1.1 设计 材料学表征实验和细胞学体外实验，组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点 实验于2020年12月至2022年7月在徐州医科大学口腔医学院实验室完成。
1.3 材料 Bio-Oss骨粉移植物介绍见表1。
α-MEM培养基、BCA血清(Gibco，美国)；胎牛血清(四季青，中国)；0.25%胰酶细胞消化液、青/链霉素双抗、CCK-8细胞活性检测试剂盒、DEPC水、SBF模拟体液(Vicmed，中国)；碱性磷酸酶检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天，中国)；碱性磷酸酶活性检测试剂盒(南京建成，中国)；Primer引物、茜素红染色及定量检测试剂盒(上海生工，中国)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、实时定量PCR 试剂盒(Takara，日本)。
实时荧光定量PCR仪(Roche，瑞士)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；酶标仪(Biotek，美国)；氢氧化钙、磷酸、致孔剂(国药，中国)；场发射扫描电子显微镜(Teneo VS，FEI，美国)；十二烷基硫酸钠、PBS(碧云天，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 亚微米拓扑结构磷酸钙陶瓷的制备 以氢氧化钙和磷酸为原料，将磷酸溶液以恒定的速率逐滴滴加到氢氧化钙悬浮液中，在室温下熟化6周后，对浆液进行过滤、干燥和研磨，得到亚微米级磷酸三钙陶瓷粉末。随后将磷酸三钙陶瓷粉末至于1%蒸馏水和致孔剂的混合溶液中，在60 ℃下发泡得到磷酸三钙陶瓷生胚。将生胚在1 050 ℃下烧结8 h，得到大块磷酸三钙陶瓷材料，并在破碎后，筛分出尺寸范围为1.0-2.0 mm的磷酸钙陶瓷颗粒。所有样品均用去离子水超声清洗、烘干，并在高压釜中灭菌后使用。
1.4.2 扫描电镜检测 取磷酸三钙陶瓷和Bio-Oss骨粉两组样品，分别在室温下干燥，喷金后扫描电镜下观察两组样品的表面形貌，并拍照记录。
1.4.3 生物矿化实验 取磷酸三钙陶瓷和Bio-Oss骨粉两组样品，分别置于15 mL的离心管中，管中加入1.5倍浓度的模拟体液，置于37 ℃摇床中。每2 d更换新鲜模拟体液，浸泡7 d后取出，用去离子水冲洗，室温下烘干，喷金后扫描电镜下观察。
1.4.4 蛋白吸附实验 将磷酸三钙陶瓷和Bio-Oss骨粉两组样品置于48孔板中，分别向每孔加入500 µL的1%牛血清白蛋白或胎牛血清。37 ℃浸泡24 h后，用PBS冲洗3次，随后每孔中加500 µL 1%的十二烷基硫酸钠提取样品表面吸附的蛋白。采用BCA法检测试剂盒测定不同样品表面的蛋白提取量。
1.4.5 人牙周膜干细胞的分离培养 收集徐州医科大学附属口腔医院口腔颌面外科门诊18-22周岁健康成年患者因正畸需要拔除的前磨牙，牙齿无龋坏、无牙髓疾病、无根尖周疾病，行拔除前以体积分数75%乙醇充分消毒牙体周围组织。实验已获得供者知情同意，实验获得徐州市口腔医院伦理委员会批准(伦理号：2021-018)。
将牙齿样本立即置入4 ℃预冷的完全培养基中(含1%青霉素、链霉素和体积分数10%胎牛血清的α-MEM 培养基)。在超净工作台内将拔除的牙齿置于培养皿中，用PBS冲洗液反复冲洗，用无菌11号手术刀片刮取根中1/3牙周韧带，修剪组织块约1 mm3大小，加入3 g/L的Ⅰ型胶原酶置于37 ℃环境中；1 h后收集至离心管中，800 r/min离心5 min，离心后弃上清液，以完全培养基吹匀沉淀，平铺于培养皿底部。置37 ℃、体积分数为5%CO2孵箱中进行培养，2 d后首次换液，以后每隔3 d换液。当细胞从组织块周围爬出且密度达到90%后，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取第3代人牙周膜干细胞进行实验[10-11]。
1.4.6 两种材料浸提液对人牙周膜干细胞增殖的影响 无菌条件下分别取Bio-Oss和磷酸三钙陶瓷两种骨粉颗粒，将骨粉颗粒分别加入含完全培养基浸泡(质量浓度为0.1 g/mL)， 37 ℃下浸泡48 h后获得浸提液，过滤后备用。
将人牙周膜干细胞以2×107 L-1的细胞浓度接种至24孔板内，每孔接种1 mL细胞悬液。培养24 h细胞贴壁后，将原培养液分别更换为两种材料浸提液(1 mL)，对照组继续使用原培养液(1 mL)。分别培养1，3，5 d后，PBS洗涤，每孔加入200 µL含10%CCK-8工作液的α-MEM培养基。37 ℃避光孵育2 h后，将100 µL的溶液转移到96孔板上，使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值。
1.4.7 两种材料对人牙周膜干细胞成骨分化的影响
碱性磷酸酶染色：将人牙周膜干细胞以2×104/孔接种在24孔板内，每孔接种1 mL细胞悬液。培养24 h细胞贴壁后，将原培养液分别更换为两种材料浸提液。培养7 d后，吸出原有培养基，以PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，以PBS洗涤，随后每孔加入碱性磷酸酶显色剂避光染色30 min，以PBS洗涤，光学显微镜观察下并拍摄图像。
碱性磷酸酶活性检测：取生长状态良好的第3代人牙周膜干细胞，以2×104/孔的细胞密度接种在两种材料上，在培养第4，7天时，吸去原培养基，以PBS轻轻洗涤3遍，每孔加入100 μL的1%TritonX-100，置于冰上裂解30 min，反复吹打收集至1.5 mL离心管中，4 ℃下12 000 r/mmin离心10 min，取上清液，然后根据BCA蛋白定量试剂盒的使用要求，在562 nm波长下测定各孔的吸光度值。利用标准孔的吸光度值绘制标准曲线，根据吸光度值测算各组待测样品的蛋白浓度。根据碱性磷酸酶试剂盒说明，制备一个标准孔和空白孔。接着将30 μL的各组待测液加入96孔板，在每孔中分别加入50 μL的缓冲液和基质液，37 ℃避光孵育15 min。然后每孔加入150 μL的显色液，混匀，去除气泡，在520 nm波长下测定各孔的吸光度值。
茜素红染色：取Bio-Oss骨粉与磷酸三钙陶瓷两种材料样品，经过高温高压消毒灭菌后置于24孔板中，每孔加入1 mL的完全培养基，浸泡润湿过夜。第2天，取生长状态良好的第3代人牙周膜干细胞，以 2×104/孔的细胞密度接种在24孔板中，每孔分别加入1 mL的Bio-Oss骨粉浸提液或磷酸三钙陶瓷材料浸提液，置于37 ℃、体积分数5%CO2恒温箱中培养。培养到第21天时，吸去原培养液，以PBS漂洗3遍。每孔加入1 mL的40 g/L多聚甲醛固定40 min。吸去固定液，以PBS洗涤。每孔加入1 mL茜素红染色液，染色5 min，吸去染色液，PBS反复漂洗至液体颜色不变红。室温烘干，拍照记录各组材料表面钙结节的染色情况。
qRT-PCR法检测成骨基因表达：取Bio-Oss骨粉与磷酸三钙陶瓷两种材料样品，经过高温高压消毒灭菌后置于24孔板中，每孔加入1 mL的α-MEM培养基，浸泡润湿过夜。取生长状态良好的第2代人牙周膜干细胞，使用0.25%胰酶消化细胞，离心重悬，利用血球计数板进行计数，以 2×104 /孔的细胞密度接种在两种材料上，每孔加入1 mL 的α-MEM完全培养基，置于 37 ℃、体积分数5%CO2 恒温箱中进行培养。培养第7，14天，吸去每孔中旧培养基，以PBS清洗后，应用180 μL Trizol试剂于冰上静置30 min，随后Trizol 裂解液集中收集到1.5 mL的EP管中，加入氯仿震荡混匀，冰上静置15 min。
将其放入冷冻离心机中，4 ℃下12 000 r/min离心15 min。将上清液移至新的EP管，加入等量异丙醇沉淀RNA，静置 15 min，再次放入冷冻离心机中在，4 ℃下12 000 r/min离心15 min。吸去上清液后，每管中加入体积分数75%无水乙醇洗涤沉淀，并重复之前的离心操作。吸弃管中体积分数75%无水乙醇，室温晾干沉淀至透明。加入适量的 DEPC 水来充分完全溶解沉淀，使用紫外分光光度计测定 RNA 的浓度和纯度。样本纯度合格后，根据反转录PCR试剂盒的说明书在冰上进行操作，反应条件：37 ℃15 min，85 ℃5 s。随后在实时荧光定量 PCR 仪中进行扩增反应，具体反应条件如下：预变性，95 ℃进行反应 30 s；PCR 扩增反应，95 ℃进行反应 5 s；退火反应，60 ℃进行反应 34 s，共计 45 个循环。以β-actin基因作为内参，采用2-ΔΔCt方法来计算分析碱性磷酸酶、Runx-2、骨桥蛋白和骨钙素基因的相对表达变化，各基因引物序列见表2。
1.5 主要观察指标 磷酸三钙陶瓷、Bio-Oss骨粉对牙周膜干细胞增殖及成骨分化的影响。
1.6 统计学分析 所有数据以x±s表示。采用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计学分析，结果采用t检验。P < 0.05时差异有显著性意义。该文统计学方法已经由徐州医科大学生物统计学专家审核。
