杜仲水提物上调Nur77表达促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化

doi:10.12307/2023.382

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (15): 2371-2378.doi: 10.12307/2023.382

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杜仲水提物上调Nur77表达促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化

贺自克，王上增

河南省中医院骨关节科，河南省郑州市 450000

收稿日期:2022-04-06 接受日期:2022-07-07 出版日期:2023-05-28 发布日期:2022-10-18
通讯作者: 王上增，主任医师，硕士生导师，河南省中医院骨关节科，河南省郑州市 450000
作者简介:贺自克，男，1985年生，河南省郑州市人，汉族，2011年河南中医药大学毕业，硕士，主治医师，主要从事骨关节疾病的相关研究。

Eucommia ulmoides Oliver aqueous extract promotes bone marrow mesenchymal stem cell proliferation and osteoblastic differentiation through upregulating Nur77 protein expression

He Zike, Wang Shangzeng

Department of Osteoarthritis, Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Received:2022-04-06 Accepted:2022-07-07 Online:2023-05-28 Published:2022-10-18
Contact: Wang Shangzeng, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Osteoarthritis, Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
About author:He Zike, Master, Attending physician, Department of Osteoarthritis, Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Nur77：Nur77为孤儿核受体，在人体各组织器官均有表达，其功能紊乱将导致癌症、肥胖、糖尿病、心血管病等。研究显示，Nur77不仅可以作为转录因子调控基因表达，还可作为功能调节蛋白，通过相互作用和蛋白修饰等途径发挥作用。
骨髓间充质干细胞成骨分化：骨髓间充质干细胞具有多项分化的潜能，在一定诱导条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、心肌细胞等。近年来，使用中药制剂诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化来防治骨质疏松症受到广泛的关注，成为临床研究和实验研究的热点之一。传统补肾中药杜仲提取物或其含药血清可以作为骨髓间充质干细胞成骨分化的诱导剂，其发挥作用的机制涉及多种信号通路。

背景：骨髓间充质干细胞作为成骨细胞的前体细胞，探索其分化机制对于预防和治疗骨质疏松症具有重大意义。杜仲能够诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，但是杜仲对骨髓间充质干细胞增殖、分化以及Nur77/MDM2/p53通路的影响尚不明确。
目的：探究杜仲水提物对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响并探讨其作用机制。
方法：杜仲水提物处理人源和鼠源骨髓间充质干细胞，采用CCK-8法和Annexin V-FITC/PI法分别检测细胞增殖和凋亡情况，Western blot检测增殖、凋亡相关蛋白的表达，Nur77及其下游MDM2、p53相关蛋白的表达及泛素化前后的蛋白水平。成脂、成骨定向诱导分化后，Western blot检测脂肪细胞和成骨细胞的标志蛋白表达来评估其分化程度。转染Nur77 siRNA进入10 mg/mL杜仲水提物处理的骨髓间充质干细胞，检测细胞增殖、凋亡和分化情况。最后，敲低Nur77之后，使用p53抑制剂Pifithrin-α处理骨髓间充质干细胞，检测细胞增殖、凋亡和分化情况以明确其作用机制。
结果与结论：①杜仲水提物可促进2种骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，抑制凋亡和成脂分化；②杜仲水提物可上调Nur77、MDM2蛋白表达，促进p53蛋白泛素化；敲低Nur77基因则抑制MDM2蛋白表达及p53蛋白泛素化，促进p53蛋白表达，抑制2种骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化；③p53抑制剂可逆转Nur77 siRNA的作用，促进2种骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，抑制凋亡和成脂分化；④结果表明，杜仲水提物可以通过Nur77/MDM2/p53途径促进2种骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，为杜仲在骨相关疾病方面的研究提供理论参考。

https://orcid.org/0000-0003-4159-4848 (王上增)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓间充质干细胞, 杜仲, 水提物, 成骨分化, Nur77, MDM2, p53, 通路, 泛素化

Abstract: BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells are precursor cells of osteoblasts. Exploring its differentiation mechanism is of great significance for guiding the prevention and treatment of osteoporosis. Eucommia ulmoides Oliver can induce the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. However, it is unclear about the effects of Eucommia ulmoides Oliver on proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and Nur77/MDM2/p53 pathway.
OBJECTIVE: To investigate the effect and mechanism of Eucommia ulmoides Oliver aqueous extract on bone marrow mesenchymal stem cell proliferation and differentiation.
METHODS: The aqueous extract from Eucommia ulmoides Oliver bark was used to treat human and mouse bone marrow mesenchymal stem cells. The CCK-8 assay and Annexin V-FITC/PI assay were used to detect the proliferation and apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells. The expression of proliferation and apoptosis related proteins and the expression of Nur77 and its downstream MDM2, p53 pathway related proteins and the ubiquitination of p53 protein were detected by western blot assay. After directed induction of adipogenic and osteogenic differentiation, the degree of differentiation was evaluated by detecting the expression of adipocytes and osteoblasts marker proteins using western blot assay. Nur77 small interfering RNA (siRNA) was transfected into bone marrow mesenchymal stem cells treated with 10 mg/mL Eucommia ulmoides Oliver aqueous extract. Cell proliferation, apoptosis and differentiation were detected. Finally, after knocking down Nur77, bone marrow mesenchymal stem cells were treated with p53 inhibitor (Pifithrin-α), and the changes of cell proliferation, apoptosis and differentiation were detected to clarify the mechanism.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The Eucommia ulmoides Oliver aqueous extract promoted the proliferation and osteoblastic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, inhibited cell apoptosis and adipogenic differentiation. (2) Eucommia ulmoides Oliver aqueous extract upregulated Nur77 and MDM2 protein expression and promoted p53 ubiquitination. Knockdown of Nur77 inhibited MDM2 protein expression and p53 protein ubiquitination, promoted p53 protein expression, and further inhibited bone marrow mesenchymal stem cell proliferation and osteogenic differentiation. (3) Pifithrin-α reversed the effects of Nur77 siRNA, promoted bone marrow mesenchymal stem cell proliferation and osteoblastic differentiation, and inhibited cell apoptosis and adipogenic differentiation. (4) It is concluded that the Eucommia ulmoides Oliver aqueous extract promotes bone marrow mesenchymal stem cell proliferation and osteoblastic differentiation via the Nur77/MDM2/p53 pathway, which provides a theoretical reference for the research of Eucommia ulmoides Oliver in bone-related disease.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cell, Eucommia ulmoides Oliver, aqueous extract, osteoblastic differentiation, Nur77, MDM2, p53, pathway, ubiquitination

中图分类号:

贺自克, 王上增. 杜仲水提物上调Nur77表达促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(15): 2371-2378.

He Zike, Wang Shangzeng. Eucommia ulmoides Oliver aqueous extract promotes bone marrow mesenchymal stem cell proliferation and osteoblastic differentiation through upregulating Nur77 protein expression[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(15): 2371-2378.

图/表（结果） 5

2.1 骨髓间充质干细胞表型鉴定结果用流式细胞仪检测细胞免疫表型，在人骨髓间充质干细胞中高表达CD44、CD29，阳性率分别达到98.8%，98.5%，低表达CD34、CD45，阳性率分别达到0.8%，0.6%，在大鼠骨髓间充质干细胞中高表达CD90、CD44，阳性率分别达到99.1%，98.9%，低表达CD45、CD11b，阳性率分别达到0.3%，0.5%，见图1。

2.2 杜仲水提物促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化通过CCK-8法和Annexin V-FITC/PI法检测杜仲水提物对成骨诱导的骨髓间充质干细胞增殖、凋亡的影响，碱性磷酸酶活性分析杜仲水提物对成骨诱导的骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性的影响，茜素红染色检测杜仲水提物对成骨诱导的骨髓间充质干细胞矿化的影响。结果表明，杜仲水提物能够促进细胞增殖(P < 0.05)，抑制细胞凋亡(P < 0.05)，增强成骨诱导的骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性(P < 0.05，P < 0.01)，增强成骨诱导的骨髓间充质干细胞的矿化活性(P < 0.01，P < 0.01)，上调细胞中增殖标记蛋白cyclinD的表达，抑制凋亡效应蛋白cleaved caspase3的表达(P < 0.05)。此外，杜仲水提物在定向诱导分化中促进成骨分化标记蛋白Runx2、ALP和Osteocalcin的表达(P < 0.05)，抑制成脂分化标记蛋白PPARG、LPL和PLIN1的表达(P < 0.05)，见图2。

2.3 杜仲水提物促进Nur77蛋白表达，增强p53蛋白的泛素化 Western blot显示杜仲水提物能够上调Nur77表达，促进下游MDM2蛋白表达(P < 0.01)，增强p53蛋白泛素化从而促进p53蛋白降解(P < 0.01)。转染Nur77 siRNA有效抑制Nur77蛋白表达，从而抑制下游MDM2表达(P < 0.01)，抑制p53蛋白泛素化，促进p53蛋白表达(P < 0.05)，见图3。

2.4 敲低Nur77蛋白表达抑制细胞增殖和成骨分化敲低Nur77后抑制人骨髓间充质干细胞或大鼠骨髓间充质干细胞增殖(P < 0.05)，促进细胞凋亡(P < 0.05)。定向诱导分化结果显示敲低 Nur77后能够抑制成骨分化(P < 0.05)，而促进骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化(P < 0.05)，见图4。

2.5 敲低Nur77蛋白表达后抑制p53蛋白表达促进细胞增殖和成骨分化转染Nur77 siRNA后用p53抑制剂pifithrin-α处理细胞，结果表明pifithrin-α能够逆转Nur77 siRNA的作用，促进细胞增殖(P < 0.05)，抑制细胞凋亡(P < 0.05)。Western blot结果进一步证明以上作用(P < 0.01)。成骨分化和成脂分化标记蛋白的检测结果显示，Pifithrin-α逆转Nur77 siRNA在细胞分化中所发挥的作用，促进成骨分化，抑制成脂分化(P < 0.05)，见图5。

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞分子生物学实验。使用Shapiro-Wilk检验和Levene检验评估数据分布的正态性和方差同质性。根据数据的正态分布和方差的同质性，采用Student t检验评估两组间的显著性。
1.2 时间及地点实验于2021年3-9月在河南中医药大学中药药理实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 主要试剂 Lipofectamine 3000转染试剂、培养基、青霉素和链霉素均购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂盒购自大连宝生物公司；ES级胎牛血清购自美国Gibco公司；人骨髓间充质干细胞生长添加剂购自美国R&D公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒购自美国SIGMA公司；Nur77小干扰RNA(siRNA
Nur77)、阴性对照(scramble)由大连宝生物公司设计合成；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific
公司；p53抑制剂(pifithrin-α)购自美国Sigma公司；CD29-PE抗体、CD34-PE抗体、CD44-FITC抗体、CD45-FITC抗体、CD90-PE抗体、CD11b-PE抗体购自英国Abcam公司；cyclin D抗体、cleaved caspase3抗体，Runx2抗体、ALP抗体、Osteocalcin
抗体，PPARG抗体、LPL抗体、PLIN1抗体，Nur77抗体、MDM2抗体，p53抗体、ubiquitin-p53抗体购自英国Abcam公司；碱性磷酸酶活性比色法测定试剂盒购自德国Biovision公司；茜素红染料购自美国Sigma公司。
1.3.2 主要仪器凝胶成像仪购自英国Uvitec Cambridge公司；Axio Vert A1倒置荧光显微镜购自ZEISS公司；BD FACS Calibur 流式细胞仪购自美国BD Bioscience公司；DYY II 型电泳仪购自北京六一仪器厂；蛋白电泳仪及配套电泳槽购自美国BioRad公司；Synergy H1全功能酶标仪购自美国Biotek公司；显微镜购自日本Olympus公司。
1.4 实验方法
1.4.1 杜仲水提物的制备杜仲树皮采购于四川省古蔺县，经研磨机制成粉末后过60目筛网，称取杜仲皮粉末40 g
加入1 000 mL蒸馏水煮沸4 h，经300目尼龙滤网过滤后将滤液浓缩至100 mL，得到杜仲水提物。
1.4.2 细胞培养人骨髓间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞购自北京北纳细胞库。人骨髓间充质干细胞培养基配方如下(500 mL)：DMEM培养基465 mL，ES级胎牛血清25 mL，人骨髓间充质干细胞生长添加剂5 mL，青霉素/链霉素溶液5 mL；大鼠骨髓间充质干细胞培养基配方如下(500 mL)：
含GlutaMAXTM-I的α-MEM培养基445 mL，胎牛血清50 mL，
青霉素/链霉素溶液5 mL。将细胞置于体积分数为95%空气，体积分数为5% CO2，37 ℃恒温培养箱培养。
1.4.3 骨髓间充质干细胞表面标志物鉴定取培养至第3代的人骨髓间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞，用0.25%胰蛋白酶(含0.02%乙二胺四乙酸)消化，PBS洗涤2遍后制成1×109 L-1单细胞悬液，对于人骨髓间充质干细胞分别加入抗CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-FITC单克隆抗体各5 μL，对于大鼠骨髓间充质干细胞分别加入抗CD90-PE、CD11b-PE、CD44-FITC、CD45-FITC单克隆抗体各5 μL，室温避光反应40 min，PBS洗涤2遍并重悬细胞后，用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面抗原的表达(计数细胞数为5×103)。
1.4.4 诱导分化实验将传代至第3代的人骨髓间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞接种于6孔板中(1×106细胞/孔)，在此期间，人骨髓间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞分别用生长培养基培养，待细胞生长至融合后，分别用骨髓间充质干细胞成骨分化培养基(向生长培养基中添加50 mg/L维生素C，10 mmol/L β-甘油磷酸钠和10-8 mol/L地塞米松)、骨髓间充质干细胞成脂分化培养基(向生长培养基中添加10-8 mol/L地塞米松，10 mg/L胰岛素、100 U/mL青霉素)替换生长培养基进行培养，诱导人骨髓间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞和脂肪细胞。将细胞在分化培养基中培养10 d，每隔2 d进行1次换液，仅在初诱导分化时用10 mg/mL杜仲水提物进行处理，分化前和分化期间细胞置于体积分数为95%空气，体积分数为5% CO2，37 ℃恒温培养箱培养。
实验分组如下：
(1)对照1组：骨髓间充质干细胞生长至融合后，成骨诱导培养基培养；
(2)对照2组：骨髓间充质干细胞生长至融合后，成脂诱导培养基培养；
(3)杜仲AE1组：骨髓间充质干细胞生长至融合后，成骨诱导培养基培养，在诱导分化开始时用10 mg/mL杜仲水提物处理细胞；
(4)杜仲AE2组：骨髓间充质干细胞生长至融合后，成脂诱导培养基培养，在诱导分化开始时用10 mg/mL杜仲水提物处理细胞；
(5)对照1+scramble组：成骨分化培养基培养的骨髓间充质干细胞，在细胞融合至80%时，利用scramble转染细胞，转染48 h后更换新鲜培养基继续培养；
(6)对照1+siRNA Nur77组：成骨分化培养基培养的骨髓间充质干细胞，在细胞融合至80%时，利用siRNA Nur77转染细胞，转染48 h后更换新鲜培养基继续培养；
(7)杜仲AE1+scramble组：骨髓间充质干细胞生长至融合后，成骨诱导培养基培养，在诱导分化开始时用10 mg/mL杜仲水提物处理细胞，然后利用scramble转染细胞，转染48 h后更换新鲜培养基继续培养；
(8)杜仲AE1+siRNA Nur77组：骨髓间充质干细胞生长至融合后，成骨诱导培养基培养，在诱导分化开始时用
10 mg/mL杜仲水提物处理细胞，然后利用siRNA Nur77转染细胞，转染48 h后更换新鲜培养基继续培养；
(9)杜仲AE2+scramble组：骨髓间充质干细胞生长至融合后，成脂诱导培养基培养，在诱导分化开始时用10 mg/mL杜仲水提物处理细胞，然后利用scramble转染细胞，转染48 h后更换新鲜培养基继续培养；
(10)杜仲AE2+ siRNA Nur77组：骨髓间充质干细胞生长至融合后，成脂诱导培养基培养，在诱导分化开始时用10 mg/mL杜仲水提物处理细胞，然后利用siRNA Nur77转染细胞，转染48 h后更换新鲜培养基继续培养；
(11) si-Nur77+NC组：转染siRNA Nur77成功的骨髓间充质干细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱培养。待贴壁细胞生长至90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代。传代扩增3代的对数期骨髓间充质干细胞每天用等量0.1%二甲基亚砜作用4 h，连续2周；
(12) si-Nur77+pifithrin-α组：转染siRNA Nur77成功的骨髓间充质干细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱培养。待贴壁细胞生长至90%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代。传代扩增3代的对数期骨髓间充质干细胞每天用30 μmol/L pifithrin-α作用4 h，连续2周。
对于转染siRNA Nur77以及阴性对照scramble的细胞培养48 h后，采用Western blot鉴定转染效率。转染成功后用于后续实验。
1.4.5 CCK-8法检测细胞增殖将消化后的人骨髓间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞按照1×103个(100 μL)/孔接种于96孔板，细胞贴壁生长24 h后，采用10 mg/mL杜仲水提物干预24，48，72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育2 h，酶标仪测定450 nm时每孔的吸光度值，以吸光度值反映细胞活力。
1.4.6 细胞碱性磷酸酶活性分析分化第7天，成骨诱导的人骨髓间充质干细胞、大鼠骨髓间充质干细胞加入0.1% Triton X-100和25 mmol/L碳酸盐缓冲液溶解并移液，离心(12 000×g，4 ℃，15 min)后从细胞裂解液中获得的上清液首先测得总蛋白含量，然后按照制造商的要求，用碱性磷酸酶活性比色法测定试剂盒计算各组等量蛋白的碱性磷酸酶活性，经归一化后与细胞样品总蛋白量绘制pNP的碱性磷酸酶转化率。
1.4.7 茜素红染色作为成骨细胞成熟的标志，对成骨分化的骨髓间充质干细胞进行茜素红染色。分化第10天，用4 ℃体积分数为70%乙醇替换培养基固定。孵育1 h后，从孔中吸出乙醇，用蒸馏水洗涤固定的成骨细胞，然后向孔中加入2% pH值为4.2的茜素红染色液，染色10 min，从孔中吸取溶液，用蒸馏水洗涤染色细胞，显微镜拍照。拍照完毕后，半定量检测细胞矿化程度：用10%氯化十六烷基吡啶在10 mmol/L PBS中洗脱茜素红染料，利用酶标仪在405 nm波长处测定每孔的吸光度。
1.4.8 流式细胞术检测细胞凋亡情况选用第3代培养第6天的骨髓间充质干细胞，细胞计数后以5×103个/cm2的密度接种于培养皿，干预48 h后检测细胞凋亡率。参照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书操作：用胰酶消化细胞，PBS清洗后800×g离心6 min，收集细胞，随后每个样品中加入500 μL结合缓冲液重悬细胞，避光加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI溶液，暗室静置30 min，最后在流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.4.9 蛋白质免疫印迹分析取对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，以细胞浓度2×107 L-1接种于无菌24孔细胞培养板中，每孔1.5 mL，于37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后，吸弃上清液，每3 d换液1次，连续干预14 d后，去除细胞培养液，预冷的PBS清洗细胞，在细胞样品中加入RIPA细胞裂解液，随后于4 ℃缓慢振荡30 min，12 000 r/min离心15 min，吸取上清液；使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。将蛋白溶液与4×蛋白上样缓冲液混匀煮沸10 min，然后进行SDS-PAGE电泳，待条带分开后，湿转法150 mA转膜2 h，转膜后用5%脱脂乳室温封闭2 h，按比例稀释所检蛋白抗体，分别为cyclin D抗体、cleaved caspase3抗体，Runx2抗体、ALP抗体、Osteocalcin抗体，PPARG抗体、LPL抗体、PLIN1抗体，Nur77抗体、MDM2抗体，p53抗体、ubiquitin-p53抗体(稀释比例均为1∶1 000)，冰箱4 ℃孵育过夜；TBST清洗后，根据说明书稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠/兔IgG抗体(稀释比例为1∶500)，室温孵育1 h；TBST清洗之后加ECL显色液，避光室温孵育2 min后凝胶成像仪成像。选择GAPDH蛋白作为内参。
1.5 主要观察指标 ①杜仲水提物对骨髓间充质干细胞增殖、凋亡以及分化的影响；②杜仲水提物对Nur77/MDM2/p53通路的影响；③敲低Nur77蛋白表达对骨髓间充质干细胞增殖、凋亡和分化的影响；④p53抑制剂逆转Nur77 siRNA对骨髓间充质干细胞增殖、凋亡和分化的影响。
1.6 统计学分析使用SPSS 20.0软件进行统计学分析，用GrapahPad Prism 7.0软件做图。每个实验进行3次重复，所有数据均以均值±标准误表示。分别使用Shapiro-Wilk检验和Levene检验评估数据分布的正态性和方差同质性。根据数据的正态分布和方差的同质性，采用Student t检验评估两组间的显著性。P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经河南省中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

杜仲传统以干燥的树皮入药，具有多种药理作用，单独用药或组方用药能够治疗骨质疏松症、类风湿性关节炎、腰痛、坐骨神经痛、膝盖痛、肾脏缺乏性疼痛等疾病[8]。杜仲叶中的山奈酚能够促进卵巢去势大鼠的骨形成和骨生成[9]。杜仲中提取的桃叶珊瑚苷能够激活Nrf/Keap1通路促进成骨分化，抑制骨质疏松 [10]。槲皮素作为杜仲黄酮类物质，能够激活PI3K/Akt信号通路调控Runx2/Osterix从而促进骨髓间充质干细胞诱导成骨 [11]。林奇生等[12]发现杜仲醇提物能够通过激活RhoA/ROCK信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。盐炙后的杜仲能够有效抑制骨质疏松症大鼠的骨吸收，促进成骨分化，加速骨形成 [13]。除此之外，有报道显示山奈酚和槲皮素可以作为Nur77的配体与Nur77蛋白结合，并抑制Nur77的依赖性反式激活[14]。而山奈酚和槲皮素是杜仲的2种主要黄酮类活性成分[15]，因此，作者猜测杜仲可能通过激活Nur77发挥抗骨质疏松的作用。
为了验证推测，在该研究中通过杜仲水提物干预骨髓间充质干细胞，观察细胞的增殖和成骨分化情况，探究杜仲在抗骨质疏松中的具体分子机制，结果显示杜仲水提物可促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化，其通过上调Nur77蛋白表达，从而促进下游MDM2蛋白表达，增强p53蛋白的泛素化。即杜仲对骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化的促进作用是通过Nur77/MDM2/p53途径进行调节的。这一结果证实了前期的推测，也与早期的报道相一致，即杜仲能够通过上调Nur77发挥抗骨质疏松的作用。
核受体Nur77因其尚未发现生理性配体又被称为孤儿受体，广泛存在于包括间充质干细胞在内的各种组织中，在疾病中异常表达从而发挥调节作用[16]。已有研究表明，核受体Nur77抑制脂肪细胞分化[17]。过表达Nur77能够通过激活GATA结合蛋白2转录，抑制PPARG的转录[18]。在早期，研究人员主要把Nur77作为转录因子研究其调控基因表达的机制[19-20]。事实上Nur77还可作为功能调节蛋白，通过蛋白定位、相互作用和修饰等途径发挥作用[21]。Nur77在成骨细胞中受到甲状旁腺激素的诱导从而在骨形成中发挥作用 [22]。
Scholtysek等 [23]研究表明Nur77通过调节破骨细胞前体的运动在骨重构中发挥重要作用。这些证据表明Nur77在骨分化、骨代谢中发挥着重要作用，并且在脂肪分化中发挥抑制作用，这与该研究发现的Nur77可以促进骨髓间充质干细胞成骨分化，抑制成脂分化的结果相一致。
大量研究表明Nur77与细胞增殖和凋亡相关 [24]。XIANG等 [25]和MEDZIKOVIC等 [26]均表明，敲低Nur77的表达抑制结肠癌细胞HCT116的增殖和活力。用Nur77激动剂处理结肠腺癌细胞能够促进细胞增殖 [27]。而Nur77拮抗剂以剂量依赖性方式抑制肾癌细胞增殖，且移植瘤缩小 [28]。用GFP-Nur77融合蛋白追踪Nur77的位置，结果显示Nur77下调显著抑制前列腺癌细胞的凋亡[29]。在骨质疏松小鼠模型中发现，Nur77促进Bre基因表达，通过MDM2/p53途径促进成骨分化[30]。这与该研究发现的杜仲水提物可通过上调Nur77促进骨髓间充质干细胞增殖、抑制细胞凋亡的结果相一致。
Nur77对p53蛋白的间接影响已被多名学者证实。CHAABANE等[31]用环病毒衍生凋亡蛋白促进Nur77转移到线粒体上并通过激活p53通路诱导线粒体凋亡。在肝癌中，Nur77通过改变与p53蛋白互作蛋白的表达导致细胞死亡 [32]。在骨质疏松小鼠模型中发现，Nur77促进Bre基因表达，通过MDM2/p53途径促进成骨分化[33]。该研究发现杜仲水提物对人源和鼠源的骨髓间充质干细胞的增殖、成骨分化等生物学行为和生物学功能均有影响，为下一步使用小鼠模型进行体内实验提供理论支持。
总之，杜仲水提物可通过上调Nur77，促进MDM2的表达，增强p53蛋白的泛素化，进而促进骨髓来源间充质干细胞的增殖和成骨分化。该研究通过对传统中药杜仲治疗骨质疏松的作用机制探究，为杜仲的临床应用提供了强有力的理论依据，为中医药与干细胞疗法相结合展示了新的可能性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

杜仲水提物上调Nur77表达促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化

Eucommia ulmoides Oliver aqueous extract promotes bone marrow mesenchymal stem cell proliferation and osteoblastic differentiation through upregulating Nur77 protein expression

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