激素性股骨头坏死中的PTGS2和STAT3：潜在铁死亡相关诊断生物标志物

doi:10.12307/2023.734

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (36): 5898-5904.doi: 10.12307/2023.734

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激素性股骨头坏死中的PTGS2和STAT3：潜在铁死亡相关诊断生物标志物

梁学振1，2，骆帝2，李嘉程1，温明韬1，张建1，许波1，2，李刚1，2

1山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250355；2山东中医药大学附属医院显微骨科，山东省济南市 250014

收稿日期:2022-10-08 接受日期:2022-11-25 出版日期:2023-12-28 发布日期:2023-03-27
通讯作者: 李刚，博士，教授，主任医师，山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250355；山东中医药大学附属医院显微骨科，山东省济南市 250014 许波，博士，副教授，副主任医师，山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250355；山东中医药大学附属医院显微骨科，山东省济南市 250014
作者简介:梁学振，男，1990年生，山东省新泰市人，汉族，2019年山东中医药大学毕业，博士，副教授，主要从事中医药防治骨坏死、代谢性骨病的临床与基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(82205154)，项目负责人：梁学振；山东省自然科学基金青年项目(ZR2021QH004)，项目负责人：梁学振；济南市临床医学科技创新计划(202019056)，项目负责人：梁学振；山东省中医药科技项目(2020Q009)，项目负责人：梁学振

PTGS2 and STAT3 in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head: ferroptosis-related potential diagnostic biomarkers

Liang Xuezhen1, 2, Luo Di2, Li Jiacheng1, Wen Mingtao1, Zhang Jian1, Xu Bo1, 2, Li Gang1, 2

1First Clinical Medical School, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; 2Department of Orthopedic Microsurgery, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China

Received:2022-10-08 Accepted:2022-11-25 Online:2023-12-28 Published:2023-03-27
Contact: Li Gang, MD, Professor, Chief physician, First Clinical Medical School, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; Department of Orthopedic Microsurgery, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China Xu Bo, MD, Associate professor, Associate chief physician, First Clinical Medical School, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; Department of Orthopedic Microsurgery, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
About author:Liang Xuezhen, MD, Associate professor, First Clinical Medical School, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; Department of Orthopedic Microsurgery, Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82205154 (to LXZ); Shandong Natural Science Foundation Youth Program, No. ZR2021QH004 (to LXZ); Jinan Clinical Medical Science and Technology Innovation Plan, No. 202019056 (to LXZ); Shandong Traditional Chinese Medicine Science and Technology Project, No. 2020Q009 (to LXZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

激素性股骨头坏死：激素应用已成为继创伤之后引起股骨头坏死的第二大原因，激素使股骨头内多种细胞死亡，大部分激素性骨坏死发生在用药后的2年内，主要集中在6个月内，后期甚至引起股骨头塌陷，已成为导致髋关节残疾最常见的原因之一。若早期诊断与防治有望取得良好的临床疗效，因此，寻找可靠的诊断生物标志物是目前亟待解决的问题。
铁死亡(Ferroptosis)：是最早由哥伦比亚大学Dr. Brent R.Stockwell在2012年提出的，一种铁依赖性的、细胞内脂质活性氧累积的、区别于凋亡、焦亡、自噬的新型细胞程序性死亡方式；其本质是谷胱甘肽的耗竭，谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)活性下降，脂质氧化物不能通过GPX4催化的谷胱甘肽还原酶反应代谢，之后二价的铁离子氧化脂质产生活性氧，从而促使铁死亡的发生。

背景：研究推测铁死亡可能参与了激素性股骨头坏死的病理过程，但铁死亡在激素性股骨头坏死中的发病机制尚不清楚。
目的：旨在通过生物信息学手段分析激素性股骨头坏死进展过程中调控铁死亡相关的关键基因，以进一步阐明铁死亡在激素性股骨头坏死中的生物学机制。
方法：从基因表达综合数据库(GEO)下载血清来源的GSE123568数据集，包括10个非激素性股骨头坏死(类固醇给药后)样本和30个激素性股骨头坏死样本；从FerrDb数据库整理铁死亡相关基因。通过将GSE123568数据集与铁死亡基因集映射，筛选激素性股骨头坏死中铁死亡相关的差异基因，通过“clusterProfiler”R包分析差异基因的基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集，通过“corrplot”R包分析差异基因的Spearman相关系数，通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，通过MCODE插件权重分析以识别重要的基因簇模块，通过CytoHubba插件利用拓扑网络算法筛选Hub基因，通过“pROC”R包分析Hub基因的ROC曲线；借助髋关节软骨来源的GSE74089数据集验证Hub基因的表达水平。

结果与结论：①根据调整后的P值<0.01和|log2 FC| >log21.5的既定标准，在非激素性股骨头坏死和激素性股骨头坏死患者的外周血样本中筛选出30个激素性股骨头坏死中铁死亡相关的差异基因，包括20个上调基因和10个下调基因；②GO和KEGG通路富集分析表明，差异基因主要富集在氧化应激、缺氧诱导因子1信号通路和铁死亡；Spearman相关性分析显示差异基因之间存在一定的相关性；③PPI网络揭示差异基因在生物系统中具有相互作用关系，通过MCODE插件识别出2个重要的基因簇模块，通过CytoHubba插件的MCC，MNC，DMNC，Degree和EPC算法交叉映射确定7个Hub基因；④ROC曲线表明与非激素性股骨头坏死样本相比，Hub基因在激素性股骨头坏死样本中具有更高的诊断价值；⑤GSE74089数据集交叉验证明确激素性股骨头坏死髋关节软骨标本中PTGS2和STAT3的表达水平相对于正常样本显著升高，这与GSE123568数据集血清样本表达一致；⑥结论：通过生物信息学分析挖掘出30个激素性股骨头坏死中铁死亡相关的差异基因，通过构建其PPI网络和外部数据集交叉验证，筛选得到PTGS2和STAT3有望成为潜在诊断生物标志物的Hub基因，为进一步深入探索激素性股骨头坏死铁死亡相关的作用机制和诊断提供靶点和新的见解。

https://orcid.org/0000-0001-5649-4212 (梁学振)；

https://orcid.org/0000-0002-4587-6650 (李刚)；

https://orcid.org/0000-0003-1863-4530 (许波)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 激素性股骨头坏死, 铁死亡, 生物信息学, 氧化应激, 生物标志物

Abstract: BACKGROUND: Previous experimental studies have shown that ferroptosis might be involved in the pathological process of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, but the pathogenesis of ferroptosis in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head remains unclear.
OBJECTIVE: To analyze the key potential ferroptosis-related genes involved in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head to further clarify the biological mechanism of ferroptosis in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head by bioinformatics.
METHODS: The GSE123568 mRNA expression profile dataset, including 10 non-steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (following steroid administration) samples and 30 steroid-induced osteonecrosis of the femoral head samples, was downloaded from the Gene Expression Omnibus (GEO) database. Ferroptosis-related genes were obtained from the Human Ferroptosis Database (FerrDb). The ferroptosis-related genes involved in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head were screened by intersecting the GSE123568 dataset with the set of ferroptosis genes. The differentially expressed ferroptosis-related genes involved in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head were identified with R software. In addition, Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analyses of the differentially expressed ferroptosis-related genes involved in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head were conducted by “clusterProfiler” R package. Spearman correlations between the expression levels of the differentially expressed ferroptosis-related genes involved in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head were confirmed with “corrplot” R package. Moreover, the protein-protein interaction (PPI) network was analyzed by using the Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes (STRING); significant gene cluster modules were identified with the MCODE Cytoscape plugin, and hub genes among the differentially expressed ferroptosis-related genes involved in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head were screened by CytoHubba plugin. The ROC curves of the final specifically expressed hub genes were analyzed by “pROC” R package. Finally, the expression levels of the hub genes of the differentially expressed ferroptosis-related genes involved in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head were validated by using the GSE74089 dataset.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) A total of 30 differentially expressed ferroptosis-related genes were identified between the peripheral blood samples of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head patients and non-steroid-induced osteonecrosis of the femoral head patients based on the defined criteria of adjusted P value <0.01 and |log2 FC| >log21.5, including 20 upregulated genes and 10 downregulated genes. (2) The GO and KEGG pathway enrichment analyses revealed that these differentially expressed ferroptosis-related genes were particularly enriched in oxidative stress, hypoxia-inducible factor-1 signaling pathway and ferroptosis. Spearman correlation analysis revealed significant correlations among the differentially expressed ferroptosis-related genes. (3) The PPI results demonstrated that the differentially expressed ferroptosis-related genes interacted with each other. Two significant gene cluster modules were identified through the MCODE plugin, and seven hub genes were identified by using the intersecting results within the MCC, MNC, DMNC, Degree and EPC algorithms of CytoHubba. (4) ROC curve suggested that compared to non-steroid-induced osteonecrosis of the femoral head samples, these seven overlapped ferroptosis-related hub genes had higher diagnostic value in the steroid-induced osteonecrosis of the femoral head samples. (5) The GSE74089 dataset showed that PTGS2 and STAT3 were significantly upregulated in the hip cartilage specimens, which was consistent with the GSE123568 dataset. (6) It is concluded that thirty potential ferroptosis-related genes were identified via bioinformatics analysis. The PPI network was constructed to select the Hub genes in which PTGS2 and STAT3 might serve as potential diagnostic biomarkers because they regulated ferroptosis. These results provide a target and new insight for further exploring the ferroptosis-related action mechanism and diagnosis of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head.

Key words: steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, ferroptosis, bioinformatics, oxidative stress, biomarker

中图分类号:

激素性股骨头坏死|铁死亡|生物信息学|氧化应激|生物标志物

梁学振, 骆帝, 李嘉程, 温明韬, 张建, 许波, 李刚. 激素性股骨头坏死中的PTGS2和STAT3：潜在铁死亡相关诊断生物标志物[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(36): 5898-5904.

Liang Xuezhen, Luo Di, Li Jiacheng, Wen Mingtao, Zhang Jian, Xu Bo, Li Gang. PTGS2 and STAT3 in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head: ferroptosis-related potential diagnostic biomarkers[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(36): 5898-5904.

图/表（结果） 9

2.1 SONFH中铁死亡相关差异基因分析通过对GSE123568数据集进行PCA降维分析，结果表明，该数据的可重复性是可靠的，见图1A；从FerrDb数据库中挖掘出259个非重复的铁死亡相关基因，与GSE123568数据集映射出234个SONFH中铁死亡相关基因，见图1B；根据既定标准，筛选出30个SONFH中铁死亡相关差异基因，其中20个上调基因和10个下调基因，见表1、图1C和图2。

2.2 SONFH中铁死亡相关差异基因的GO和KEGG富集分析通过“clusterProfiler”R包对上述30个SONFH中铁死亡相关差异基因进行GO和KEGG富集分析，如图3所示，结果显示608个生物学过程条目、19个细胞组分条目、18个分子功能条目和45个KEGG条目被显著富集。其中生物学过程条目主要涉及对氧化应激的反应、细胞对外部刺激的反应、对营养水平的反应、细胞对营养水平的反应、细胞对细胞外刺激的反应、对金属离子的反应、细胞对机械的反应刺激、细胞对氧化应激的反应、对饥饿的反应、对机械刺激的反应等，如图3A，B，D所示；细胞组分条目涵盖次级溶酶体、动物细胞膜筏微区处的内陷小窝、黑素体、色素颗粒和质膜筏等，如图3A所示；分子功能条目主要包括产生超氧化物的NADPH氧化酶活性，氧化还原酶活性，作用于NAD(P)H，氧作为受体，氧化还原酶活性，作用于单个供体并结合分子氧，结合两个氧原子，氧化还原酶活性，作用于具有分子氧和中性氨基酸跨膜转运蛋白活性的单一供体等，如图3A所示；KEGG通路主要富集于缺氧诱导因子1信号通路、铁死亡、利什曼病、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、癌症中枢碳代谢等，如图3A，C，D所示。

2.3 SONFH中铁死亡相关差异基因的相关性分析通过“corrplot” R包对上述30个SONFH中铁死亡相关差异基因之间的表达相关性进行Spearman相关性分析，结果表明，上述基因之间显示出一定的相关性，其中NCF2和LAMP2的正相关性最高(Cor=0.909 9)，而SLC7A5和BID(Cor=-0.864 9)的负相关性最高，如图4所示。

2.4 PPI网络及关键模块和Hub基因筛选通过STRING数据库检索上述30个SONFH中铁死亡相关差异基因之间的潜在互作关系，结果显示，这些基因在生物系统中具有一定的相互作用关系，如图5A所示。通过MCODE插件识别出2个重要的基因簇模块，模块1是由9个节点和20个边组成的，包含8个上调和1个下调的差异基因，聚类得分最高(得分：5.000)，聚类2是由3个节点和3个边组成的，均为上调的差异基因(得分：3.000 )，如图5B，C所示。通过CytoHubba插件的MCC，MNC，DMNC，Degree D和EPC算法计算的最高前10个基因，进行交叉映射，最终确定了7个重叠的Hub基因(CYBB，TLR4，STAT3，PTGS2，MAPK3，HMOX1和MAP3K5)，如图5D和表2所示。

2.5 SONFH中铁死亡相关Hub基因的ROC曲线通过“pROC”和“ggplot2”R包分析、绘制上述7个SONFH中铁死亡相关Hub基因的ROC曲线，结果如图6所示。与非SONFH样本相比，这7个铁死亡相关的Hub基因在SONFH样本中具有更高的诊断价值(AUC=0.940，CI=0.855-1.000)。其中，MAP3K5在SONFH样本中的诊断价值最高(AUC：0.893)，其他基因在SONFH样本的诊断价值如下：PTGS2(AUC：0.860)，STAT3(AUC：0.860)，TLR4(AUC：0.817)，MAPK3(AUC：0.813)，HMOX1(AUC：0.803)和CYBB (AUC：0.773)。总体而言，上述7个Hub基因在SONFH中具有良好的诊断性能，有望成为SONFH铁死亡相关的潜在生物标志物。

2.6 GSE74089数据集Hub基因的交叉验证为了验证GSE123568数据集的可靠性、增加Hub基因的局部特异性和识别贯穿于SONFH的疾病发生发展全过程的潜在生物标志物，通过软骨来源的GSE74089数据集进行上述7个SONFH中铁死亡相关的Hub基因的表达水平验证，结果显示，与血清结果相似，SONFH髋关节软骨标本中 PTGS2和STAT3的表达水平相对于正常样本显著升高，与GSE123568数据集血清样本的表达一致；MAP3K5和MAPK3的表达水平相对于正常样本显著降低，但与GSE123568数据集表达相反；而CYBB、HMOX1和TLR4则在GSE74089数据集中表达没有统计学差异，如图7所示。

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引言

激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH)是一种慢性难治性骨科疾病，好发于30-50岁的中青年男性。SONFH虽不危及生命，但具有早期隐匿性强、后期残疾率高等特点[1-2]，如果未得到及时有效的治疗，大约80%的患者将会在1-4年内发展至股骨头塌陷[3]，已成为导致中青年髋关节残疾最常见的原因之一，造成了沉重的社会和经济负担[4]。尽管糖皮质激素已被认为是SONFH的病理原因，但其发生发展是一个多因素、多环节、多阶段、多基因共同调控的动态病理过程，涉及多种分子生物学过程与骨微环境的相互作用[5]，具体发病机制尚未完全清楚，但多数认为是股骨头内血液循环破坏造成细胞死亡[6]。
铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化损伤引起的非凋亡性程序性细胞死亡的新模式[7]。CHEN等[8]研究表明，与股骨颈正常区域或正常大鼠相比，SONFH患者坏死区域和大鼠模型通常具有更高的活性氧和脂质氧化标志物水平；LU等[9]研究结果显示，过量糖皮质激素使成骨细胞中丙二醛和脂质活性氧自由基升高，导致脂质过氧化水平上升，引起谷氨酸和半胱氨酸的代谢紊乱，激活促铁死亡途径。上述临床和基础研究表明，糖皮质激素引起活性氧自由基、铁代谢障碍、细胞抗氧化系统失衡及脂质氧化反应，与铁死亡的机制密切相关[10]。铁死亡由脂质过氧化作用驱动，是细胞代谢和氧化还原失衡的结果，并可通过药物或遗传手段直接阻断脂质过氧化或耗尽细胞内的铁来阻止其发生。抑制成骨细胞中的铁死亡已成为防治SONFH进展的一种治疗策略。然而，SONFH与铁死亡的分子机制尚未明确，仍需通过进一步探究糖皮质激素如何通过铁死亡影响骨修复和骨稳态的关键基因和作用机制。
迄今为止，尚未发现关于铁死亡与SONFH的生物信息学研究，高通量数据有助于揭示疾病发生发展的分子机制和提高人类对疾病诊断及预后的认识。LI等[11]收集SONFH患者和健康人群外周血清样本进行组学分析，并将数据上传到GEO数据库，为解析SONFH相关的分子特征提供了数据支撑。因此，作者借助生物信息学方法筛选SONFH中与铁死亡相关的差异基因，探讨这些基因的诊断价值，该研究预期结果将揭示SONFH发生与发展过程中与铁死亡相关的关键基因与分子机制，为SONFH的临床诊断提供潜在的生物标志物。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 数据收集与整理 FerrDb 数据库(http://www.datjar.com:40013/bt2104/)是第一个经过实验验证的铁死亡调节剂、标志物以及与疾病关联的数据库，用以下载铁死亡相关的调控基因[12]。GSE123568数据集是由ZHANG等[2]于2018-12-10提交至国家生物技术信息中心基因表达综合中心(National Center for Biotechnology Information Gene Expression Omnibus，NCBI GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库中血清来源的数据集，包括10个非SONFH(类固醇用药史)和30个SONFH血清样品(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE123568)。
1.2 SONFH中铁死亡相关基因的差异表达分析通过“affy”R包中的一体化算法 RMA(Robust Multiarray Average)对GSE123568的原始数据进行预处理和归一化；数据归一化后，利用主成分分析算法(principal component analysis，PCA)观察整体分布，并识别是否具有离散样本的存在；将GSE123568数据集基因与铁死亡相关基因进行映射，通过“limma”R包分析GSE123568数据集中非SONFH样本和SONFH样本之间的差异基因，其中筛选标准为调整后的P值< 0.01和 |log2 差异倍数(fold change，FC)| >log21.5；通过“PCA” R包、“pheatmap” R包和“ggplot2”R包对PCA图、热图和火山图进行可视化。
1.3 SONFH中铁死亡相关差异基因的功能富集分析通过“clusterProfiler”R包和“GOplot”R包对SONFH中铁死亡相关差异基因的基因本体论(gene ontology，GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路进行富集分析，以挖掘SONFH中铁死亡相关差异基因的生物学过程和信号通路[13-14]。GO富集分析主要包括生物学过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular composition，CC)和分子功能(molecular function，MF)。将调整后的P值 < 0.05设定为富集具有统计学意义。
1.4 SONFH中铁死亡相关差异基因的相关性分析通过“corrplot”R包对铁死亡相关差异基因表达水平之间的Spearman相关系数进行分析，以探索SONFH中这些基因之间的内在关系与表达相关性。
1.5 蛋白网络构建及Hub基因及关键模块筛选通过STRING数据库(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes，版本：11.0，https://string-db.org/)检索铁死亡相关差异基因潜在的蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络[15]。筛选阈值设定为综合得分(combined_score)≥0.4。通过Cytoscape软件进行PPI网络构建和可视化，其中节点代表蛋白，边代表蛋白之间的互作关系，去除孤立的不存在任何互作的蛋白。通过MCODE(Molecular Complex Detection)插件对PPI网络进行权重分析，预测PPI网络中关键的分子模块[16]，其中设置参数为节点度数≥2，haircut≥0.2，节点score阈值≥0.2，K-core≥2，最大深度=100。通过CytoHubba插件利用拓扑网络算法对每个基因赋值，排序挖掘Hub基因和子网络。CytoHubba插件提供了11种拓扑分析算法，包括度(Degree)，边缘渗透分量 (Edge Percolated Component，EPC)，最大邻域分量 (Maximum Neighborhood Component，MNC)，最大邻域分量密度(Density of Maximum Neighborhood Component，DMNC)，最大集团中心度 (Maximal Clique Centrality，MCC)和6个中心点(Bottleneck，EcCentricity，亲和度，辐射度，中间性和应力)。参考XUE等[17]研究方法，将MCC，DMNC，MNC，Degree和EPC等算法计算的最高前10个基因的交集确定为Hub基因。
1.6 Hub基因的ROC曲线通过“pROC”R包绘制ROC曲线，以分析Hub基因的特异性表达情况，并挖掘SONFH诊断的生物标志物。其中，曲线下面积(area under the ROC curve，AUC)是一个综合了敏感性和特异性的指标，代表诊断测试的内在有效性，介于0.5和1之间，AUC越接近1，诊断越好。
1.7 Hub基因的外部数据集的交叉验证 GSE74089数据集是GEO数据库中软骨来源的数据集，包括4个股骨头坏死(NFH)患者和4个健康对照的髋关节软骨样本。通过“limma”R包以相同的筛选标准分析GSE74089数据集中Hub基因的表达水平，与GSE123568数据集中Hub基因的表达水平进行比较。
1.8 统计学分析使用R软件(4.0.2版)进行所有数据统计分析，P < 0.05为差异有显著统计学意义。文章统计学方法已经山东中医药大学附属医院魏然和宋慧慧审核。

讨论

股骨头坏死是骨科常见的难治性疾病之一。流行病学表明，日本每年有2 500-3 000例新发病例，韩国为1万-1.5万，美国为1.5万-2万，而中国为10万-20万。随着医学的发展，激素在临床上的应用越来越广泛，SONFH的发病率逐年升高。糖皮质激素的长期和超生理剂量应用是SONFH的主要诱发因素，中国一项多中心大样本调查研究表明，约26.35%男性和55.75%女性非创伤性股骨头坏死患者是由激素引起的[18]。研究表明，接受高剂量或长期使用糖皮质激素的人群中有9%-40%发生SONFH[19]。SONFH的发生与发展是多因素、多环节、多阶段、多基因共同调控的动态病变过程，其病理机制尚不清楚，但与股骨头内骨微环境稳态的调控机制失衡相关。骨骼系统是一个代谢活跃的复杂系统，正常的骨重建过程依赖于骨微环境稳态的动态平衡，而骨微环境稳态受到激素水平、机械负荷和能量平衡等多种因素的影响[20]。在糖皮质激素的作用下，成骨调控转录激活因子的活化被阻断，前成骨细胞向成熟成骨细胞诱导分化受到抑制，骨基质矿化过程障碍，成骨细胞的增殖活性及成骨能力减弱[21-22]。上述机制造成了骨微环境稳态的平衡体系破坏，最终引起股骨头内骨重塑异常，局部硬化囊变，进而导致或加重塌陷[23]。据统计，2018年中国共进行人工全髋手术698 583台，因股骨头坏死引起的患者人数仅次于髋骨性关节炎，但髋关节置换术并不是所有患者的最佳选择，尤其是年龄< 60岁的患者，而大约75%的SONFH患者年龄介于30-50岁，保髋治疗尤为重要。因此，研究糖皮质激素对SONFH的病理机制，挖掘早期诊断的生物学标志物具有重要的理论和现实意义。
塌陷是股骨头软骨下骨力学性能失效的重要特征，是决定SONFH治疗方案的最重要因素[24]。抑制骨细胞发生程序性死亡是预防软骨下骨塌陷的主要策略之一，细胞凋亡是炎症性攻击导致的程序性细胞死亡，是重要的死亡机制之一[25]。然而，骨细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，使得抑制凋亡疗法效果有限。因此，探究激素引起的非凋亡的细胞死亡形式，以恢复骨代谢的微环境稳态平衡，是防治SONFH后期塌陷的新方向。铁死亡这一术语最早由Dr. Brent R.Stockwell在2012年提出，是一种铁依赖性的由于抗氧化系统失衡、氧化损伤引起的脂质过氧化为特征的新型细胞程序性死亡方式[26]。它不同于细胞凋亡、坏死等，主要表现为线粒体体积缩小、双层膜密度增加、线粒体嵴减少或消失及外膜破碎[27]。在骨组织中，骨形成取决于成熟成骨细胞的数量和功能，与成骨细胞的形成、寿命和活性密切相关。铁作为体内最常见的微量元素之一，对维持机体生命活动具有不可代替的作用。铁稳态的存在，对细胞的正常生理功能具有重要意义。目前已有研究证实铁超载可导致小鼠骨质流失，并认为其机制与氧化应激密切相关[28]。通过降低成骨细胞铁积累、抑制脂质过氧化，将为防治SONFH提供新的思路。因此，此次研究借助生物信息学手段重点探索SONFH中铁死亡相关的关键基因和作用机制，旨在为SONFH患者的临床诊断提供有效的数据支持和理论参考。
基于FerrDb数据库和GSE123568数据集，此次研究映射出234个铁死亡相关基因，根据调整后的P值< 0.01和|log2 FC| > log21.5的标准筛选出30个SONFH中铁死亡相关的差异基因，包括20个上调基因和10个下调基因，其中一些基因先前已在SONFH研究过。例如，OKAZAKI等[29]研究表明，脂多糖对TLR4的刺激会增加大鼠SONFH 的发病率。ZHU等[30]证实，花萼素可通过抑制TLR4/NF-κB通路调节炎症、促进骨形成，以改善SONFH大鼠的骨丢失或成为预防SONFH的潜在候选靶点。
为进一步阐明上述30个铁死亡相关差异基因的潜在分子机制，对其进行GO功能注释和KEGG富集分析，结果表明主要富集在氧化应激反应和缺氧诱导因子1信号通路等。已有研究表明，无论是在动物模型或是在体外细胞研究中，氧化应激对SONFH的影响均不容忽视[31-33]。细胞内的活性氧是最常见的体内产生的高活性分子，在机体的新陈代谢中扮演重要角色。正常情况下，机体内活性氧自由基的产生和清除处于动态平衡，氧化应激是指机体遭受到外源或内源性刺激后，机体内活性氧等高活性分子物质大量产生，氧化物的清除速度低于氧化程度，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而引起机体组织损伤[34]。铁死亡的过程中往往也伴随着氧化损伤，且铁死亡作为细胞代谢的重要环节，选择性清除活性氧以维持细胞自我调控与机体平衡稳定。此外，WU等[35]研究表明，缺氧诱导因子1α敲除可挽救2-乙基己单酯诱导的铁死亡。显然，仍需更多的研究来证实此次研究的结果，阐明这些铁死亡相关差异基因在SONFH中的潜在生物学功能。
生物网络可能由几个功能模块组成，其复杂的亚基及其相互作用通常导致相同的生物学过程，为构成复杂网络的各个组成部分的生物学功能提供了新的视角。从此研究借助STRING数据库构建SONFH中铁死亡相关差异基因的PPI网络，通过MCODE分析提取出2个核心簇模块。网络中Hub基因往往根据拓扑网络算法和筛选标准的不同而变化，为提高筛选的可信度，参照XUE等[17]研究方法，借助CytoHubba插件整合MCC，MNC，DMNC，Degree和 EPC等5种算法中鉴定出7个SONFH中与铁死亡有关的Hub基因，包括 CYBB，TLR4，STAT3，PTGS2，MAPK3，HMOX1和MAP3K5；而且上述7个Hub基因都存在于2个核心簇模块结果中。此外，ROC曲线结果也显示，与非SONFH样本相比，上述7个枢纽基因在SONFH样本中具有更高的诊断价值，有望成为SONFH潜在的铁死亡相关诊断生物标志物。
SONFH的发生发展过程中，初始病变多为血管或者骨质变化，中后期演变为软骨改变。换句话说，若髋关节软骨标本中出现差异表达，提示这些差异基因可能也存在于中后期；因此，借助软骨样本进行外部数据集交叉验证，一方面可增加差异基因的局部特异性，另一方面能有效识别出贯穿于SONFH的疾病发生发展全过程的潜在生物标志物。结果显示，PTGS2和STAT3在GSE123568数据集和GSE74089数据集之间表达一致，均相对于非SONFH样本显著上调，而且这些基因先前均已在骨代谢疾病或铁死亡方面有过报道。STAINES BOONE等 [36]描述了一个信号转换器和转录激活因子3(STAT3)缺陷、易发生脆性骨折和患有股骨头坏死的男孩，对他每6个月静脉注射唑来膦酸后反应良好，治疗3个疗程，3年后患者独立行走并没有其他骨折。WU等 [37]研究表明，lncRNA FGD5-AS1通过CeRNA调控机制下调miR-296-5p、上调STAT3，促进骨髓间充质干细胞增殖、抑制其凋亡，进而发挥防治SONFH的作用。JIANG等[38]指出胰岛素样生长因子1可能通过PI3K/AKT信号通路上调环氧化酶2的表达，逆转地塞米松骨形态发生蛋白9诱导的小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化的抑制作用，环氧化酶2是PTGS2的别称。
尽管研究基于生物信息学挖掘构建了SONFH中铁死亡相关差异基因的PPI调控网络，筛选出PTGS2和STAT3表达一致的Hub基因作为潜在的诊断生物标志物，但仍存在一定的局限性。首先，虽然GEO数据库中存储了大量的高通量数据，但仍未找到更多关于SONFH的人类物种来源的数据集，这导致样本数量特别有限，尤其是同一样本来源的数据集；其次，缺乏进一步的体内外实验来验证SONFH铁死亡相关Hub基因的诊断价值及作用机制，后续将设计分子生物学实验和临床试验以解决偏倚结果和结论方面可能存在的局限性。
结论：综上所述，借助生物信息学手段，此次研究挖掘出30个SONFH中铁死亡相关的差异基因，通过构建其PPI网络和外部数据集交叉验证，筛选得到PTGS2和STAT3这2个有望成为潜在诊断生物标志物的Hub基因，为进一步深入探索SONFH铁死亡相关的作用机制和诊断提供靶点和新的见解。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

激素性股骨头坏死中的PTGS2和STAT3：潜在铁死亡相关诊断生物标志物

PTGS2 and STAT3 in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head: ferroptosis-related potential diagnostic biomarkers

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