丙戊酸促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

doi:10.12307/2023.365

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (15): 2304-2310.doi: 10.12307/2023.365

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

丙戊酸促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

凌徐玮1，2，孙杰1，2，刘畅1，2，王怡1，2，施勤1，2，杨惠林1，2

1苏州大学附属第一医院骨科，苏州大学苏州医学院，江苏省苏州市 215006；2苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2022-04-16 接受日期:2022-06-22 出版日期:2023-05-28 发布日期:2022-10-17
通讯作者: 杨惠林，主任医师，博士生导师，教授，苏州大学附属第一医院骨科，苏州大学苏州医学院，江苏省苏州市 215006；苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006
作者简介:凌徐玮，男，1993年生，江苏省苏州市人，汉族，苏州大学在读硕士，医师，主要从事骨质疏松疾病的基础与临床研究。
基金资助:
卫生厅“科教兴卫”项目-江苏省骨科临床医学中心，项目负责人：杨惠林

Valproic acid promotes osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells

Ling Xuwei1, 2, Sun Jie1, 2, Liu Chang1, 2, Wang Yi1, 2, Shi Qin1, 2, Yang Huilin1, 2

1Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou Medical College of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; 2Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2022-04-16 Accepted:2022-06-22 Online:2023-05-28 Published:2022-10-17
Contact: Yang Huilin, Chief physician, Doctoral supervisor, Professor, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou Medical College of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Ling Xuwei, Master candidate, Physician, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou Medical College of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopedics, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
Supported by:
Ministry of Health’s “Science and Education Revitalizing Health” Project-Jiangsu Provincial Orthopedic Clinical Medical Center (to YHL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
丙戊酸：是缬草中天然存在的一种短链脂肪酸，目前在临床上广泛应用于治疗癫痫、双相情感障碍、偏头痛和癫痫发作等精神类疾病。有研究发现，丙戊酸作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可通过抑制组蛋白去乙酰化酶的催化活性，提高组蛋白的乙酰化水平，从而影响基因转录，促进多种细胞类型的成骨分化。
Zeste同源物2的增强子(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)：作为一种组蛋白甲基转移酶，是多梳抑制复合物2的一个重要催化亚基，负责将组蛋白3赖氨酸27三甲基化(trimethylation of lysine 27 on histone 3，H3K27me3)，形成H3K27me3的组蛋白修饰，诱导异染色质形成，从而沉默基因的表达，抑制骨特异性基因的转录，减弱细胞的成骨能力。

背景：丙戊酸作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，具有促进细胞成骨分化的能力，但相关机制尚不明确。
目的：探讨丙戊酸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及机制。
方法：从SD大鼠中分离提取骨髓间充质干细胞，流式细胞仪进行鉴定；CCK-8检测不同浓度丙戊酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响，以确定丙戊酸的使用浓度；然后加入丙戊酸和成骨培养基对大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化，在成骨诱导培养第7天进行碱性磷酸酶染色以及第21天进行茜素红染色；成骨诱导培养第3，7天进行qRT-PCR检测成骨相关基因及EZH2的表达；成骨诱导培养第5天进行Western blot检测Runt相关转录因子2、EZH2和H3K27me3相关蛋白的表达。
结果与结论：①CCK-8细胞增殖实验显示，随着丙戊酸浓度的增加，骨髓间充质干细胞增殖受到显著抑制；②碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果显示，丙戊酸能提高细胞碱性磷酸酶的表达，增强骨矿化能力；③qRT-PCR结果显示，丙戊酸可提高成骨相关基因的表达，降低EZH2基因的表达；④Western blot结果显示，丙戊酸使Runt相关转录因子2蛋白表达增强，EZH2和H3K27me3蛋白表达下降；⑤结果表明，丙戊酸能够通过下调EZH2的表达促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。
https://orcid.org/0000-0002-7006-198X(凌徐玮)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 丙戊酸, EZH2, H3K27me3, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: Valproic acid, as a histone deacetylase inhibitor, has the ability to promote osteogenic differentiation of cells, but the mechanism is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect and mechanism of valproic acid on osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from Sprague-Dawley rats and identified by flow cytometry. CCK-8 assay was used to detect the effects of different concentrations of valproic acid on the proliferation of rat bone marrow mesenchymal stem cells, and determine the used concentration of valproic acid. After adding valproic acid, rat bone marrow mesenchymal stem cells were induced to osteogenic differentiation. Alkaline phosphatase staining was performed on day 7 of osteogenic induction culture, and alizarin red staining was performed on day 21 of osteogenic induction culture. Quantitative real-time polymerase chain reaction was used to detect the expression of osteogenesis-related genes and EZH2 on days 3 and 7 of osteogenic induction culture. The protein expression levels of Runt-related transcription factor 2, EZH2 and H3K27me3 were detected by western blot assay on day 5 of osteogenic induction culture.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CCK-8 cell proliferation assay showed that bone marrow mesenchymal stem cell proliferation was significantly inhibited by increasing the concentration of valproic acid. (2) The results of alkaline phosphatase staining and alizarin red staining showed that valproic acid could increase the expression of alkaline phosphatase and enhance the ability of bone mineralization. (3) qRT-PCR results showed that valproic acid could increase the expression of osteogenesis-related genes and decrease the expression of EZH2 gene. (4) Western blot assay results showed that valproic acid could increase the expression of Runt-related transcription factor 2 protein and decrease the expression of EZH2 and H3K27me3 protein. (5) It is concluded that valproic acid can promote osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells by down-regulating EZH2 expression.

Key words: valproic acid, EZH2, H3K27me3, bone marrow mesenchymal stem cell, osteogenic differentiation

中图分类号:

凌徐玮, 孙杰, 刘畅, 王怡, 施勤, 杨惠林. 丙戊酸促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2304-2310.

Ling Xuwei, Sun Jie, Liu Chang, Wang Yi, Shi Qin, Yang Huilin. Valproic acid promotes osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(15): 2304-2310.

图/表（结果） 6

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的流式鉴定结果图1的流式分析结果可以看到，大鼠骨髓间充质干细胞表面表达CD29、CD90的阳性率分别为100%和99.9%，表达CD34、CD45的阳性率仅为0.84%和0.70%。该流式鉴定结果表明所提取的细胞为骨髓间充质干细胞。

2.2 丙戊酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响为了研究丙戊酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响，首先使用不同浓度的丙戊酸(0.5，1，2，5 mmol/L)处理骨髓间充质干细胞，通过CCK-8实验检测骨髓间充质干细胞在第1，3，5天的增殖情况，由此来确定丙戊酸的使用浓度。图2的CCK-8结果显示，随着丙戊酸浓度的增加，骨髓间充质干细胞的增殖受到显著抑制。而在0.5，1 mmol/L浓度时，骨髓间充质干细胞增殖无显著性差异，结合先前的研究报道[31]，由此选用1 mmol/L作为丙戊酸使用浓度进行后续实验。

2.3 丙戊酸对骨髓间充质干细胞成骨能力的影响根据CCK-8实验结果，选用1 mmol/L丙戊酸对骨髓间充质干细胞进行诱导成骨分化。从碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶染色阳性区域的定量分析、茜素红染色及茜素红染色定量分析结果可以看到，与对照组相比，成骨组骨髓间充质干细胞中的碱性磷酸酶表达及活性增强，有钙结节产生，证明在加入成骨培养基后，骨髓间充质干细胞可以进行正常的成骨分化过程。在成骨培养基的基础上加入1 mmol/L丙戊酸后，骨髓间充质干细胞中的碱性磷酸酶表达显著提高，矿化能力明显增强，有更多的钙结节形成。根据染色结果及相关定量分析结果显示，丙戊酸可以提高骨髓间充质干细胞的成骨能力，见图3。

2.4 丙戊酸对骨髓间充质干细胞成骨相关基因表达的影响为了进一步从基因水平验证丙戊酸对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，在成骨诱导第3天和第7天时，提取RNA进行qRT-PCR以检测成骨相关基因的表达。qRT-PCR结果显示，丙戊酸在诱导第3天，能够促进早期成骨相关基因RUNX2和OSTERIX的表达，碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达在诱导第7天也显著提高，见图4。证明丙戊酸可以通过上调骨髓间充质干细胞成骨相关基因的表达从而促进其成骨分化。

2.5 丙戊酸对骨髓间充质干细胞成骨诱导后EZH2基因表达的影响为了进一步研究丙戊酸促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用是否与调控EZH2基因表达有关，在成骨诱导第3天和第7天时，提取RNA进行qRT-PCR以检测EZH2基因的表达情况。加入丙戊酸后，EZH2在骨髓间充质干细胞诱导成骨分化的第3天表达下降。在诱导成骨分化的第7天，EZH2的表达在丙戊酸干预下进一步下降，基因表达受到显著抑制，见图5。结果证实，丙戊酸可以通过下调EZH2的基因表达来促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。

2.6 丙戊酸对骨髓间充质干细胞成骨诱导后成骨相关蛋白及EZH2蛋白表达的影响为了进一步研究丙戊酸可以通过下调EZH2的表达来促进骨髓间充质干细胞成骨分化，在成骨诱导第5天，提取细胞蛋白进行Western blot实验以检测成骨相关蛋白RUNX2的表达，EZH2和H3K27me3的蛋白表达。根据Western blot实验的条带结果显示，在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中加入丙戊酸后，EZH2表达降低，同时导致调控于EZH2的H3K27me3水平下调，成骨相关蛋白RUNX2表达显著提高，见图6。以上结果证实，丙戊酸可以下调EZH2及H3K27me3蛋白水平的表达，提高成骨转录因子RUNX2的活性来促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。

参考文献

[1] CHENG L, LI Y, XIA Q, et al. Enamel matrix derivative (EMD) enhances the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). Bioengineered. 2021;12(1):7033-7045.
[2] ZHU Y, YE L, CAI X, et al. Icariin-Loaded Hydrogel Regulates Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation and Promotes Cartilage Repair in Osteoarthritis. Front Bioeng Biotechnol. 2022;10:755260.
[3] LIN W, CHEN Z, MO X, et al. Phactr1 negatively regulates bone mass by inhibiting osteogenesis and promoting adipogenesis of BMSCs via RhoA/ROCK2. J Mol Histol. 2022;53(1):119-131.
[4] ZHANG H, ZHANG W, BAI G, et al. Bone Morphogenetic Protein-7 (BMP-7) Promotes Neuronal Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells (BMSCs) In Vitro. Biomed Res Int. 2021;2021(3):1-9.
[5] HANG HL, XIA Q. Role of BMSCs in liver regeneration and metastasis after hepatectomy. World J Gastroenterol. 2014;20(1):126-132.
[6] SUN C, ZHANG AD, CHEN HH, et al. Magnet-targeted delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves therapeutic efficacy following hypoxic-ischemic brain injury. Neural Regen Res. 2021;16(11):2324-2329.
[7] LI YZ, LIU YJ, ZHANG W, et al. Combined treatment with valproic acid and estrogen has neuroprotective effects in ovariectomized mice with Alzheimer’s disease. Neural Regen Res. 2021;16(10):2078-2085.
[8] PITETZIS DA, SPILIOTI MG, YOVOS JG, et al. The effect of VPA on bone: From clinical studies to cell cultures-The molecular mechanisms revisited. Seizure. 2017;48:36-43.
[9] AKSHAYA N, PRASITH P, ABINAYA B, et al. Valproic acid, A Potential Inducer of Osteogenesis in Mouse Mesenchymal Stem Cells. Curr Mol Pharmacol. 2021;14(1):27-35.
[10] HAN W, GUAN W. Valproic Acid: A Promising Therapeutic Agent in Glioma Treatment. Front Oncol. 2021;11:687362.
[11] KITAZOE KI, ABE M, HIASA M, et al. Valproic acid exerts anti-tumor as well as anti-angiogenic effects on myeloma. Int J Hematol. 2009; 89(1):45-57.
[12] SURAWEERA A, O’BYRNE KJ, RICHARD DJ. Combination Therapy With Histone Deacetylase Inhibitors (HDACi) for the Treatment of Cancer: Achieving the Full Therapeutic Potential of HDACi. Front Oncol. 2018; 8:92.
[13] HUYNH NC, EVERTS V, AMPORNARAMVETH RS. Histone deacetylases and their roles in mineralized tissue regeneration. Bone Rep. 2017;7: 33-40.
[14] CHO HH, PARK HT, KIM YJ, et al. Induction of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells by histone deacetylase inhibitors. J Cell Biochem. 2005;96(3):533-542.
[15] CHA H, LEE J, PARK HH, et al. Direct Conversion of Human Fibroblasts into Osteoblasts Triggered by Histone Deacetylase Inhibitor Valproic Acid. Applied Sciences. 2020;10(20):7372.
[16] PAINO F, LA NOCE M, TIRINO V, et al. Histone deacetylase inhibition with valproic acid downregulates osteocalcin gene expression in human dental pulp stem cells and osteoblasts: evidence for HDAC2 involvement. Stem Cells. 2014;32(1):279-289.
[17] YU Y, OH SY, KIM HY, et al. Valproic Acid-Induced CCN1 Promotes Osteogenic Differentiation by Increasing CCN1 Protein Stability through HDAC1 Inhibition in Tonsil-Derived Mesenchymal Stem Cells. Cells. 2022;11(3):534.
[18] ZHOU D, CHEN YX, YIN JH, et al. Valproic acid prevents glucocorticoidinduced osteonecrosis of the femoral head of rats. Int J Mol Med. 2018;41(6):3433-3447.
[19] HUANG J, GOU H, YAO J, et al. The noncanonical role of EZH2 in cancer. Cancer Sci. 2021;112(4):1376-1382.
[20] PAPPAS K, MARTIN TC, WOLFE AL, et al. NOTCH and EZH2 collaborate to repress PTEN expression in breast cancer. Commun Biol. 2021;4(1): 312.
[21] SAWICKA-GUTAJ N, SHAWKAT S, ANDRUSIEWICZ M, et al. EZH2 and SMYD3 expression in papillary thyroid cancer. Oncol Lett. 2021;21(5): 342.
[22] XIN L. EZH2 accompanies prostate cancer progression. Nat Cell Biol. 2021;23(9):934-936.
[23] LI C, SONG J, GUO Z, et al. EZH2 Inhibitors Suppress Colorectal Cancer by Regulating Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Front Immunol. 2022;13:857808.
[24] GUI T, LIU M, YAO B, et al. TCF3 is epigenetically silenced by EZH2 and DNMT3B and functions as a tumor suppressor in endometrial cancer. Cell Death Differ. 2021;28(12):3316-3328.
[25] DUDAKOVIC A, CAMILLERI ET, PARADISE CR, et al. Enhancer of zeste homolog 2 (Ezh2) controls bone formation and cell cycle progression during osteogenesis in mice. J Biol Chem. 2018;293(33):12894-12907.
[26] CHEN L, WU Y, WU Y, et al. The inhibition of EZH2 ameliorates osteoarthritis development through the Wnt/beta-catenin pathway. Sci Rep. 2016;6:29176.
[27] JING H, LIAO L, AN Y, et al. Suppression of EZH2 Prevents the Shift of Osteoporotic MSC Fate to Adipocyte and Enhances Bone Formation During Osteoporosis. Mol Ther. 2016;24(2):217-229.
[28] GALVAN ML, PARADISE CR, KUBROVA E, et al. Multiple pharmacological inhibitors targeting the epigenetic suppressor enhancer of zeste homolog 2 (Ezh2) accelerate osteoblast differentiation. Bone. 2021; 150:115993.
[29] DEDONI S, MARRAS L, OLIANAS MC, et al. Downregulation of TrkB Expression and Signaling by Valproic Acid and Other Histone Deacetylase Inhibitors. J Pharmacol Exp Ther. 2019;370(3):490-503.
[30] SAJADPOOR Z, AMINI-FARSANI Z, TEIMORI H, et al. Valproic Acid Promotes Apoptosis and Cisplatin Sensitivity Through Downregulation of H19 Noncoding RNA in Ovarian A2780 Cells. Appl Biochem Biotechnol. 2018;185(4):1132-1144.
[31] FU Y, ZHANG P, GE J, et al. Histone deacetylase 8 suppresses osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells by inhibiting histone H3K9 acetylation and RUNX2 activity. Int J Biochem Cell Biol. 2014;54:68-77.
[32] YI SJ, LEE H, LEE J, et al. Bone Remodeling: Histone Modifications as Fate Determinants of Bone Cell Differentiation. Int J Mol Sci. 2019; 20(13):3147.
[33] ICARDI L, DE BOSSCHER K, TAVERNIER J. The HAT/HDAC interplay: multilevel control of STAT signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 2012; 23(6):283-291.
[34] VISHAL M, AJEETHA R, KEERTHANA R, et al. Regulation of Runx2 by Histone Deacetylases in Bone. Curr Protein Pept Sci. 2016;17(4):343-351.
[35] HSIEH TH, HSU CY, TSAI CF, et al. HDAC inhibitors target HDAC5, upregulate microRNA-125a-5p, and induce apoptosis in breast cancer cells. Mol Ther. 2015;23(4):656-666.
[36] PEREZ-CAMPO FM, SANTURTUN A, GARCIA-IBARBIA C, et al. Osterix and RUNX2 are Transcriptional Regulators of Sclerostin in Human Bone. Calcif Tissue Int. 2016;99(3):302-309.
[37] HEMMING S, CAKOUROS D, ISENMANN S, et al. EZH2 and KDM6A act as an epigenetic switch to regulate mesenchymal stem cell lineage specification. Stem Cells. 2014;32(3):802-815.
[38] SEN B, PARADISE CR, XIE Z, et al. beta-Catenin Preserves the Stem State of Murine Bone Marrow Stromal Cells Through Activation of EZH2. J Bone Miner Res. 2020;35(6):1149-1162.
[39] DUDAKOVIC A, CAMILLERI ET, RIESTER SM, et al. Enhancer of Zeste Homolog 2 Inhibition Stimulates Bone Formation and Mitigates Bone Loss Caused by Ovariectomy in Skeletally Mature Mice. J Biol Chem. 2016;291(47):24594-24606.
[40] ZHU L, XU PC. Downregulated LncRNA-ANCR promotes osteoblast differentiation by targeting EZH2 and regulating Runx2 expression. Biochem Biophys Res Commun. 2013;432(4):612-617.

引言

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一类来源于中胚层的多能干细胞，具有来源广泛、获取简单、增殖能力强及低免疫原性等特点，同时又具有自我更新和多向分化潜能，在一定条件下可定向分化为成骨细胞[1]、软骨细胞[2]、脂肪细胞[3]、神经细胞和肝细胞等[4-6]，现已成为组织工程研究领域重要的种子细胞。骨髓间充质干细胞是成骨前体细胞的主要来源，其分化为成骨细胞在骨骼发育和骨形成过程中起着重要的作用。目前骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞的诱导条件及相关调控作用机制受到了越来越多研究者的关注，已成为国内外研究的热点。
丙戊酸是缬草中天然存在的一种短链脂肪酸[7]，于1963年由法国学者MEUNIER等在实验动物中偶然发现具有抗癫痫的作用，次年CARRAZ等进行了第一次人体研究，验证了丙戊酸的抗癫痫特性[8]。丙戊酸目前在临床上广泛应用于治疗癫痫、双相情感障碍、偏头痛和癫痫发作等精神类疾病[9]，近年来也被探索作为一种辅助抗癌剂用于治疗多种血液系统恶性肿瘤及实体肿瘤[10-12]。研究发现，丙戊酸作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)，可以通过抑制组蛋白去乙酰化酶的催化活性，提高组蛋白的乙酰化水平从而影响基因转录，在细胞基因表达的表观遗传调控中发挥重要作用[13]。有研究表明，丙戊酸可以通过抑制组蛋白去乙酰化酶，增强间充质干细胞及成纤维细胞的成骨分化能力[14-15]。牙髓干细胞经丙戊酸处理后，可以促进骨桥蛋白及骨唾液蛋白的表达，显著改善矿化基质的形成[16]。丙戊酸可通过抑制组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)，增强CCN1蛋白的稳定性，从而促进扁桃体来源间充质干细胞的成骨分化[17]。有学者发现，丙戊酸可减轻糖皮质激素对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的不良影响，预防因糖皮质激素所引起的大鼠股骨头坏死[18]。丙戊酸对细胞的成骨分化具有积极的作用，但具体的作用机制还尚不清楚。
Zeste同源物2的增强子(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)作为一种组蛋白甲基转移酶，是多梳抑制复合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)的一个重要催化亚基，负责将组蛋白3赖氨酸27三甲基化(trimethylation of lysine 27 on histone 3，H3K27me3)，形成H3K27me3的组蛋白修饰，诱导异染色质形成，从而沉默基因的表达。越来越多的学者证实，EZH2可以在转录水平上抑制下游抑癌基因的表达，从而促进癌细胞增殖，减少癌细胞凋亡，在恶性肿瘤发生进展中起着重要的作用[19]，包括乳腺癌[20]、甲状腺癌[21]、前列腺癌[22]、结直肠癌和子宫内膜癌等[23-24]。研究报道，在骨髓间充质干细胞中抑制EZH2酶活性和下调EZH2的表达，减少H3K27me3，能提高成骨相关基因的表达，从而在体外刺激细胞成骨分化、抑制成脂分化，并在体内促进骨形成和防止雌激素缺乏诱导的骨丢失[25]。下调EZH2基因可通过Wnt/β-catenin途径改善骨关节炎的发展，并促进间充质干细胞成骨[26]。EZH2的抑制可阻止骨质疏松症来源间充质干细胞向脂肪细胞分化并促进骨质疏松症小鼠的骨形成[27]。有研究表明，抑制EZH2而产生的促成骨作用是通过激活成骨转录基因(如RUNX2，OSTERIX)，上调配体(如Wnt10b)、受体(如Pth1r)和翻译后修饰(如Smad1/5磷酸化)刺激成骨通路来实现的[28]。这些发现共同证实了EZH2在成骨分化及骨形成中的关键作用，成为调节间充质干细胞成骨分化的一个新靶点。
根据现有的研究报道，丙戊酸可以通过下调EZH2的表达，在神经系统疾病及肿瘤治疗中发挥积极的作用[29-30]，提示丙戊酸可通过调控EZH2参与多种生理病理过程。作者推测，丙戊酸也可通过下调EZH2的表达从而发挥其促进细胞成骨分化的作用。鉴于此，该实验旨在探讨丙戊酸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及其与EZH2表达的相关性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验，多组间比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)。
1.2 时间及地点实验于2020年12月至2022年1月在苏州大学骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验主要试剂丙戊酸(美国Sigma-Aldrich公司)；α-MEM培养基(美国Hyclone公司)；胎牛血清(苏州东岭生物技术有限公司)；0.25%胰蛋白酶(苏州新赛美生物科技有限公司)；青霉素-链霉素双抗(上海碧云天生物技术有限公司)；流式抗体CD29(PE)、CD34(FITC)、CD45(Alexa Fluor 647)、CD90(PE-Cy7)(美国Biolegend公司)；β-甘油磷酸钠、L-抗坏血酸-2-磷酸酯、地塞米松(美国Sigma-Aldrich公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)(北京索莱宝科技有限公司)；40 g/L多聚甲醛(中国Biosharp公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒、茜素红染色液(上海碧云天生物技术有限公司)；Trizol裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；PCR引物(生工生物工程有限公司)；RIPA裂解液、增强型BCA蛋白测定试剂盒、电泳液、转膜液和洗涤液(上海碧云天生物技术有限公司)；PAGE凝胶快速制备试剂盒(中国雅酶生物医药科技有限公司)；RUNX2抗体、EZH2抗体、H3K27me3抗体(美国Abcam公司)。
1.3.2 实验动物 6周龄雌性SD大鼠10只，体质量约为170 g，由苏州大学动物中心统一订购，许可证号：SYXK(苏)2017-0043，饲养于苏州大学SPF级动物房，恒温20-26 ℃，湿度40%-70%，每天交替进行12 h光照、12 h黑暗。
实验方案经苏州大学动物实验伦理委员会批准，批准号为SUDA20210323A03。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的提取及体外培养将6周龄的雌性SD大鼠深度麻醉处死后，使用无菌器械分离大鼠双侧股骨与胫骨。用无菌注射器吸取含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基对股骨及胫骨的骨髓腔反复冲洗，获得骨髓全细胞，收集至离心管中，1 200 r/min离心5 min，弃上清后重悬，转移至培养皿中，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。培养3 d后更换新鲜α-MEM培养基，去除未贴壁细胞，培养第7天时观察到培养皿中细胞融合至90%左右进行细胞传代培养。培养皿中的细胞用PBS清洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶消化90 s，加入新鲜α-MEM培养基终止消化，按1∶3比例进行传代，培养至第3代用于后续实验。

1.4.2 流式鉴定观察培养皿中的第3代细胞生长达到约90%汇合，用胰蛋白酶消化后离心；弃去上清液，将2×105个细胞重悬于100 μL含体积分数为2%胎牛血清的PBS中，并与针对大鼠的CD29(PE，0.2 μL)、CD34(FITC，0.2 μL)、CD45(Alexa Fluor 647，0.2 μL)、CD90(PE-Cy7，0.2 μL)抗体一起孵育，4 ℃避光孵育30 min；PBS洗涤后，加入500 μL含体积分数为2%胎牛血清的PBS重悬；上流式细胞仪检测，并用FlowJo 7.6 软件分析数据。
1.4.3 细胞增殖实验将第3代骨髓间充质干细胞以2×103/孔的密度接种于96孔板，使用CCK-8试剂盒检测加入不同浓度(0.5，1，2，5 mmol/L)丙戊酸后，细胞在第1，3，5天的增殖活力。在第1，3，5天同一时间点将孔板取出，去除培养基，PBS洗涤2次，每孔加入100 μL含10% CCK-8工作液的培养基，在培养箱中避光孵育2 h；孵育结束后，将反应完的培养基转移到新的96孔板中，用全波长酶标仪在450 nm波长处测定其吸光度值。
1.4.4 实验分组及细胞成骨诱导
实验分组：①α-MEM培养基培养组(对照组)；②成骨培养基培养组(成骨组)；③成骨培养基+1 mmol/L 丙戊酸培养组(成骨+丙戊酸组)。
配制成骨培养基：在50 mL含体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的α-MEM培养基中依次加入β-甘油磷酸钠、L-抗坏血酸-2-磷酸酯和地塞米松(终浓度为10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸酯和0.1 μmol/L地塞米松)，得到骨髓间充质干细胞的成骨诱导培养基。
成骨诱导：将第3代骨髓间充质干细胞以2×104/孔的密度接种在24孔板中，以1×105/孔的密度接种在6孔板中，各组加入相应培养基进行培养，每隔3 d换液1次。
1.4.5 碱性磷酸酶染色成骨诱导培养第7天，从培养箱中取出24孔板，弃去旧培养基，加入PBS清洗3次；每孔加入适量40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，弃去固定液，PBS洗涤3次；根据试剂盒说明书，配制BCIP/NBT染色工作液：碱性磷酸酯酶显色缓冲液3 mL、BCIP溶液(300X)10 μL、NBT溶液(150X)20 μL，每孔加入适量染色工作液，室温下避光孵育30 min；将染色液去除，加入PBS终止染色并洗涤3次后，于倒置荧光显微镜下拍照。
1.4.6 茜素红染色成骨诱导培养第21天，从培养箱中取出24孔板，小心吸除旧培养基，沿孔壁缓慢加入PBS清洗3次；每孔加入适量40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，弃去固定液，PBS洗涤3次；每孔从孔壁边缘处缓慢加入500 μL茜素红染色工作液，室温下避光孵育30 min；弃去染色液，加入PBS终止染色并洗涤3遍，尽量去除多余的染液底色，于倒置荧光显微镜下拍照。拍照完毕后，每孔加入5%高氯酸500 μL，室温避光孵育30 min，然后转移至96孔板中，在490 nm波长处测定吸光度值。

1.4.7 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 成骨诱导培养第3天及第7天时，从培养箱中取出6孔板，弃去培养基，PBS洗涤2次后每孔加入1 mL Trizol，充分裂解后转移至1.5 mL EP管中；加入200 μL氯仿，上下充分振荡混匀后高速离心；离心后吸取上层的透明水相至新的EP管中，加入500 μL异丙醇，振荡混匀后离心，可见RNA沉于管底；加入1 mL体积分数为75%乙醇，轻轻吹打EP管底部使RNA沉淀漂起，离心；按照上述步骤再次清洗1次，离心后弃上清；在室温条件下晾干，加入适量提前预热的DEPC水进行溶解，然后对RNA浓度进行测定。使用反转录试剂盒将RNA反转录成 cDNA，再将cDNA作为模板，进行qRT-PCR检测Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)、成骨特异转录因子(OSTERIX)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)和骨形态发生蛋白2(bone morphogenic protein-2，BMP-2)等成骨相关基因的表达，引物序列见表1。

1.4.8 Western blot检测成骨诱导第5天，从培养箱中取出6孔板，使用RIPA裂解液提取各组细胞蛋白，通过BCA试剂盒测定蛋白浓度；按照PAGE凝胶快速制备试剂盒说明书制胶；制胶完毕后每孔加入相同质量的蛋白样品，先60 V电压电泳15 min再160 V电压电泳1 h；接着300 mA电流转膜1 h，封闭1 h，使用RUNX2、EZH2、H3K27me3和β-actin一抗孵育过夜，二抗孵育1 h后洗涤曝光。
1.5 主要观察指标 ①丙戊酸对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响；②丙戊酸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力的影响；③丙戊酸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨相关基因及蛋白的影响；④丙戊酸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中EZH2表达的影响。
1.6 统计学分析采用 GraphPad Prism 9软件进行统计学分析，实验结果以x±s表示，多组间比较用单因素方差分析(One Way ANOVA)，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过苏州大学附属第一医院生物统计学专家审核。

讨论

骨髓间充质干细胞是一种来源于骨髓的多能干细胞，具有分化成多种细胞类型的能力，在临床中具有广阔的应用前景，特别是在组织修复和骨再生方面。其中，骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞在骨生成过程中发挥着关键作用。该实验首先对从大鼠胫骨和股骨骨髓腔中分离提取出的细胞进行流式鉴定，结果显示CD29和CD90阳性高表达，CD34和CD45阴性表达。该流式结果证明分离提取及培养的细胞为骨髓间充质干细胞，且纯度较高。
组蛋白修饰作为一种典型的表观遗传现象，在间充质干细胞向特定谱系分化的诱导中发挥了重要作用[32]。其中，组蛋白乙酰化是一个可逆的表观遗传过程，受组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶这2种酶的精确调控。组蛋白乙酰化酶负责组蛋白的乙酰化，有助于染色质结构的松弛，允许DNA序列与转录因子结合，从而激活转录及下游的基因表达。与之相反，组蛋白去乙酰化酶使组蛋白去乙酰化，导致转录沉默，抵消组蛋白乙酰化酶的作用[33]。成骨细胞的分化受多种转录因子控制，如RUNX2和OSTERIX。有证据表明，一些组蛋白去乙酰化酶通过调节组蛋白乙酰化或与成骨细胞分化的主转录因子RUNX2相互作用，在成骨细胞分化中发挥抑制作用[34]。组蛋白去乙酰化酶在成骨细胞分化过程中的调控作用日益被人们所认识。
丙戊酸作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可以逆转组蛋白去乙酰化酶介导的转录抑制，进而影响细胞分化和细胞凋亡等多种细胞功能。据报道，一些组蛋白乙酰化酶抑制剂可导致多种细胞的凋亡和死亡，并可诱导一些正常细胞的生长停止[35]。该研究通过梯度浓度的丙戊酸作用于骨髓间充质干细胞，使用CCK-8检测第1，3，5天时细胞的增殖情况，观察丙戊酸对骨髓间充质干细胞增殖的影响，结果表明，随着丙戊酸处理浓度的升高，其抑制细胞增殖的作用明显加强，考虑与其诱导细胞凋亡的作用有关。
碱性磷酸酶染色可以鉴定早期骨髓间充质干细胞的成骨能力，茜素红染色能够检测晚期成骨细胞的矿化结节含量。该研究在成骨诱导第7天进行的碱性磷酸酶染色及成骨诱导第21天进行的茜素红染色结果显示，丙戊酸在骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中，可使碱性磷酸酶的表达提高，骨矿化的能力增强，提示丙戊酸可以提高骨髓间充质干细胞的成骨能力。RUNX2和OSTERIX被认为是成骨细胞分化所必需的特异性转录因子[36]，对骨形成具有重要作用。RUNX2可引导骨髓间充质干细胞向成骨细胞系分化，阻止骨髓间充质干细胞向脂肪细胞系和软骨细胞系分化。qRT-PCR实验结果证实，丙戊酸可以在骨髓间充质干细胞的成骨分化早期增强RUNX2和OSTERIX的基因表达。随着诱导成骨分化过程的进行，也可提高碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2等成骨相关基因的表达，促进成骨细胞的成熟和矿化细胞外基质的沉积，结果表明，丙戊酸可以通过提高成骨相关基因的表达来促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，其作用考虑与组蛋白去乙酰化酶活性被抑制后，导致染色质重塑，从而激活多种成骨相关基因的转录有关。
EZH2作为一种重要的表观遗传调控因子，通过增加产生转录沉默异染色质的H3K27me3标记，抑制骨特异性基因的转录，从而减弱细胞的成骨能力。据报道，EZH2是调节间充质干细胞谱系特异性分化的表观遗传开关[37]。已有证据表明，抑制EZH2而改变的表观遗传修饰可导致关键成骨基因的上调，增强已建立的骨刺激通路(如Wnt、Pth和BMP信号通路)的活性[38]，促进成骨细胞的旁分泌信号传导。以EZH2为靶点的抑制剂可以刺激骨形成并且减轻骨骼成熟小鼠卵巢切除引起的骨丢失[39]。由此推测，丙戊酸可以通过下调EZH2的表达，从而促进细胞的成骨分化。qRT-PCR实验结果表明，丙戊酸在骨髓间充质干细胞的成骨分化早期可以抑制EZH2的基因表达，且随着成骨分化过程的进行，这种下调作用持续存在。有研究表明，成骨细胞相关标志物的基因表达受EZH2的表观遗传学控制，染色质免疫沉淀(ChIP)分析显示，细胞成骨分化过程中，在关键的成骨转录因子RUNX2的转录起始位点上，EZH2及其H3K27me3相关修饰的存在减少[40]。Western blot实验结果进一步证实了作者的推测，丙戊酸在骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中可以降低EZH2的蛋白水平，减少H3K27me3，上调成骨关键转录因子RUNX2蛋白的表达，发挥其促进成骨分化的作用。
根据该实验结果可以证实，丙戊酸能够通过下调EZH2的表达进而促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。然而丙戊酸与EZH2之间是通过何种作用机制进行调控的尚不清楚，这将是下一步研究工作的重点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

丙戊酸促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

Valproic acid promotes osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	党祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹金, 熊山, 张顶梅, 王信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[2]	杨芷姗, 唐正龙. Hippo信号通路中的核心因子YAP/TAZ参与骨形成的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1264-1271.
[3]	李欣悦, 李熙恒, 毛天娇, 唐亮, 李江. 三维培养人牙周膜干细胞的形态、活性及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 846-852.
[4]	李启程, 邓进, 付小洋, 韩娜. 骨髓间充质干细胞来源外泌体对成肌细胞缺氧状态的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 853-859.
[5]	王敏, 尹秀山, 王盈熹, 张妍, 赵龙, 夏书月. 吸入骨髓间充质干细胞来源外泌体减轻慢性阻塞性肺疾病的炎性损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 827-834.
[6]	袁维, 刘静东, 徐广辉, 康健, 李富平, 王英杰, 支中正, 李冠武. 人血管周围干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的调控[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 866-871.
[7]	刘文涛, 冯兴超, 杨毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.
[8]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[9]	代香林, 张文凤, 姚喜军, 商佳琪, 黄秋瑾, 任怡帆, 邓久鹏. 钛酸钡/聚乳酸复合压电薄膜材料对MC3T3-E1细胞黏附、增殖和成骨分化能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 367-373.
[10]	李睿, 刘珍, 郭子歌, 卢瑞杰, 王晨. 纯钛表面载阿司匹林微球与聚多巴胺复合涂层促进成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 374-379.
[11]	文虹杰, 陈仲, 杨华刚, 徐永清. 骨髓炎状态下成骨诱导大鼠骨髓间充质干细胞转录组的测序分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2333-2338.
[12]	贺自克, 王上增. 杜仲水提物上调Nur77表达促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2371-2378.
[13]	杨均, 李澎. 转化生长因子β诱导骨髓间充质干细胞分化为半月板纤维软骨细胞[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2412-2419.
[14]	朱灿, 何家恒, 陈迟迟, 刘波, 罗宗平, 孙杰, 施勤. 绿原酸促进成骨前体细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(14): 2170-2175.
[15]	凌华军, 崔瑞文, 王其友. 负载外泌体的3D明胶细胞外基质水凝胶促进皮肤损伤愈合[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(12): 1900-1905.