牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞软骨分化的蛋白组学分析

doi:10.12307/2023.641

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (24): 3795-3802.doi: 10.12307/2023.641

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牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞软骨分化的蛋白组学分析

马笃军1，2，朱厚均2，刘乐诗2，彭力平1，赵静2，廖州伟1

1广州中医药大学第四临床医学院，广东省深圳市 518033；2广州中医药大学，广东省广州市 510006

收稿日期:2022-03-28 接受日期:2022-08-23 出版日期:2023-08-28 发布日期:2023-01-18
通讯作者: 马笃军，硕士，副主任医师，硕士研究生导师，广州中医药大学第四临床医学院，广东省深圳市 518033；广州中医药大学，广东省广州市 510006
作者简介:马笃军，男，1985年生，湖南省郴州市人，汉族，2013年湖南中医药大学毕业，硕士，副主任医师，硕士研究生导师，主要从事中医药治疗骨关节疾患及干细胞修复软骨损伤的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81804124)，项目负责人：马笃军

Proteomic analysis on cartilage differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells induced by Achyranthes bidentata alcohol extract

Ma Dujun1, 2, Zhu Houjun2, Liu Leshi2, Peng Liping1, Zhao Jing2, Liao Zhouwei1

1The Fourth Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese medicine, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China; 2Guangzhou University of Chinese medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Received:2022-03-28 Accepted:2022-08-23 Online:2023-08-28 Published:2023-01-18
Contact: Ma Dujun, Master, Associate chief physician, Master’s supervisor, The Fourth Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese medicine, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China; Guangzhou University of Chinese medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
About author:Ma Dujun, Master, Associate chief physician, Master’s supervisor, The Fourth Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese medicine, Shenzhen 518033, Guangdong Province, China; Guangzhou University of Chinese medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81804124 (to MDJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

蛋白组学：是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学，本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得在蛋白质水平上对疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。
骨髓间充质干细胞：也称为骨髓基质成纤维细胞，是一类起源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能，可根据所处的微环境不同，进行细胞迁移、定植、增殖与分化，其中分化潜能属于目前的研究热点，常见分化为多种间质组织，如血管、脂肪、韧带、骨骼、软骨等。

背景：前期研究发现牛膝醇提物具有诱导骨髓间充质干细胞定向软骨细胞分化的作用，但具体作用蛋白靶点和网络机制不详。
目的：观察牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞软骨分化的蛋白质组学分析及蛋白质相互作用网络构建。
方法：采用密度梯度离心联合细胞贴壁法分离培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞，取第3代细胞随机分成5组：空白组、对照组、牛膝醇提物低、中、高剂量组，连续成软骨诱导培养21 d后，用qRT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA表达及甲苯胺蓝染色鉴定软骨细胞形成，应用绝对定量同位素标记(iTRAQ)结合双向液相色谱-串联质谱(2DLC-MS/MS)技术对各组差异表达蛋白质进行鉴定，并对差异蛋白进行GO分析、KEGG分析及蛋白质网络相互作用分析。

结果与结论：①qRT-PCR结果显示牛膝醇提物高剂量组较其他组Ⅱ型胶原mRNA表达明显增高(P < 0.05)，牛膝醇提物高剂量组甲苯胺蓝染色阳性，蛋白组学分析共鉴定到1 354个差异蛋白点，上调蛋白633个，下调蛋白721个。②根据qRT-PCR结果对空白组、牛膝醇提物高剂量组、对照组3组差异表达蛋白进行生物信息分析。GO分析发现这些差异表达蛋白参与代谢、细胞分化、细胞周期与凋亡、炎症反应、免疫调控、氧化应激、磷酸化、泛素化、癌相关等；KEGG分析获得与骨关节病最相关的10个典型信号通路：白细胞介素17信号通路，Toll样受体信号通路，Wnt信号通路，PI3K-Akt信号通路，mTOR 信号通路，Jak-STAT信号通路，NF-kappa B信号通路，MAPK信号通路，AMPK信号通路，HIF-1信号通路；根据组间差异蛋白，使用Cytoscape3.6.0软件成功构建蛋白互作网络图。③结果表明，牛膝醇提物可以通过调控氧化、细胞周期与凋亡、细胞结构改变、细胞分化、代谢及炎症损伤等环节诱导兔骨髓间充质干细胞成软骨分化，具有多靶点、多中心的网络调控作用，其具体作用机制有待进一步研究。

https://orcid.org/0000-0002-8050-2849 (马笃军)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 牛膝醇提物, 蛋白组学, 骨髓间充质干细胞, 软骨分化, iTRAQ技术

Abstract: BACKGROUND: Preliminary studies have found that Achyranthes bidentata alcohol extract can induce the directional chondrocyte differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, but the specific protein targets and network mechanisms are unknown.
OBJECTIVE: To observe the proteomic analysis of cartilage differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells induced by Achyranthes bidentata alcohol extract and the construction of protein interaction network.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells of New Zealand white rabbits were isolated and cultured by density gradient centrifugation combined with bone marrow adherent method. Passage 3 cells were randomly divided into five groups: blank group, control group, low-dose Achyranthes bidentata alcohol extract group, medium-dose Achyranthes bidentata alcohol extract group, and high-dose Achyranthes bidentata alcohol extract group. After continuous induction and culture for 21 days, qRT-PCR was used to detect the expression of type II collagen mRNA and toluidine blue staining was used to identify the formation of chondrocytes. The differentially expressed proteins of different groups were identified by absolute quantitative isotope labeling (iTRAQ) combined with two-way liquid chromatography tandem mass spectrometry, and the differentially expressed proteins were analyzed by GO analysis, KEGG analysis and protein interaction network analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The qRT-PCR results showed that the expression of type II collagen mRNA in the high-dose Achyranthes bidentata alcohol extract group was significantly higher than that in other groups (P < 0.05), and toluidine blue staining displayed positive reaction in the high-dose Achyranthes bidentata alcohol extract group. A total of 1 354 differential protein spots were identified by proteomic analysis, including 633 up-regulated proteins and 721 down-regulated proteins. (2) According to the results of qRT-PCR, the differentially expressed proteins of blank group, high-dose Achyranthes bidentata alcohol extract group and control group were analyzed. Go analysis showed that these differentially expressed proteins were involved in metabolism, cell differentiation, cell cycle and apoptosis, inflammatory response, immune regulation, oxidative stress, phosphorylation, ubiquitination, cancer and so on. KEGG analysis obtained 10 typical signal pathways most related to osteoarthritis: interleukin-17 signaling pathway, Toll like receptor signaling pathway, Wnt signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway, mTOR signaling pathway, JAK-STAT signaling pathway, NF-kappa B signaling pathway, MAPK signaling pathway, AMPK signaling pathway, and HIF-1 signaling pathway. According to the protein difference between groups, Cytoscape 3.6.0 software was used to successfully construct protein interaction network diagram. (3) These results suggest that Achyranthes bidentata alcohol extract can induce chondrogenic differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells by regulating oxidation, cell cycle and apoptosis, changes in cell structure, cell differentiation, metabolism and inflammatory injury. It has multi-target and multi-center network regulation, and its specific mechanism needs to be further studied.

Key words: Achyranthes bidentata alcohol extract, proteomics, bone marrow mesenchymal stem cell, cartilage differentiation, iTRAQ technology

中图分类号:

马笃军, 朱厚均, 刘乐诗, 彭力平, 赵静, 廖州伟. 牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞软骨分化的蛋白组学分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(24): 3795-3802.

Ma Dujun, Zhu Houjun, Liu Leshi, Peng Liping, Zhao Jing, Liao Zhouwei. Proteomic analysis on cartilage differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells induced by Achyranthes bidentata alcohol extract[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(24): 3795-3802.

图/表（结果） 12

2.1 骨髓间充质干细胞形态及鉴定结果骨髓间充质干细胞呈多角形贴壁生长，细胞形态较均匀、突起较多，呈集落状分布，经流式细胞术鉴定培养的细胞表型CD44、CD90阳性表达，见图3。

2.2 骨髓间充质干细胞诱导软骨分化Ⅱ型胶原mRNA表达及甲苯胺蓝染色结果 qRT-PCR检测结果表明，与空白组比较，牛膝醇提物高、中、低剂量组及对照组Ⅱ型胶原mRNA表达量明显增多，其中空白组与牛膝醇提物高剂量组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，牛膝醇提物高剂量组与对照组比较无明显差异(P > 0.05)，见图4，并且牛膝醇提物高剂量组甲苯胺蓝染色呈阳性改变，见图5。

2.3 iTRAQ的定性分析各组的同位素标记标签分别为空白组113；牛膝醇提物高剂量组114；牛膝醇提物中剂量组115；牛膝醇提物低剂量组116；对照组117，将原始质谱数据进行数据库搜索，并用FDR < 1%的标准来进行结果过滤(FDR为假阳性率)，得到肽段及蛋白鉴定结果。根据鉴定结果，对鉴定到的肽段和蛋白进行了肽段蛋白匹配情况、蛋白覆盖率、蛋白基本理化性质的统计分析，见图6。

2.4 iTRAQ的定量分析根据标签离子的峰强度进行样本间定量分析，得到的各组对比差异蛋白数统计结果见图7。

2.5 生物信息学分析根据Ⅱ型胶原qRT-PCR mRNA表达结果显示牛膝醇提物高剂量组诱导软骨细胞分化效果最佳，因此，选择空白组、牛膝醇提物高剂量组、对照组进行生物信息学分析。
2.5.1 差异蛋白质的 2DLC-MS/MS及数据库检索经过质谱分析、搜库、组间比较，共鉴定了组间差异上调或下调前15个有效差异表达蛋白，见表1，2。

2.5.2 差异蛋白的 GO分类、Pathway功能富集分析见图8，9。

2.5.3 差异蛋白的火山图对鉴定到的蛋白质根据其变化倍数及P值进行火山图展示，可直观显示差异蛋白的分布，见图10。

2.5.4 差异蛋白质相互作用网络图将空白组与牛膝醇提物高剂量组、对照组与牛膝醇提物高剂量组差异蛋白输入https://version-11-0.string-db.org/网站“Multiple proteins”中产生STRING数据库网络图，再采用Cytoscape 3.6.0软件进行蛋白相互作用网络图构建，见图11。

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，组间差异性分析采用非配对t检验。
1.2 时间及地点实验于 2020 年 1 月至 2021 年 12 月在广州中医药大学第四临床医学院中心实验室、威斯腾生物实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康新西兰大白兔12只，雌雄各半，两三个月龄，体质量(1.660±0.368) kg，由广东省实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(粤)2019-0035。实验通过广州中医药大学实验动物伦理委员会批准(伦理批号2018023)，实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 药物、试剂与仪器牛膝醇提物(原料来源怀牛膝，每毫升含原药材1 g，深圳市中医院院内制剂)。胰蛋白酶(Promega)；尿素(GibcoBRL)；EDTA(Amrecso)；PMSF(Amrecso)；DTT(Promega)；考马斯亮蓝染料G250(Amesco)；丙烯酰胺(Sigma)；TEMED(Sigma)；iTRAQ® Reagent-8Plex Multiplex Kit(SCIEX)；strata-X C18除盐柱(Phenomenex)；SCX强阳离子交换柱Luna SCX 250*4.60 mm 100Ǻ(Phenomenex)；L-DMEM 培养基(Gbico，美国，批号11995-065)；胎牛血清(Gibco，美国，批号10099-141)；地塞米松(普西唐，中国，批号D20066)；碱性成纤维细胞生长因子(Gibco，美国，批号PHG0367)；维生素C(Sigma，德国，批号A5960)；转化生长因子β1(MedChemExpress，美国，批号HY-P70648)；0.25%胰蛋白酶(碧云天，中国，批号 C0201)。常规液相色谱仪(RIGOL，L-3000)；纳升液相色谱仪(Dionex，ultimate 3000 nano LC system)；质谱仪(Thermo fisher，Q-Exactive)；扫描仪(UMAX，Powerlook 2100XL-USB)；电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-7C型)；离心机(Eppendorf，5417R型)；手掌式离心机(其林贝尔仪器，LX-100)；电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司，HWS24)；数据采集及处理软件(Thermofisher Proteome Discoverer 1.4)。
1.4 实验方法
1.4.1 牛膝醇提物含药血清制备 12只实验兔按照随机数字表法分为空白组、牛膝醇提物低剂量组、牛膝醇提物中剂量组、牛膝醇提物高剂量组，每组3只。《中国药典》2010年版牛膝常规高用量12 g，按照药理实验中动物与人体间的等效剂量进行换算，实验兔每日用量约1 g/kg。按照常规用药量的1，3，6倍，给予低剂量组1 g/(kg•d)、中剂量组3 g/(kg•d)、高剂量组6 g/(kg•d)，空白组0 g/(kg•d)，每天灌胃2次，每次灌胃时用蒸馏水配成10 mL。根据以上用药量连续用药7 d后制备牛膝醇提物含药血清。
1.4.2 骨髓间充质干细胞培养、分组及干预按照前期实验的方法[5]，从健康新西兰实验兔髂骨穿刺抽吸骨髓液，采用Percoll密度梯度离心法联合细胞贴壁法分离出骨髓间充质干细胞，并用流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞抗原表型CD90、CD44的表达。
取第3代骨髓间充质干细胞，胰酶消化，以5×107 L-1细胞浓度接种于24孔板中，每孔1 mL，加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液，同时加入地塞米松(39.25 mg/L)、
碱性成纤维细胞生长因子(10 μg/L)、维生素C(50 mg/L)，在37 ℃、体积分数为5%CO2孵箱内培养1周，间隔72 h换液1次，换液2次。从第2周起更换含体积分数为10%胎牛血清、体积分数为10%含药血清或空白血清的L-DMEM培养液，同时加入地塞米松和维生素C，继续培养3周，每日用倒置显微镜观察细胞形态变化并拍照。
细胞分组如下：①空白组：体积分数为10%胎牛血清+L-DMEM培养液+体积分数为10%空白血清；②牛膝醇提物高剂量组：体积分数为10%胎牛血清+L-DMEM培养液+体积分数为10%牛膝醇提物高剂量含药血清；③牛膝醇提物中剂量组：体积分数为10%胎牛血清+L-DMEM培养液+体积分数为10%牛膝醇提物中剂量含药血清；④牛膝醇提物低剂量组：体积分数为10%胎牛血清+L-DMEM培养液+体积分数为10%牛膝醇提物低剂量含药血清；⑤对照组(经典成软骨诱导组)：体积分数为10%胎牛血清+L-DMEM培养液+体积分数为10%空白血清+转化生长因子β1(10 μg/L)。
1.4.3 qRT-PCR检测骨髓间充质干细胞诱导软骨分化后Ⅱ型胶原mRNA相对表达量将骨髓间充质干细胞诱导培养21 d后，用Trizol试剂分别提取各组细胞的总RNA，以其中的mRNA为模板，采用随机引物，在反转录酶作用下反转录为cDNA，以此cDNA为第1链为模板，通过特异性引物，采用qRT-PCR扩增目的基因。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。引物合成使用Primer Premier 5.0软件，Ⅱ型胶原引物序列(5’ to 3’)：Forward：TGT GAA CTG GTA GAT CTG GT；Reverse：AAG AAG TGG AAT AAG TGG GCT。内参基因选择β-actin，引物序列(5’ to 3’)：Forward：TCA CCA TGG ATG ATG ATA TCG C；Reverse：CGT GCT CGA TGG GGT ACT TCA。
1.4.4 骨髓间充质干细胞诱导软骨分化后甲苯胺蓝染色鉴定骨髓间充质干细胞诱导培养21 d后，将细胞涂片放入体积分数95%乙醇中固定15 s，取出后滴加细胞专用甲苯胺蓝染色液，滴加等量蒸馏水于涂片上混匀，染色15 min，经过水洗、烘干后显微镜下观察。
1.4.5 蛋白质组学方法
(1)细胞蛋白样品的制备：取诱导培养21 d后细胞，待细胞生长密度达90%-100%时，吸出培养液，用胰酶消化，PBS洗涤细胞3次，加入500 μL细胞裂解液，充分混匀，冰浴超声5 min，4 ℃ 20 000 r/min离心1 h，取上清，使用Bradford法对蛋白进行定量，分装于-80 ℃冻存备用。
(2)蛋白质的酶解：每个样品取100 μg蛋白，加入到10 K超滤管中，4 ℃，14 000×g离心40 min，弃掉上层残留的培养基和细胞裂解液，加入200 μL 50%TEAB，4 ℃，14 000×g离心40 min，弃掉上层残留的液体，重复上述步骤2遍，加入1 μg/μL胰蛋白酶，每100 μg蛋白质底物加入3.3 μg胰蛋白酶，37 ℃水浴24 h，冻干酶解后的蛋白质，然后使用TEAB(水∶TEAB=1∶1)每管30 μL复溶冻干后的物质(肽段)。
(3)肽段的标记：标记试剂平衡至室温，每管标记试剂中加入70 μL异丙醇，混匀1 min，离心甩至管底。将混好的标记试剂加入到肽段中，不同样品用不同大小的同位素标记。肽段标记信息，空白组：113；牛膝醇提物高剂量组：114；牛膝醇提物中剂量组：115；牛膝醇提物低剂量组：116；对照组：117。混匀后，离心甩至管底，室温静置2 h。

(4)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)预分离：使用常规液相，强阳离子交换色谱柱(SCX)。标记后样品用A液稀释10倍，磷酸调pH值至3.0，15 000×g离心10 min，取上清；上样，按照设置好的分离梯度运行，得到预分离的色谱图，见图1。此次预分离共收集36个组分，按照色谱图分布，将出峰较少的部分合并，最终合并成16个组分并进行后续处理。

(5)肽段的纯化：使用C18反相色谱除盐，先用1 mL甲醇活化柱料，5%乙腈平衡，样品用1 mL MilliQ水稀释过柱，1 mL 5%乙腈洗柱除盐，2×500 μL纯乙腈洗脱，低温离心抽干乙腈，0.1%甲酸复溶纯化后肽段。

(6)差异蛋白的2DLC-MS/MS质谱分析：将16个预分离纯化后的组分分别上机检测。使用Q-Exactive质谱仪检测肽段信号。质谱扫描完毕，得到质谱原始文件，质谱总离子流示意图见图2。将质谱原始文件输入到PD(Proteome Discoverer 1.4，thermo)软件后，软件会对质谱谱图进行筛选。PD软件提取后的谱图用mascot进行搜索，搜索结束后，PD软件根据mascot搜索结果和第一步筛选后的谱图进行定量分析。

(7)生物信息学分析差异蛋白并构建生物网络预测互作图：通过Uniprot数据库中的注释信息鉴定iTRAQ筛选出的差异表达蛋白质，选择GO的生物过程、细胞成分和分子功能注释对蛋白进行分类和富集分析；利用KEGG GENES数据库进行信号通路分析；对差异蛋白绘制火山图，查看差异蛋白的分布情况。采用STRING 11.5(http://www.string-db.org/)数据库对实验鉴定到的所有蛋白质的相互作用进行预测，并绘制蛋白质相互作用网络图。
1.5 主要观察指标骨髓间充质干细胞诱导培养21 d后，qRT-PCR检测各组细胞的Ⅱ型胶原mRNA相对表达量，对Ⅱ型胶原mRNA相对表达量最高的组进行甲苯胺蓝染色和iTRAQ检测，并对差异蛋白点进行鉴定及GO、KEGG和蛋白质网络相互作用分析。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析，计量资料结果以x±s表示，组间差异性分析采用非配对t检验，差异蛋白组间直接比值，一般取1.2倍为差异筛选标准[≥1.2(蛋白上调)和≤0.8(蛋白下调)]选取差异蛋白，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

在一定条件下，骨髓间充质干细胞具有分化为软骨细胞的特性，并优于其他来源，自体骨髓间充质干细胞移植修复软骨损伤的效果也优于自体软骨细胞植入[6]，因此，使之成为该领域中研究最为深入的种子细胞。利用此项技术修复软骨，具有取材方便、对机体损伤小、体外扩增能力强、分化能力稳定等优点[7]，展现出良好前景。中医药治疗关节炎病损有一定的优势，含有多种有效成分，可多途径、多靶点发挥作用而提高疗效[8]，牛膝是在此类中药中较为突出的一味[9]。牛膝不但能活血通经，还能补肝肾、强筋骨，主要化学成分含有多糖类、皂苷类、甾酮类、黄酮类及多种微量元素等[10]，针对关节疾患的主要药理作用包括抗炎镇痛[11]、保护关节软骨[12]、促进干细胞修复软骨等[13]，但具体作用机制不详。
该研究通过iTRIQ 技术分析牛膝醇提物干预骨髓间充质干细胞实验共鉴定到1 354个差异蛋白点，其中上调蛋白633个，下调蛋白721个。采用qRT-PCR检测显示牛膝醇提物高剂量组较其他组Ⅱ型胶原mRNA表达明显增高，甲苯胺蓝染色呈阳性表现。因此，对空白组、牛膝醇提物高剂量组、对照组进行GO及Pathway功能富集分析，其中空白组与牛膝醇提物高剂量组差异蛋白GO分析显示主要亚细胞定位于核糖体、细胞浆、细胞膜，生物学过程涉及细胞应激、细胞趋化、软骨发育、蛋白调控、代谢等，分子功能涉及核糖体结构变化、蛋白酶活性改变、DNA及RNA的结构重组等；KEGG分析涉及核糖体通路、肌动蛋白细胞骨架的调节通路、白细胞介素17信号通路、Toll样受体信号通路、Jak-STAT信号通路、TNF信号通路、Wnt 信号通路、p53 信号通路、VEGF 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、mTOR 信号通路、NF-kappa B 信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路、AMPK信号通路，不饱和脂肪酸的生物合成、黏着斑、酪氨酸代谢及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等通路。对照组与牛膝醇提物高剂量组差异蛋白GO分析显示主要亚细胞定位于细胞膜、细胞骨架，生物学过程涉及蛋白质聚合、细胞分化、代谢等，分子功能涉及分子结构、泛素化、NAD结合、表皮的结构成分等；KEGG分析涉及吞噬体、系统性红斑性狼疮、类风湿性关节炎、类固醇激素合成、细胞分化等通路。通过结合文献，以上KEGG分析与骨关节病变最相关的10个典型信号通路：白细胞介素17信号通路[14]，Toll样受体信号通路[15]，Wnt 信号通路[16]，PI3K-Akt信号通路[17]，mTOR信号通路[18]，Jak-STAT信号通路[19]，NF-kappa B信号通路[20]，MAPK信号通路[21]，AMPK信号通路[22]，HIF-1信号通路[23]，这些信号通路涉及细胞增殖、分化、代谢以及炎症微环境的调控。
综上所述，利用iTRIQ技术筛选牛膝醇提物诱导骨髓间充质干细胞软骨分化的相关差异蛋白，对差异表达蛋白进行GO及KEGG分析，为中药诱导干细胞分化提供了一定的新思路。未来需要扩大样本量，并利用基因编辑技术修饰关键信号通路靶点蛋白的特异基因进行验证，以期更加准确的寻找靶点蛋白，并利用动物实验验证靶点蛋白、靶点基因的疗效结果，为“中药+干细胞”修复关节软骨病损提供更多的理论支持。

牛膝醇提物诱导兔骨髓间充质干细胞软骨分化的蛋白组学分析

Proteomic analysis on cartilage differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells induced by Achyranthes bidentata alcohol extract

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