1.1 设计 研究压力加载下三维培养的牙周膜干细胞经旁分泌途径对RAW264.7破骨向分化的影响。采用单因素方差分析进行统计。
1.2 时间及地点 实验于2021年11月至2022年6月在河北省口腔医学重点实验室完成。
1.3 材料 RAW264.7细胞(SCSP-5036中科院上海细胞库);Flexcell压应力培养箱及压力加载装置(FLEXCELL,美国);胎牛血清(Gibco);α-MEM、DMEM(Gibco);流式抗体(Biolegend);活死细胞染色试剂盒(Solarbio);鬼笔环肽染色试剂盒(碧云天);PrimeScript RT、TB Green(TAKARA,日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 人牙周膜干细胞的分离培养鉴定及RAW264.7细胞的培养
(1)所有实验程序均经河北医科大学口腔医院医学伦理委员会批准,经患者及监护人知情同意,从12-16岁正畸拔牙患者健康前磨牙获取牙周膜组织,组织块法分离牙周膜干细胞。牙齿离体后保存在含2%双抗的α-MEM中,置于4 ℃冰箱内,并于2 h内操作,在超净工作台中,使用拔牙钳夹持牙冠,根尖部位朝上,用含有2%的PBS冲洗,直至牙根表面无血块及污物,使用11号无菌手术刀片刮取牙根中部1/3的牙周膜组织,将组织块处理为约1 mm大小,放置于培养瓶底,培养瓶中加入5 mL α-MEM培养基,竖直放置在培养箱中,待组织块贴壁后轻轻翻瓶。5 d后可观察到组织块周围有长梭形的牙周膜干细胞爬出,定期换液,待细胞融合度达到80%-90%后按照1∶3比例进行传代,后续实验使用第3,4代细胞。
(2)流式细胞术鉴定人牙周膜干细胞表面标记物:收集第3代人牙周膜干细胞,PBS洗涤,重悬,细胞浓度为6×108 L-1,参照流式抗体说明书,向3个EP管中分别加入不同荧光标记的不同抗体,吹打均匀避光冰上孵育30 min,孵育结束后PBS洗涤,重悬,转移至流式管中,采用流式细胞仪检测细胞表面标记物的表达水平。
(3)克隆形成测定人牙周膜干细胞的增殖能力:第2,3代人牙周膜干细胞以500-1 000个/大培养皿密度进行接种,加入细胞培养基(体积分数为20%胎牛血清+α-MEM),培养10 d后光镜下观察及结晶紫染色。
1.4.2 人牙周膜干细胞三维培养支架的制备及观察
(1)使用Ⅰ型胶原作为主要支架成分,将Ⅰ型胶原(酸溶解)、0.1%NaOH溶液、10×PBS与1×109 L-1牙周膜干细胞悬液按照一定比例在4 ℃冰水混合物中混匀,加入FLEXCELL压力培养板的支架环中,在超净工作台上室温静置30 min,待支架凝固后,培养支架高度为1 mm,分为2组,分别加入普通培养基(α-MEM+体积分数为10%胎牛血清)及无血清培养基(α-MEM)进行培养。
(2)三维培养下人牙周膜干细胞的形态观察:对普通培养基及无血清培养基中三维培养下的人牙周膜干细胞在刚接种和2,12,48 h 4个时间点进行光镜下观察,观察细胞状态。
1.4.3 FLEXCELL压力培养箱对人牙周膜干细胞进行压力加载
(1)制备三维培养支架,将压力基台放在孔上,加入无血清培养基,细胞种板孵育24 h后进行压力加载,基台旋钮按照样本高度进行调节,将4块细胞培养板放置于黑色培养架上,培养架下放置一块玻璃板保证加压稳定性,随后将培养基台整体连接至压力加载系统中。顺序打开压力泵、压力传导仪,Flexcell 5000V 1.0软件设置加载压力值,根据样品直径进行压力值转化计算,计算公式为Fibs(磅)=0.177×a(MPa)× D(mm)2 (其中a为加载力值,D为样本直径)。将压力加载实验分为12组,加载类型见表1。另设置不加压组。
(2)对最大强度压力加载实验组及不加压对照组进行体式显微镜观察样本支架状态,并进行F-actin细胞骨架染色及活死细胞染色,倒置荧光显微镜观察三维培养的牙周膜干细胞。
1.4.4 条件培养基的获取 压力加载结束后收集人牙周膜干细胞培养上清,3 000 r/min离心10 min,去除沉淀,置于-80 ℃冰箱保存,用作条件培养基作用于RAW264.7细胞。
1.4.5 条件培养基作用于RAW264.7细胞 将第5-7代RAW264.7细胞分别以10 000/孔的密度接种于24孔培养板和以60 000/孔的密度接种于6孔培养板,各组人牙周膜干细胞上清用0.22 μm的滤膜过滤后,按照9∶1的比例每孔加入普通培养基和各组细胞上清[16];组13设置为不加压细胞上清干预组,组14阳性对照组设置为核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)(30 ng/mL)+巨噬细胞集落刺激因子(20 ng/mL)诱导组;组15空白组设置为不添加条件培养基组。
1.4.6 RAW264.7细胞破骨向分化的鉴定
(1)抗酒石酸酸性磷酸酶染色:24孔板培养,条件培养基作用RAW264.7细胞5 d,按照说明书进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色,体视显微镜及光镜下观察并拍照。使用Image J.Pro软件计算抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性区域(即红染区域)占比范围。
(2) qPCR检测破骨相关基因表达:6孔板培养,条件培养基作用RAW264.7细胞5 d,按照说明书提取RNA,检测RNA浓度及纯度。根据反转录试剂盒说明书进行反转录,随后进行 real-time PCR实验。每个反应使用同一cDNA样品进行3次重复,对3个样本来源的样品进行实验,计算目标基因相对于内参基因GAPDH表达量。引物设计见表2。
1.5 主要观察指标 ①三维培养条件下人牙周膜干细胞加压及不加压的形态变化以及细胞骨架染色、活死细胞染色状态;②Image J计算各组RAW264.7细胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性区域占比范围大小;③各组RAW264.7细胞中破骨分化相关基因表达水平。
1.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行数据分析,所有数据进行正态检验,采用单因素方差分析进行多重比较。文章统计学方法已经河北医科大学药学院医学统计学专家审核。