行甲苯胺蓝染色，流水冲洗，晾干后镜检采图。
1.4.4   透明质酸溶液的制备   称量透明质酸粉末111 mg备用，超净台内操作，紫外线消毒30 min。将50 mL FBS和5 mL双抗移入DMEM培养基中，混匀后吸管析出适量培养基溶解透明质酸粉末，一次性注射器抽取液体过滤后注入培养基中，配制成含200 mg/L透明质酸的培养基。
1.4.5   实验分组   取软骨细胞，分5组培养：A组单纯细胞静态培养；B组接种于国产钽片上静态培养；C组接种于国产钽片上，加入含透明质酸的培养基，静态培养；D组接种于国产钽片上，动态培养；E组接种于国产钽片上，加入含透明质酸的培养基，动态培养。B-E组，每组4个钽片，每个钽片接种细胞浓度为1×108 L-1，体积为3 mL，静态培养参照前期实验方法[16]；动态培养中，将完全长满培养瓶中的细胞用胰酶消耗下来，接种于钽片上，待细胞完全与钽片或培养瓶结合后加入适量培养基，置于小瓶位铝合金全主动轮细胞转瓶机上，分为上下两层，见图1，每层瓶位数3个，放置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养，动态转瓶为双向交替正反转，旋转角度为40°，转速为40 r/h。5组细胞均连续培养7 d。

1.4.6   扫描电镜观察   C组细胞与材料静态复合培养3，5，7 d后，PBS清洗，戊二醛固定4 h，梯度乙醇脱水、干燥、喷金，扫描电镜下观察细胞在材料上的形貌。 
1.4.7   ELISA 法检测细胞蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、SOX9的分泌  培养第5天，3 000 r/min离心20 min，收集各组细胞培养上清液，按说明书步骤操作，分别检测各组蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、SOX9因子吸光度值，制作标准曲线并计算出相应浓度。
1.4.8   Western Blot法检测细胞蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、SOX9蛋白表达   培养第5天，收集各组细胞蛋白并定量，按崔逸爽等[17]方法操作进行上样、电泳、转膜、封闭、清洗，分别加入一抗蛋白聚糖(1∶500)、Ⅱ型胶原(1∶500)，SOX9(1∶300)4 ℃孵育过夜，清洗后酶标山羊抗兔IgG聚合物二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，清洗后显色液显色，置于荧光成像仪中，成像采集照片。利用Image J 图像分析软件进行分析。
1.5   主要观察指标   各组软骨细胞的黏附形态及蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、SOX9因子的分泌与蛋白表达。
1.6   统计学分析   采用SPSS 17.0统计软件对数据分析，x±s表示计量数据，ELISA 检测Ⅱ型胶原结果数据与Western-blot检测各因子结果数据正态性较好，采用单因素方差分析；动静态环境及透明质酸属于多因素，采用2×2的析因设计的方差分析；ELISA检测蛋白聚糖与SOX9结果不满足正态性，利用秩和检验分析。P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经华北理工大学生物统计学专家审核。
1.7   出版规范   该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

软骨损伤修复是骨科临床面临的一大难题[18]，目前自体软骨移植再生的软骨力学强度较低、易退变；同种异体骨移植易出现免疫排斥、材料塌陷吸收等问题[19]。在中等软骨缺损、骨关节炎造成的软骨缺损中，软骨细胞的应用可起到良好的治疗效果；支架材料可为软骨缺损区域提供足够的力学支撑，防止损伤区域塌陷；适宜的生长因子可促进软骨细胞分化，透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白等也常用于临床软骨缺损修复[20-22]。

多孔钽作为多孔金属材料具备良好的生物相容性，已被广泛应用于临床，但目前只有美国Zimmer公司独家生产，处于垄断地位。华北理工大学与重庆润泽医疗器械有限公司及多家科研机构合作，共同研发出具有中国独立产权的国产多孔钽材料。Zimmer公司采用的是气相沉积的制备方法，国产多孔钽采用的是高温煅烧技术，孔隙率可高达75%-85%，孔径可达400-600 μm，完成了技术的创新突破，同时国产多孔钽材料具备良好的力学性能，抗压强度可达100-170 MPa，弹性模量在2.0-4.0 GPa，介于骨皮质和骨松质之间，完全符合软骨修复的力学强度[23-24]。有研究发现，以纤维蛋白为细胞载体的钽支架可促进软骨细胞增殖和软骨组织形
成[5]；同时有研究将骨膜移植到多孔钽材料表面，发现在软骨形成条件下培养，多孔钽表面可有透明软骨的再生[25]。透明质酸可参与细胞的迁移、分化、增殖，已在生物医学领域得到普遍应用[26-27]，透明质酸组成的水凝胶也被广泛应用于组织工程领域[28-29]。此次实验采用透明质酸复合多孔钽材料后，扫描电镜下观察到细胞随时间延长逐渐长入材料内部，细胞生长状态良好。同时整合动、静态培养环境结果，通过析因分析发现，透明质酸复合后软骨细胞蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、SOX9的分泌及蛋白表达增加，提示透明质酸在此条件下参与了细胞分化，与相关研究结果一致[30]。有研究将透明质酸与人/兔关节软骨共培养，发现透明质酸对软骨细胞增殖无影响，也与此次实验结果一致[31-32]。有研究利用白细胞介素1β体外建立关节炎模型，发现透明质酸可增加大鼠退变关节软骨细胞蛋白多糖的合成[33]；对体外培养的大骨节病软骨细胞中补充透明质酸钠后，蛋白聚糖、Ⅱ型胶原的合成增多，兔关节腔内注入透明质酸也可促进蛋白聚糖的合成，此次实验也得到了同样的结果[34-35]。但此次实验中，静态培养环境下透明质酸复合后Ⅱ型胶原表达明显升高，其他因子表达变化不明显，可能是：单纯动静态培养环境下，钽片可供细胞生长的空间有限，且观察时间较短(5 d)，因子的表达变化表现不明显。动态培养环境下，透明质酸与钽复合后软骨细胞的蛋白聚糖、Ⅱ型胶原表达差异无统计学意义，影响不明显。SOX9作为软骨发展中的转录因子，除了在动态环境下透明质酸复合组SOX9分泌量高于未复合组，其他状态下SOX9分泌及蛋白表达均未见明显差异，猜测可能透明质酸在此次实验条件下可直接影响细胞的代谢，却未能明显影响SOX9，在后续研究中将继续延长实验时间，继续深入探讨。

三维细胞培养是将具有三维结构的材料作为载体与细胞体外共同培养，使细胞在载体的三维立体空间结构中生长、迁移，形成细胞-载体复合物，努力营造更接近于体内细胞生长的模式[13]。支架材料为细胞提供立体生存环境，利于细胞营养物质的传输、气体交换。有报道显示，软骨细胞在三维培养环境下不但可保持细胞形态和活力并可促进Ⅱ型胶原的沉积[36]。动态环境是此次实验的另一特点，在动态环境下细胞能承受到各种不同类型的应力刺激，可更好地模拟体内细胞行为程度，更加全面地观察培养过程中细胞增殖、分化、蛋白表达变化。动态环境下的各种应力刺激可对软骨发育和表型维持发挥重要作用。有研究采用滚压力学刺激猪膝关节软骨细胞，发现一定压力可增强软骨细胞存活率，并促进蛋白多糖表达[37]，而动态压缩能上调蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的基因表达，静态压缩会下调蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的基因表达[38-39]；同时，动态环境下剪切应力、渗透压力及静水压力的变化也会导致软骨细胞内蛋白聚糖和胶原蛋白的更多表达[40-42]。此次实验在动态培养下利用透明质酸与国产多孔钽复合培养软骨细胞，ELISA及Western Blot检测结果显示，钽透明质酸动态组和钽动态组蛋白聚糖、Ⅱ型胶原表达明显高于相应静态组，与相关研究结果一致。在动态培养环境下，各种应力刺激有所变化，渗透压力与静水压力的变化可上调合成代谢分子(蛋白聚糖、Ⅱ型胶原)的表达，动态压缩也可以改善蛋白聚糖、Ⅱ型胶原的合成[43]，因此，在此次实验条件下出现了动态环境下以上因子表达明显高于静态的情况。因此，动态培养环境下各种应力刺激可影响软骨细胞的代谢状态比较明确，但此次实验中动、静态培养环境下软骨转录因子SOX9的表达差异不明显，猜测可能是动态培养环境直接影响了细胞的代谢，有关动态环境对软骨形成过程中潜在机制的影响尚不明确。此次实验观察时间较短(5 d)，后续将进一步延长时间，深入探讨。

综上所述，国产多孔钽与透明质酸复合后可促进软骨细胞蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、的分泌和蛋白表达，动态环境培养下蛋白聚糖、Ⅱ型胶原分泌及蛋白表达优于静态，SOX9的分泌及蛋白表达不受动、静态培养环境影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

文题释义：
透明质酸：由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖二糖单元构成，是一种亲水性很强的内源性非硫酸化糖胺聚糖，参与细胞迁移、分化及增殖，作为天然高分子材料已在生物医学领域普遍应用。
国产多孔钽：是由华北理工大学与重庆润泽医疗器械有限公司及多家科研机构合作，完成了技术的创新突破，共同研发出的具有中国独立产权的多孔钽材料。国产多孔钽材料采用高温煅烧技术制备，具有立体的三维空间结构，孔径达400-600 μm，孔隙率达75%-85%，具备特有的相互连通的微孔结构和更良好的渗透性以及良好的力学性能及抗压强度(100-170 MPa)，弹性模量在2.0-4.0 GPa，介于骨皮质和骨松质之间，完全符合软骨修复的力学强度。与传统的同种异体骨、不锈钢及金属钛等医用材料相比，国产多孔钽具有良好的生物相容性和成骨成软骨性能，已成为骨及软骨缺损修复的新型材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

此文将透明质酸与国产多孔钽/软骨细胞复合培养，扫描电镜观察国产多孔钽材料表征；免疫荧光染色、阿利新蓝染色鉴定大鼠软骨细胞；并采用ELISA及Western Blot实验分别检测动静态环境下，细胞培养第5d软骨相关蛋白Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9分泌及蛋白表达情况，发现国产多孔钽与透明质酸复合后可促进软骨细胞蛋白聚糖、Ⅱ型胶原及SOX9的分泌和蛋白表达，动态环境下蛋白聚糖、Ⅱ型胶原表达优于静态，SOX9不受动静态培养环境的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

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