骨髓间充质干细胞对衰老猕猴胸腺及脾脏结构和功能的影响

doi:10.12307/2023.643

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (19): 2953-2959.doi: 10.12307/2023.643

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骨髓间充质干细胞对衰老猕猴胸腺及脾脏结构和功能的影响

潘杭1，2，朱向情2，何洁2，杨再玲4，田川2，吕冠柯5，阮光萍2，叶丽1，2，何志旭6，舒莉萍3，潘兴华2

1贵州医科大学，组织工程与干细胞实验中心，贵州省贵阳市 550004；2中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室、云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室、昆明市干细胞与再生医学重点实验室、基础医学实验室，云南省昆明市 650032；3贵州医科大学基础医学院免疫学教研室、细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室、贵州省再生医学重点实验室、省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室、中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室，贵州省贵阳市 550004；4贵州医科大学附属医院肿瘤医院，贵州省贵阳市 550004；5四川省医学科学院、四川省人民医院，四川省成都市 610000；6遵义医科大学附属医院儿科学教研室，贵州省遵义市 563100

收稿日期:2022-07-13 接受日期:2022-08-25 出版日期:2023-07-08 发布日期:2022-11-28
通讯作者: 潘杭，女，1996年生，贵州省安顺市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事骨髓间充质干细胞抗衰老研究。
作者简介:潘兴华，博士，主任医师，中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室、云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室、昆明市干细胞与再生医学重点实验室、基础医学实验室，云南省昆明市 650032 舒莉萍，博士，教授，贵州医科大学基础医学院免疫学教研室、细胞工程生物医药技术国家地方联合工程实验室、贵州省再生医学重点实验室、省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室、中国医学科学院成体干细胞转化研究重点实验室，贵州省贵阳市 550004
基金资助:
云南省科技计划项目重大科技专项(2018ZF007)，项目负责人：潘兴华

Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on the structure and function of thymus and spleen in aging rhesus monkeys

Pan Hang1, 2, Zhu Xiangqing2, He jie2, Yang Zailing4, Tian Chuan2, Lyu Guanke5, Ruan Guangping2, Ye Li1, 2, He Zhixu6, Shu Liping3, Pan Xinghua2

1Tissue Engineering and Stem Cell Experimental Center, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Stem Cells and Immune Cells Biomedical Techniques Integrated Engineering Laboratory of State and Regions, Cell Therapy Technology Transfer Medical Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine, Basic Medical Laboratory, 920 Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China;3Department of Immunology of School of Basic Medicine of Guizhou Medical University, National and Local Joint Engineering Laboratory of Cell Engineering Biomedical Technology, Key Laboratory of Regenerative Medicine of Guizhou Province, State Key Laboratory of Efficacy and Utilization of Medicinal Plants Co-constructed by Province and Ministry, Key Laboratory of Translational Research of Adult Stem Cell of Chinese Academy of Medical Sciences, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 4Tumor Hospital, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 5Sichuan Academy of Medical Sciences, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610000, Sichuan Province, China; 6Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563100, Guizhou Province, China

Received:2022-07-13 Accepted:2022-08-25 Online:2023-07-08 Published:2022-11-28
Contact: Pan Hang, Master candidate, Tissue Engineering and Stem Cell Experimental Center, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Stem Cells and Immune Cells Biomedical Techniques Integrated Engineering Laboratory of State and Regions, Cell Therapy Technology Transfer Medical Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine, Basic Medical Laboratory, 920 Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Pan Xinghua, MD, Chief physician, Stem Cells and Immune Cells Biomedical Techniques Integrated Engineering Laboratory of State and Regions, Cell Therapy Technology Transfer Medical Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine, Basic Medical Laboratory, 920 Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China Shu Liping, MD, Professor, Department of Immunology of School of Basic Medicine of Guizhou Medical University, National and Local Joint Engineering Laboratory of Cell Engineering Biomedical Technology, Key Laboratory of Regenerative Medicine of Guizhou Province, State Key Laboratory of Efficacy and Utilization of Medicinal Plants Co-constructed by Province and Ministry, Key Laboratory of Translational Research of Adult Stem Cell of Chinese Academy of Medical Sciences, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the Major Science and Technology Project of Yunnan Science and Technology Plan Project, No. 2018ZF007 (to PXH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

免疫衰老：随着年龄的增长，机体发生免疫系统功能障碍的过程，导致老年人口感染、癌症和自身免疫性疾病的发生率增加。
衰老相关分泌表型：随着年龄增长，机体发生衰老，细胞也会发生功能丧失，细胞衰老通过分泌高水平的炎症细胞因子、趋化因子、生长因子以及金属蛋白酶来影响邻近细胞，从而引起慢性炎症。

背景：随着年龄的增长，脾脏的结构和功能发生改变，胸腺在青春期之后逐渐萎缩退化，导致机体发生免疫功能障碍。
目的：探讨骨髓间充质干细胞对衰老猕猴胸腺及脾脏结构和功能的作用。
方法：筛选出平均年龄25岁老年猕猴6只，随机分为老年组和老年治疗组各3只；老年治疗组猕猴经股静脉输注超顺磁性铁纳米颗粒标记的第4代骨髓间充质干细胞(1×107个/kg)，1次/d，连续输注3 d，老年组猕猴在同一时间输注等体积的生理盐水；猕猴最后一次输注骨髓间充质干细胞5个月后给予安乐死处理，取出胸腺以及脾脏组织；苏木精-伊红染色观察胸腺组织和脾脏组织的结构变化；免疫荧光染色分析胸腺组织中各种T细胞亚群以及衰老相关基因蛋白P21的表达量变化；免疫组织化学染色分析脾脏组织中各种T细胞亚群以及衰老相关基因蛋白P21的表达量变化；安乐死处理猕猴之前抽取各组猕猴股静脉血5 mL，运用酶联免疫分析外周血血清中衰老相关分泌表型肿瘤坏死因子α和白细胞介素1α的分泌水平。
结果与结论：①超顺磁性铁纳米颗粒标记的骨髓间充质干细胞经过股静脉输注入猕猴体内能够成功定植在衰老胸腺和脾脏组织中发挥作用；②骨髓间充质干细胞移植治疗后，衰老猕猴中胸腺部分组织出现清晰的皮质与髓质交界，脂肪细胞减少，出现胸腺小体，向正常的胸腺组织结构转变；衰老猕猴中脾脏组织出现清晰的红髓与白髓分界，脾小体的边缘多完整，且巨噬细胞减少，向正常的脾脏组织结构转变；③与老年组相比，老年治疗组衰老胸腺和脾脏组织中CD3+、CD4+以及CD8+T细胞的表达量呈现增高的趋势，老年治疗组衰老胸腺和脾脏组织中P21蛋白的表达量呈现显著下降趋势；④与老年组相比，老年治疗组外周血中衰老相关分泌表型肿瘤坏死因子α以及白细胞介素1α的分泌水平呈现显著下降趋势；⑤上述结果表明，通过骨髓间充质干细胞的移植治疗，能够改善老年猕猴胸腺及脾脏组织的结构和功能。
https://orcid.org/0000-0003-2231-9672 (潘杭)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 猕猴, 胸腺, 脾脏, 抗衰老, 免疫, 衰老相关分泌表型

Abstract: BACKGROUND: With the increase of age, the structure and function of the spleen changed, and the thymus gradually atrophied and degenerated after puberty, resulting in immune dysfunction.
OBJECTIVE: To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the structure and function of thymus and spleen in aging rhesus monkeys.
METHODS: Six aging rhesus monkeys with an average age of 25 years were randomly divided into elderly group (n=3) and elderly treatment group (n=3). Rhesus monkeys in the elderly treatment group were infused with the 4th generation bone marrow mesenchymal stem cells (1×107/kg) labeled with superparamagnetic iron nanoparticles through femoral vein once a day for 3 consecutive days. Rhesus monkeys in the elderly group were infused with the same volume of normal saline at the same time. The rhesus monkeys were euthanized 5 months after the last infusion of bone marrow mesenchymal stem cells. The thymus and spleen tissues were obtained. The structural changes of thymus and spleen tissues were observed by hematoxylin and eosin staining. Immunofluorescence staining was used to analyze the expression of T cell subsets and age-related gene protein P21 in thymus tissues. Immunohistochemical staining was used to analyze the expression of T cell subsets and age-related gene protein P21 in spleen tissues. Before euthanized, 5 mL of femoral venous blood was extracted by heparin tube. The levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-1α in peripheral blood serum were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Superparamagnetic iron nanoparticles labeled bone marrow mesenchymal stem cells could colonize and play a role in aging thymus and spleen tissues in rhesus monkeys. (2) After transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells, the cortex and medulla junction appeared in some tissues of the aged rhesus monkeys, and the adipocytes decreased, and the thymic body appeared, and the structure of thymus changed to normal. The splenic tissue of aged rhesus monkeys showed a clear boundary between red pulp and white pulp, and the edge of the splenic body was more complete, and the macrophages were reduced, and the structure of spleen tissue changed to normal. (3) Compared with the elderly group, the expression of CD3+, CD4+ and CD8+ T cells in senile thymus and spleen tissues in the elderly treatment group showed a trend of increase. The expression of P21 protein in senile thymus and spleen tissues in the elderly treatment group showed a significant downward trend. (4) Compared with the elderly group, the levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-1α in peripheral blood of the elderly treatment group showed a significant downward trend. (5) These results indicated that transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells could improve the structure and function of thymus and spleen tissues in aged rhesus monkeys.

Key words: stem cell, bone marrow mesenchymal stem cell, rhesus monkey, thymus, spleen, anti-aging, immunity, senescence-associated secretory phenotype

中图分类号:

潘杭, 朱向情, 何洁, 杨再玲, 田川, 吕冠柯, 阮光萍, 叶丽, 何志旭, 舒莉萍, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞对衰老猕猴胸腺及脾脏结构和功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(19): 2953-2959.

Pan Hang, Zhu Xiangqing, He jie, Yang Zailing, Tian Chuan, Lyu Guanke, Ruan Guangping, Ye Li, He Zhixu, Shu Liping, Pan Xinghua. Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on the structure and function of thymus and spleen in aging rhesus monkeys[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(19): 2953-2959.

图/表（结果） 10

2.1 猕猴骨髓间充质干细胞的形态骨髓间充质干细胞呈长梭形、星形、成纤维细胞样，呈漩涡状生长，细胞表面标记物CD73、CD105、CD90、CD34、CD45的阳性表达率分别为99.9%，99.9%，97.2%，0.61%和0.081%，具备向成脂、成骨以及成软骨等分化潜能[23]。第4代骨髓间充质干细胞融合达培养瓶底部85%-90%以上时，细胞形态为星形、长梭形，见图1。

2.2 猕猴骨髓间充质干细胞的归巢由图2可见，经股静脉输注超顺磁性铁纳米颗粒标记的第4代骨髓间充质干细胞能够成功定植到衰老猕猴的胸腺和脾脏组织发挥作用。

2.3 猕猴胸腺和脾脏组织苏木精-伊红染色结果老年组猕猴胸腺组织的皮质与髓质结构紊乱，胸腺实质被大量脂肪细胞所替代，见图3A；老年治疗组猕猴胸腺部分组织出现清晰的皮质与髓质界限，出现胸腺小体，脂肪细胞减少，见图3B；老年组猕猴脾脏组织的红髓与白髓结构紊乱，脾小体的边缘多不完整，巨噬细胞数目增多，含铁黄素增多，见图3C；老年治疗组猕猴脾脏组织的红髓与白髓分界清楚，脾小体的边缘多完整，且巨噬细胞数量减少，见图3D。

2.4 猕猴胸腺和脾脏组织中T细胞的表达由图4可见，两组胸腺组织中CD3+T细胞被染成绿色，CD4+T细胞被染成红色，CD8+T细胞被染成粉色，细胞核被染成蓝色。由图5可见，两组脾脏组织中CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞被染成棕黄色。

通过平均吸光度值分析，与老年组相比，老年治疗组中胸腺组织CD3+T细胞的表达量呈现增多趋势，且差异有显著性意义(P < 0.01)，CD4+T细胞的表达量改变不明显，差异无显著性意义(P > 0.05)，CD8+T细胞的表达量呈现增多趋势，且差异有显著性意义(P < 0.001)，见图6。

通过阳性率分析，与老年组相比，老年治疗组中脾脏组织CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的表达量都呈现增高的趋势，且差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图6。
2.5 猕猴胸腺和脾脏组织中衰老相关基因P21蛋白的表达由图7和图8可见，两组胸腺和脾脏组织中P21蛋白被染成红色，细胞核被染成蓝色。通过平均吸光度值和阳性率分析，与老年组相比，老年治疗组中胸腺和脾脏组织P21蛋白表达量均呈显著降低趋势，且差异有显著性意义(P < 0.05)，见图9。

2.6 外周血中衰老相关分泌表型肿瘤坏死因子α和白细胞介素1α的分泌水平由图10可见，经过骨髓间充质干细胞治疗后外周血中促炎因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1α的分泌水平呈现显著下降趋势，差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

机体的衰老会引起各个器官发生一系列形态变化，最终导致器官功能衰退[1-2]，最突出的标志之一是免疫衰老，即机体免疫系统功能障碍，导致老年人先天免疫以及获得性免疫功能的改变[3-4]，免疫力的下降提高了老年人对癌症以及传染病的易感性[5]。胸腺是人体重要的中枢免疫器官，是T细胞发育、分化和成熟的重要部位，其在调节细胞免疫和体液免疫方面发挥重要作用。同时，胸腺是人体最早衰老的器官，是一个会发生增龄性萎缩的器官，其萎缩会导致免疫功能丧失[6-7]。而脾脏是机体最大的淋巴器官，也是重要的外周免疫器官之一，通常参与体液免疫的调节，随着年龄的增长，脾脏结构发生不同程度的改变和功能的衰退[8]。
在机体衰老的过程中，细胞会随着年龄的增长而发生功能的丧失，衰老的细胞能通过分泌高水平的炎症细胞因子、趋化因子、生长因子以及金属蛋白酶来影响邻近细胞，这些因子统称为衰老相关分泌表型[9]。衰老相关分泌表型是细胞衰老的表现特征，影响着细胞的微环境，与细胞衰老、个体衰老以及衰老相关疾病有着紧密联系，是很多慢性疾病的主要驱动因素[10]。
为了改善免疫功能障碍，可以通过中药治疗、切除睾丸或卵巢、补充生长激素、甲状腺激素、胰岛素样生长因子、胸腺生成素等方法来延缓胸腺和脾脏的衰老，例如，张梦思等[11]运用当归多糖治疗衰老模型大鼠，发现衰老脾脏的萎缩程度减弱，改善了脾脏的结构，促进脾细胞增殖以及激活脾细胞功能。FAHY 等[12]用重组人生长激素联合脱氢表雄酮、二甲双胍治疗 51-65 岁的健康志愿者，发现 18 个月后胸腺恢复生长，周围脂肪组织减少，淋巴细胞比例显著提高。众多的治疗方法是通过中药治疗、手术、补充外源性调节(性)激素、细胞因子、转录因子来延缓胸腺和脾脏的衰老，其治疗效果是暂时的，因此需要寻求延长治疗效果的方法。间充质干细胞主要存在于结缔组织以及间质器官中，在骨髓组织中含量丰富，可作为储备细胞，因其有组织再生潜能，所以在组织工程和细胞治疗中的应用日益广
泛[13-15]。骨髓间充质干细胞是一种存在于骨髓中具有较高自我更新能力、较强增殖能力和多向分化潜能的干细胞，可以分化为软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞等间充质细胞[16]，可作为组织工程和再生医学的理想种子细胞[15]，因其可归巢到受损组织，抑制氧化应激和炎症反应、修复受损组织以及调节免疫系统[17-18]，目前大量研究已经证明骨髓间充质干细胞能在调节炎症以及改善免疫功能障碍方面发挥重要作用[19-20]。已有使用骨髓间充质干细胞进行临床Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期试验，证明骨髓间充质干细胞的安全性和有效性[21-22]，这为骨髓间充质干细胞治疗免疫衰老提供新的治疗视角，是一种创新型治疗方法。
此次研究旨在对骨髓间充质干细胞治疗衰老猕猴进行疗效评价，揭示骨髓间充质干细胞能够同时延缓胸腺和脾脏的衰老，改善机体的免疫功能障碍，提高机体免疫力，同时减轻体内的炎症反应。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验和体内实验。组间差异的统计学比较采用独立样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2021年6-12月在中国科学院昆明动物研究所和中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院细胞生物治疗中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物由中国科学院昆明动物研究所提供健康老年雌性猕猴6只，平均年龄25岁，体质量4.0-6.0 kg。所有猕猴均饲养于中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院动物室内，体型正常，饲养期间环境清洁卫生，动物笼具清洁干燥，动物许可证号 SYXK(军)2017-0051。
实验方案经解放军联勤保障部队第九二〇医院动物实验伦理委员会批准，批件号为伦审2019-032(科)-01，实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 实验主要试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(BI 公司)；超顺磁性铁纳米颗粒(SPION)(南京东纳生物)；抗体CD3、CD4、CD8、P21(武汉赛维尔生物科技有限公司)；普鲁士蓝染液套装(武汉赛维尔生物科技有限公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司公司)；猴肿瘤坏死因子α和猴白细胞介素1α ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司)。
1.3.3 实验仪器 SW-CL-2F 型百万层级层流超净工作台(苏州佳宝净化工程设备公司)；离心机(湖南湘仪公司)；CO2细胞培养箱(美国 Thermo公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS 公司)；正置荧光显微镜(日本康尼)。
1.4 实验方法
1.4.1 猕猴骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定以及超顺磁性铁纳米颗粒标记猕猴骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养、免疫表型鉴定和多向分化能力鉴定，可参考课题组既往发表的文献[23]。倒置相差显微镜下观察间充质干细胞的形态、活性以及生长状况，待第4代骨髓间充质干细胞融合达到80%-90%时，分别进行骨髓间充质干细胞的免疫表型鉴定和成脂、成骨、成软骨诱导分化能力鉴定以及超顺磁性铁纳米颗粒标记。
1.4.2 动物分组及细胞移植 6只猕猴正常喂养1周后无异样变化，随机进行分组，即老年组3只以及老年治疗组3只。老年治疗组猕猴采用静脉注射法按1×107个/kg经股静脉将超顺磁性铁纳米颗粒标记的第4代骨髓间充质干细胞注入猕猴体内，1次/d，连续3 d输注；老年组猕猴同一时间输注等体积生理盐水。
1.4.3 胸腺及脾脏组织苏木精-伊红染色骨髓间充质干细胞最后一次经股静脉输注入老年治疗组猕猴5个月后进行安乐死处理，立即取出胸腺组织及脾脏组织，生理盐水清洗后用40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h，进行脱水、常规石蜡包埋切片、苏木精-伊红染色，显微镜下观察猕猴胸腺结构以及脾脏结构变化。
1.4.4 普鲁士蓝染色胸腺和脾脏组织常规石蜡包埋切片，切片厚约4 μm，每个切片将石蜡脱蜡至水，组织切片置于普鲁士蓝染液A和普鲁士蓝染色B等比例混合的普鲁士蓝染液中染色1 h，蒸馏水洗2遍，普鲁士蓝染液C染色3 min，流水冲洗，脱水后中性树胶封固，显微镜镜检，图像采集。
1.4.5 胸腺免疫荧光三标实验胸腺常规石蜡包埋切片，切片厚度约4 μm，将石蜡脱蜡至水，组织切片用EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)进行抗原修复，PBS脱色洗涤3次，用组化笔在组织周围画圈，体积分数3%双氧水室温避光孵育25 min，封闭内源性的过氧化物酶，PBS脱色洗涤3次，滴加BSA封闭 30 min，加入配好的CD4抗体，置于4 ℃孵育过夜，PBS脱色洗涤3次，再加入对应HRP标记的山羊抗小鼠二抗，室温孵育 50 min，PBS脱色洗涤3次，滴加CY3-TSA，避光室温孵育 10 min，置于TBST中脱色洗涤3次，置于EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)中，再放入微波处理，加入配好的CD3抗体置于4 ℃孵育过夜，PBS脱色洗涤3次，加入对应HRP标记的山羊抗小鼠二抗，避光室温孵育 50 min，PBS脱色洗涤3次，滴加FITC-TSA，避光室温孵育10 min，置于TBST中脱色洗涤3次，置于EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)中，再放入微波处理，加入配好的CD8抗体置于4 ℃孵育过夜，PBS脱色洗涤3次，加入对应CY5标记的山羊抗兔荧光二抗，避光室温孵育 50 min，PBS脱色洗涤3次，DAPI复染细胞核，避光室温孵育10 min，PBS脱色洗涤3次，圈内加入自发荧光淬灭剂5 min，流水冲洗10 min，PBS脱色洗涤3次，用抗荧光淬灭剂封固，切片置于扫描仪采集图像，运用Image-Pro Plus 6.0 软件计算平均吸光度值(平均吸光度=积分吸光度/目标分布区域的面积)。
1.4.6 胸腺免疫荧光单标实验胸腺常规石蜡包埋切片，切片厚度 4 μm，将石蜡脱蜡至水，组织切片用EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)置于微波炉中进行抗原修复，PBS脱色洗涤3次，用组化笔在组织周围画圈，滴加BSA封闭30 min，甩掉封闭液，切片上滴加PBS按一定比例配好的P21抗体，置于湿盒内4 ℃孵育过夜，PBS脱色洗涤3次，切片稍甩干后在圈内滴加相应种属二抗覆盖组织，避光室温孵育50 min，PBS脱色洗涤3次，DAPI复染细胞核，避光室温孵育10 min，PBS脱色洗涤3次，圈内加入自发荧光淬灭剂5 min，流水冲洗10 min，切片稍甩干后用抗淬灭封片剂封固，荧光显微镜观察并采集图像，运用Image-Pro Plus 6.0 软件计算平均吸光度值(平均吸光度=积分吸光度/目标分布区域的面积)。
1.4.7 脾脏免疫组织化学染色脾脏常规石蜡包埋切片，切片厚度 4 μm，每个切片将石蜡脱蜡至水，组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液(pH 6.0)中放于微波炉内进行抗原修复，PBS脱色洗涤3次，加入体积分数3%双氧水室温避光25 min，PBS脱色洗涤3次，组化圈内滴加3%BSA室温封闭30 min，甩掉封闭液，分别加入配好的CD3抗体，CD4抗体，CD8抗体，P21抗体，4 ℃孵育过夜，PBS脱色洗涤3次，圈内滴加CD3抗体、CD8抗体和P21抗体相应的HRP标记的山羊抗兔二抗，CD4抗体相应的HRP标记的山羊抗小鼠二抗，室温孵育50 min，PBS脱色洗涤3次，圈内滴加新鲜配制的AEC显色液，避光孵育25 min，阳性为红色，自来水冲洗终止显色，苏木素复染4 min，自来水冲洗，苏木素分化液分化，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗，甘油明胶封固，显微镜镜检，图像采集分析，通过Image J 1.46r.软件计数呈阳性率(阳性率=阳性细胞数/细胞总数)。
1.4.8 酶联免疫分析外周血中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1α水平老年组和老年治疗组猕猴安乐死之前股静脉采血5 mL，加入肝素管中，2 000 r/min离心10 min，将所得血清转移至1.5 mL离心管中。设置空白孔、标准品孔和待测样品孔，标准品孔中各加不同浓度的标准品50 μL，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品 10 μL，每孔加入酶标试剂 100 μL，空白孔除外，用封板膜封板后置 37 ℃温育 60 min，揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液(20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释)，静置30 s后弃去，如此重复5次，每孔先加入50 μL显色剂A，再加入50 μL显色剂B，轻轻振荡混匀，37 ℃避光显色15 min，每孔加终止液 50 μL，终止反应。以空白孔调零，在15 min内读取吸光度值。以标准物的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘出标准曲线，根据样品吸光度值查找相应浓度，乘以稀释倍数，即为样品实际浓度。
1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞经股静脉输注之后能否定植于衰老的胸腺和脾脏发挥作用；②老年组与老年治疗组胸腺和脾脏组织的结构变化；③老年组与老年治疗组胸腺和脾脏组织中CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群的表达变化；④老年组与老年治疗组胸腺和脾脏的衰老相关基因蛋白P21的表达变化；⑤老年组与老年治疗组外周血中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1α分泌水平变化。
1.6 统计学分析所有数据通过Graphpad prism 9.0统计分析软件对所得数据进行分析统计，通过Image-Pro Plus 6.0 软件对所得免疫荧光染色图片进行平均吸光度分析和通过
Image-J 1.4.3.67软件对免疫组织化学染色所得图片进行阳性率分析。统计结果以x±s表示，组间差异的统计学比较采用独立样本t检验(Independent-Samples t Test)，P < 0.05 为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院生物统计学专家审核。

讨论

随着年龄的增长，机体发生衰老，这是一个涉及多种因素的复杂过程，包括DNA损伤、端粒丢失和缩短、基因组不稳定、表观遗传学改变、线粒体功能异常、细胞衰老、干细胞衰老以及耗竭、衰老相关分泌表型的变化、细胞损伤、氧化应激、代谢紊乱和免疫功能障碍等[24-25]。免疫系统在机体防御、自我稳定和体内监测中发挥着重要作用。然而，免疫系统功能障碍导致机体易受到病原体的侵袭，机体的免疫功能下降，易受感染，患肿瘤疾病的概率增加等。
胸腺是T细胞分化以及发育的重要场所，脾脏是人体最大的免疫器官和重要的外周免疫器官之一，胸腺和脾脏与体液免疫和细胞免疫有着重要的联系。随着年龄的增长，胸腺发生增龄性萎缩，T细胞的数量减少、功能丧失，以及脾脏的结构和功能发生退化，进而导致机体的免疫系统功能丧失[8，26]。
此次研究中，选取猕猴为实验动物，其属于非人灵长类动物，与人类的基因组高度同源，衰老特征与人类高度相似[27]，胸腺和脾脏组织的组成与人体相似，以此为研究对象，实验结果更接近于人体衰老胸腺以及脾脏治疗的研究，能够为临床的发病机制、疾病防治以及安全评价等方面的研究奠定扎实的理论基础。
苏木精-伊红染色显示衰老胸腺的皮质与髓质结构紊乱，大量脂肪细胞替代胸腺实质，衰老脾脏中红髓与白髓结构紊乱，脾小体的边缘多不完整，巨噬细胞数目增多，含铁黄素增多；经过猴骨髓间充质干细胞处理后，衰老胸腺中皮质与髓质界限清晰，出现胸腺小体，脂肪细胞减少，衰老脾脏中红髓与白髓分界清楚，脾小体的边缘多完整，且巨噬细胞少，说明骨髓间充质干细胞能够改善猕猴胸腺和脾脏组织的结构，部分胸腺和脾脏能够发生再生，猜想可能是骨髓间充质干细胞经过静脉运输定植到衰老的胸腺和脾脏来发生作用，自分泌或分泌细胞因子促进胸腺和脾脏组织基质细胞的增生[3]，此猜想还有待进行验证。
胸腺是重要的中枢免疫器官，是T细胞发育、分化和成熟的场所，胸腺发生增龄萎缩，T细胞的数量下降和功能降低，经平均吸光度分析显示老年治疗组猕猴给予骨髓间充质干细胞处理后衰老胸腺中CD3+、CD4+和CD8+T细胞与老年组相比明显增加，说明骨髓间充质干细胞能够增加胸腺中成熟的T细胞数量，提高成熟T细胞的输出水平[3]。脾脏是成熟淋巴细胞定居的场所，其中T淋巴细胞约占脾淋巴细胞总数的40%，随着年龄的增长，迁移到脾脏中的T淋巴细胞总量降低，骨髓间充质干细胞处理后，衰老脾脏中CD3+、CD4+和CD8+T细胞与老年组相比明显增加，说明骨髓间充质干细胞可能提高胸腺中成熟的T细胞输出水平，成熟的T细胞迁移到脾脏中的数量增加，提示骨髓间充质干细胞能延缓胸腺增龄性萎缩，增加T细胞数量和功能，改善机体免疫功能[3]。
P21是一种广谱的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物，其抑制E2F活性，而E2F是一种促进细胞周期进程所需要表达的转录因子，或者P21的C末端与增殖细胞核有一个独特的结合部位，然后抑制增殖细胞核抗原的DNA复制活性，从而使细胞周期停滞[28-30]。通过此次研究发现，衰老猕猴胸腺和脾脏组织经过骨髓间充质干细胞处理后，P21蛋白的表达显著降低，说明骨髓间充质干细胞能够抑制体内P21的表达，抑制细胞周期的停滞，这可能是逆转胸腺和脾脏衰老的一种机制之一。
随着年龄的增长，机体逐渐衰老，体内细胞也发生衰老，衰老的细胞会分泌大量的细胞因子，包括促炎细胞因子、趋化因子、生长因子和基质金属蛋白酶等，这些因子统称为衰老相关分泌表型，其可以通过自分泌或者旁分泌参加细胞衰老的多种生物学效应，并且衰老相关分泌表型持续存在引起机体慢性炎症，加快机体衰老，促进肿瘤的产生和侵袭[31]。骨髓间充质干细胞能够显著增加抗炎细胞因子(如白细胞介素10等)的产生而抑制促炎细胞因子(如干扰素γ和肿瘤坏死因子α等)的分泌，进而诱导巨噬细胞从M1表型转变为M2表型，促炎(M1型)巨噬细胞抑制骨髓间充质干细胞的活性，而抗炎(M2型)巨噬细胞支持骨髓间充质干细胞的生长[32]。通过此次研究发现，骨髓间充质干细胞处理后，促炎因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1α较老年组的分泌水平显著下降，说明通过骨髓间充质干细胞处理后能够抑制衰老细胞分泌促炎因子，缓解机体的炎症反应，猜想可能骨髓间充质干细胞通过抑制衰老相关分泌表型中促炎细胞因子的分泌同时诱导免疫细胞(如巨噬细胞等)共同作用于机体，来减缓机体炎症反应，但骨髓间充质干细胞干预衰老相关分泌表型的分泌机制尚不清楚，有待继续进行探索。
综上所述，骨髓间充质干细胞能够改善衰老猕猴胸腺和脾脏的组织结构，增加胸腺中成熟的T细胞数量，提高成熟T细胞的输出水平，增加脾脏成熟T细胞的定植，改善机体的免疫功能，同时也能抑制胸腺和脾脏中衰老相关基因蛋白的表达，抑制细胞周期的停滞以及促炎因子的分泌，减少炎症反应，但是具体的作用机制还需要进一步进行实验验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞对衰老猕猴胸腺及脾脏结构和功能的影响

Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on the structure and function of thymus and spleen in aging rhesus monkeys

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