2.1   差异表达基因的生物信息学筛选及分析   
2.1.1   数据集获取   在GEO数据库中获取符合筛选条件的数据集GSE98918，该数据集包含12例骨关节炎患者的半月板组织和12例非骨关节炎(关节镜下半月板部分切除术)患者的半月板组织。
2.1.2   数据处理及差异表达基因的筛选   使用GEO2R分析获得差异表达基因列表并下载差异基因列表和矩阵文件，使用R语言devtools包及ggbiplot包对数据集进行可视化的主成分分析和碎石图的绘制，如图1A，B所示，主成分分析显示两组样本间有明显的群体偏差聚类，碎石图显示参考提取因子个数为4时，累计方差解释率就可达到90%以上，提取因子个数为6时，曲线趋于平缓，说明骨关节炎患者组与正常对照组半月板组织的基因表达谱有显著差异，分析结果可信度高。
用Excel筛选列表中的差异表达基因，条件为adj.P. Value < 0.05，|log FC|> 1，得到上调基因147个、下调基因212个。使用R语言ggplot2包对筛选出的差异表达基因绘制火山图，见图1C。选取|log FC|排名前十的上调基因和下调基因，使用R语言pheatmap包进行热图的绘制，见图1D。



2.1.3   GO分析和KEGG分析   在GENE ONTOLOGY网站上对差异基因进行GO分析，生物过程结果显示，筛选出的差异表达基因主要在胶原纤维组织、对脂蛋白颗粒的反应、维持血脑屏障、MHC蛋白复合物组装、炎症反应过程中的白细胞迁移等子集中富集，见图2A。细胞成分结果显示，差异表达基因主要在含有胶原蛋白的细胞外基质、胶原蛋白三聚体、包被网格蛋白的内吞囊泡膜、基底膜等子集中富集，见图2B；分子功能结果显示，差异表达基因主要富集在赋予抗张强度的细胞外基质结构成分和细胞外基质结构成分。
在DAVID数据库中对差异表达基因进行KEGG通路富集分析，结果表明，差异基因在类风湿性关节炎、Th17细胞分化、抗原的加工和呈递、细胞黏附分子、金黄色葡萄球菌感染、蛋白质的消化吸收等通路中富集，见图2C。GO分析和KEGG分析结果及P值如表2所示。







2.1.4   GSEA分析   对数据集所有基因信息进行GSEA分析的结果显示，富集的通路主要涉及细胞外基质的相互作用、肿瘤蛋白p53(TP53)调节细胞衰老、介导缺氧诱导因子1亚基α的相关信号通路、多糖的降解、白细胞介素17信号通路、细胞色素P-450与药物代谢、软组织肉瘤、酪氨酸激酶受体2(ERBB2)调节细胞运动等，见图3。




2.1.5   蛋白互作网络及Hub基因筛选   筛选出的差异表达基因结果在string网站上分析，获得蛋白互作结果。使用MCODE插件对PPI网络进行功能模块筛选，在DAVID数据库分别对SCORE值排名前三的功能模块进行KEGG通路富集分析，P < 0.05为有统计学意义。结果显示，模块1的基因主要在蛋白质消化吸收、血小板激活、细胞外基质的相互作用等通路中富集，见图4A；模块2的基因主要涉及赖氨酸降解，见图4B；模块3的基因主要富集在补体途径、金黄色葡萄球菌感染、酒精性肝病、抗原加工和呈递等通路，见图4C。



使用Cytoscape软件对蛋白互作结果进行拓扑分析，构建PPI网络，利用插件CytoHubba，选择其中的MCC算法，筛选评分最高的10个Hub基因，分别是COL1A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2、COL6A3、LOX、LOXL1、LOXL2、POSTN、PLOD1，见图5。



2.2   体外实验验证Hub基因的表达   如图6所示，对比对照组，实验组中Hub基因COL1A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2、COL6A3、LOXL1、LOXL2的mRNA表达均显著降低(P < 0.000 1)，LOX、POSTN的mRNA表达显著升高(P < 0.000 1)，PLOD1 mRNA的表达无明显变化(P > 0.05)。

[1] BOYAN BD, TOSI L, COUTTS R, et al. Sex differences in osteoarthritis of the knee. J Am Acad Orthop Surg. 2012;20(10):668-669.  [2] LESPASIO MJ, PIUZZI NS, HUSNI ME, et al. Knee Osteoarthritis: A Primer. Perm J. 2017;21:16-183.  [3] 韩明睿,刘倩倩,孙洋.骨关节炎发病机制及药物调控新进展[J].中国药理学通报,2022,38(6):807-812. [4] RIM YA, JU JH. The Role of Fibrosis in Osteoarthritis Progression. Life (Basel). 2020;11(1):3. [5] RIM YA, NAM Y, JU JH. The Role of Chondrocyte Hypertrophy and Senescence in Osteoarthritis Initiation and Progression. Int J Mol Sci. 2020;21(7):2358.  [6] ENGLUND M, GUERMAZI A, LOHMANDER SL. The role of the meniscus in knee osteoarthritis: a cause or consequence?  Radiol Clin North Am. 2009;47(4):703-712. [7] BROPHY RH, SANDELL LJ, CHEVERUD JM, et al. Gene expression in human meniscal tears has limited association with early degenerative changes in knee articular cartilage. Connect Tissue Res. 2017;58(3-4):295-304. [8] 姚佳炜,徐雄峰,易鹏,等.骨关节炎滑膜组织差异表达基因筛选及关键基因的验证结果[J].中国组织工程研究,2022,26(18):2881-2887. [9] 朱义芳,郭莉,陈露,等.骨关节炎的潜在生物标志物筛选及关键基因验证[J].四川医学,2021,42(10):969-975. [10] 李升扬.基于生物信息学方法筛选骨关节炎相关关键分子靶点[D].长春:吉林大学,2021. [11] 王海明,张驰,魏向阳,等.膝骨关节炎软骨细胞中差异基因表达的生物信息学分析[J].华西医学,2021,36(5):623-631. [12] 杨威,袁普卫,韩清民.基于生物信息学筛选骨关节炎诊疗相关的关键基因[J].中华实验外科杂志,2022,39(1):44-44. [13] BROPHY RH, ZHANG B, CAI L, et al. Transcriptome comparison of meniscus from patients with and without osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2018;26(3): 422-432. [14] 李明秀,王轩,杨杰,等.骨关节炎体外模型特点及设计新思路[J].中国组织工程研究,2023,27(2):300-306. [15] ABRAMOFF B, CALDERA FE. Osteoarthritis: Pathology, Diagnosis, and Treatment Options. Med Clin North Am. 2020;104(2):293-311. [16] PEAT G, THOMAS MJ. Osteoarthritis year in review 2020: epidemiology & therapy. Osteoarthritis Cartilage. 2021;29(2):180-189. [17] DELPLACE V, BOUTET MA, LE VISAGE C, et al. Osteoarthritis: From upcoming treatments to treatments yet to come. Joint Bone Spine. 2021; 88(5):105206. [18] ZHAO J, LU Q, LIU Y, et al. Th17 Cells in Inflammatory Bowel Disease: Cytokines, Plasticity, and Therapies. J Immunol Res. 2021;2021:8816041. [19] SCANZELLO CR, GOLDRING SR. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 2012;51(2):249-257. [20] WOODELL-MAY JE, SOMMERFELD SD. Role of Inflammation and the Immune System in the Progression of Osteoarthritis. J Orthop Res. 2020;38(2):253-257.  [21] PARK J, LEE HS, GO EB, et al. Proteomic Analysis of the Meniscus Cartilage in Osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2021;22(15):8181. [22] PENG Z, SUN H, BUNPETCH V, et al. The regulation of cartilage extracellular matrix homeostasis in joint cartilage degeneration and regeneration. Biomaterials. 2021;268:120555. [23] SHI Y, HU X, CHENG J, et al. A small molecule promotes cartilage extracellular matrix generation and inhibits osteoarthritis development. Nat Commun. 2019;10(1):1914. [24] Semenza GL.Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 2012;148(3):399-408.  [25] YUDOH K, NAKAMURA H, MASUKO-HONGO K, et al. Catabolic stress induces expression of hypoxia-inducible factor (HIF)-1 alpha in articular chondrocytes: involvement of HIF-1 alpha in the pathogenesis of osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2005;7(4):R904-R914. [26] BOHENSKY J, SHAPIRO IM, LESHINSKY S, et al. HIF-1 regulation of chondrocyte apoptosis: induction of the autophagic pathway. Autophagy. 2007;3(3):207-214.  [27] ZHANG FJ, LUO W, LEI GH. Role of HIF-1αand HIF-2αin osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2015;82(3):144-147. [28] ECKE A, LUTTER AH, SCHOLKA J, et al. Tissue Specific Differentiation of Human Chondrocytes Depends on Cell Microenvironment and Serum Selection. Cells. 2019;8(8):934. [29] LI S, WANG H, ZHANG Y, et al. COL3A1 and MMP9 Serve as Potential Diagnostic Biomarkers of Osteoarthritis and Are Associated With Immune Cell Infiltration. Front Genet. 2021;12:721258.  [30] BAYRAM B, THALER R, BETTENCOURT JW, et al. Human outgrowth knee fibroblasts from patients undergoing total knee arthroplasty exhibit a unique gene expression profile and undergo myofibroblastogenesis upon TGFβ1 stimulation. J Cell Biochem. 2022;123(5):878-892. [31] KE H, MOU X, XIA Q. Remifentanil repairs cartilage damage and reduces the degradation of cartilage matrix in post-traumatic osteoarthritis, and inhibits IL-1β-induced apoptosis of articular chondrocytes via inhibition of PI3K/AKT/NF-κB phosphorylation. Ann Transl Med. 2020;8(22):1487.  [32] REMST DF, BLOM AB, VITTERS EL, et al. Gene expression analysis of murine and human osteoarthritis synovium reveals elevation of transforming growth factor β-responsive genes in osteoarthritis-related fibrosis. Arthritis Rheumatol. 2014;66(3):647-656. [33] JANG I, BENINGO KA. Integrins, CAFs and Mechanical Forces in the Progression of Cancer. Cancers (Basel). 2019;11(5):721. [34] PICKUP MW, MOUW JK, WEAVER VM. The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer. EMBO Rep. 2014;15(12):1243-1253. [35] PRIETO TG, MACHADO-RUGOLO J, BALDAVIRA CM, et al. The Fibrosis-Targeted Collagen/Integrins Gene Profile Predicts Risk of Metastasis in Pulmonary Neuroendocrine Neoplasms. Front Oncol. 2021;11:706141.  [36] WU Y, XU Y. Integrated bioinformatics analysis of expression and gene regulation network of COL12A1 in colorectal cancer. Cancer Med. 2020; 9(13):4743-4755. [37] FLOOD HM, BOLTE C, DASGUPTA N, et al. The Forkhead box F1 transcription factor inhibits collagen deposition and accumulation of myofibroblasts during liver fibrosis. Biol Open. 2019;8(2):bio039800.  [38] LI C, LUO J, XU X, et al. Single cell sequencing revealed the underlying pathogenesis of the development of osteoarthritis. Gene. 2020;757:144939. [39] CHEN W, YANG A, JIA J, et al. Lysyl Oxidase (LOX) Family Members: Rationale and Their Potential as Therapeutic Targets for Liver Fibrosis. Hepatology. 2020;72(2):729-741.  [40] 刘荣清,孙伯坚,林佳静,等.类风湿关节炎和骨关节炎活动期赖氨酰氧化酶的比较[J].中华风湿病学杂志,2013,17(2): 95-97,插1. [41] 吴嘉钦,杨力,许康,等.赖氨酰氧化酶LOX在OA疾病发生发展中的调控作用及其干预机制研究[J].医用生物力学,2021,36(S1):21. [42] 许春明.赖氨酰氧化酶LOX在骨关节炎软骨中的调控作用及机制研究[D].重庆:重庆大学,2020. [43] YANG A, YAN X, FAN X, et al. Hepatic stellate cells-specific LOXL1 deficiency abrogates hepatic inflammation, fibrosis, and corrects lipid metabolic abnormalities in non-obese NASH mice. Hepatol Int. 2021;15(5):1122-1135. [44] TASHKANDI MM, ALSAQER SF, ALHOUSAMI T, et al. LOXL2 promotes aggrecan and gender-specific anabolic differences to TMJ cartilage. Sci Rep. 2020;10(1):20179.  [45] 周鑫,邢露,贺春霞,等.骨膜蛋白—一种有潜力的疾病早期诊断分子标志物[J].中国药理学通报,2022,38(5):650-654. [46] KKUDO A. The Structure of the Periostin Gene, Its Transcriptional Control and Alternative Splicing, and Protein Expression. Adv Exp Med Biol. 2019; 1132:7-20.  [47] 曾峰,黄建芬,余新林,等.骨膜蛋白的研究新进展[J].中国医学创新,2021,18(7):171-176. [48] BROPHY RH, TYCKSEN ED, SANDELL LJ, et al. Changes in Transcriptome-Wide Gene Expression of Anterior Cruciate Ligament Tears Based on Time From Injury. Am J Sports Med. 2016;44(8):2064-2075. [49] BROPHY RH, ZHANG B, CAI L, et al. Transcriptome comparison of meniscus from patients with and without osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2018;26(3):422-432. [50] CHOU CH, WU CC, SONG IW, et al. Genome-wide expression profiles of subchondral bone in osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2013;15(6):R190.  [51] TAJIKA Y, MOUE T, ISHIKAWA S, et al. Influence of Periostin on Synoviocytes in Knee Osteoarthritis. In Vivo. 2017;31(1):69-77. [52] 王安琪,刘云鹏,卢文卿,等.PLOD家族在肿瘤中的研究进展[J].中国医药导报,2019,16(24): 29-31+39. [53] WANG H, LUO W, DAI L. Expression and Prognostic Role of PLOD1 in Malignant Glioma. Onco Targets Ther. 2020;13:13285-13297. [54] KOENIG SN, CAVUS O, WILLIAMS J, et al. New mechanistic insights to PLOD1-mediated human vascular disease. Transl Res. 2022;239:1-17.  [55] AYDıN N, KARAISMAILOĞLU B, ALAYLıOĞLU M, et al. Gene expression profiling of primary fibrochondrocyte cultures in traumatic and degenerative meniscus lesions. J Orthop Surg (Hong Kong). 2021;29(1): 23094990211000168.

[1]	郭淑慧, 杨晔, 江杨洋, 许建文. 神经源性膀胱miRNA-mRNA调控网络的筛选与验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-8.
[2]	李晓敏, 田向东 , 谭冶彤 , 朱光宇 , 王荣田 , 王 剑 , 薛志鹏, 马 晟, 胡元一, 黄 叶, 丁天送. 骨质疏松性内侧室膝骨关节炎胫骨高位截骨后下肢力线及膝关节功能的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1325-1329.
[3]	黄林科, 韦林华, 蒋 捷, 刘 倩, 陈蔚蔚. 雌激素与跑台运动干预卵巢切除模型小鼠骨量和关节软骨的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1166-1171.
[4]	袁长深, 官岩兵, 李 哲, 容伟明, 廖书宁, 陈乐伟, 梅其杰, 段 戡. 骨关节炎坏死性凋亡关键基因的筛选与验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 695-700.
[5]	谷明西, 王 博, 田丰德, 安 宁, 郝瑞胡, 王常成, 郭 林. 同期和分期双侧全膝关节置换的早期疗效和安全性比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(4): 565-571.
[6]	郭颖奇, 宫先旭, 张 岩, 肖 寒, 王 野, 谷文光. 半月板外突与髌股关节软骨损伤及骨髓病变：MRI半定量评分的评价[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(4): 600-605.
[7]	黄钰颖, 郭 忆, 韩新祚, 闵红巍, 李雪梅, 刘克敏. 剪切波弹性超声成像测量股四头肌及肌腱弹性与膝骨关节炎功能的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(31): 4971-4976.
[8]	陈景涛, 陈 有, 李玉静, 刘志刚. 黄芪多糖抑制Toll样受体4/核因子κB p65通路治疗大鼠膝骨关节炎[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(31): 5002-5008.
[9]	陈建超, 宋会平. 绝经后膝骨关节炎患者不同部位的骨量分布特征[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(31): 5035-5039.
[10]	杨超强, 张虎林, 汪小敏, 王 亮, 王宜灿. 中医药调控巨噬细胞防治骨相关疾病[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(31): 5064-5070.
[11]	陈昌美, 曾宪春, 王荣品, 吴家红. X射线评价正常膝关节解剖学参数的性别及年龄差异[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4647-4651.
[12]	黎少聪, 何 琪, 潘兆丰, 杨均政, 陈柏豪, 王海彬, 周 驰. Micro-CT评价铁超载影响膝骨关节炎模型小鼠软骨类组织的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4658-4663.
[13]	马 威, 庞 坚, 张洁帆, 许 坤, 王用玉, 张 旻, 陈 博, 石 瑛, 詹红生. 膝骨关节炎患者跌倒恐惧影响因素分析及列线图模型构建[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4690-4695.
[14]	韦宗波, 苏允裕, 章晓云, 黄 为, 许 航, 刘荣发. 长链非编码RNA调控膝骨关节炎中软骨下骨稳态的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4736-4744.
[15]	周广智, 邰东旭. 踝关节骨关节炎动物模型构建的研究与进展[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4745-4750.

骨关节炎是一种常见的退行性疾病，好发于负重关节及活动量较多的关节，如颈椎、腰椎、膝关节、髋关节等。在临床上膝骨关节炎最为常见，发病群体以老年人为主，女性发病率高于男性，常见的临床症状包括膝关节疼痛、膝关节僵硬和肿胀等[1-2]。骨关节炎不仅严重影响了患者的生活质量，还给社会带来了沉重的经济负担。
目前，骨关节炎的发病机制尚不明确，相关的研究报道指出，骨关节炎的发病与软骨代谢稳态失衡、软骨下骨硬化和滑膜炎症有着密切的联系，多种细胞参与了疾病的过程，如巨噬细胞、T细胞、软骨细胞、骨髓间充质干细胞、破骨细胞等[3]。近年来的研究表明，软骨细胞的纤维化[4]、肥大、衰老等过程对骨关节炎的发生发展有着重要的影响[5]。在膝关节内，除了覆盖在骨骼表面的透明软骨能通过减缓关节表面的摩擦来保护膝关节之外，还有由纤维软骨组成的半月板。半月板具有一定的弹性，具有缓冲重力的能力，在保护关节面发挥了重要作用。半月板损伤可导致膝关节骨关节炎发生，同时在膝关节骨关节炎疾病过程中也可导致半月板损伤及退变[6]，由此可见，半月板在骨关节炎疾病进程中的作用不容忽视。已有研究发现，半月板损伤的基因表达与早期软骨病变存在关联[7]，半月板的基因表达可能对骨关节炎的发生发展有重要影响。然而，目前较少研究探讨半月板细胞在骨关节炎疾病进程中的机制，故研究半月板细胞对了解骨关节炎的疾病机制有重要的意义。
生物信息学是一门新兴的交叉学科，结合了生物学与计算科学，在揭示疾病的分子机制中具有重要意义。基因芯片，又称为DNA微阵列，是通过微阵列技术将高密度DNA片段阵列以一定的排列方式使其附着在玻璃、尼龙等材料上面。近年来，基因芯片技术被广泛用于收集疾病的表达谱数据。Hub基因是基于生物信息学分析筛选出的关键基因，在疾病发生发展中发挥至关重要的作用，常作为疾病的潜在治疗靶点。近年来，为探寻骨关节炎诊疗的新标志物，研究者使用生物信息学分析方法，在骨关节炎滑膜组织[8-9]、软骨下骨组织[10]、软骨细胞[11]、外周血淋巴细胞相关数据集中筛选差异表达基因[12]，进行通路富集分析及关键基因筛选。显著富集的通路为了解骨关节炎疾病机制提供了新思路，筛选出的关键基因有望成为日后骨关节炎诊疗的新靶点。
此次研究选用了骨关节炎半月板组织的数据集，筛选了差异表达基因进行通路富集分析、构建蛋白-蛋白互作网络及筛选Hub基因，并用白细胞介素1β干预半月板细胞来建立骨关节炎症模型，验证Hub基因的表达，为日后了解骨关节炎的发展提供新的见解。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   生物信息学分析结合体外细胞实验验证，两组间比较使用t检验。
1.2   时间及地点   实验于2022年1-5月在广州中医药大学岭南医学研究中心进行。
1.3   材料
1.3.1   实验试剂   DMEM培养基(美国GIBCO公司，货号：8121547)；特级胎牛血清(武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：164210-50)；胶原酶Ⅱ(北京索莱宝科技有限公司，货
号：9001-12-1)；0.25%胰蛋白酶-EDTA和青霉素-链霉素(苏州新赛美生物科技有限公司，货号：C100C1和C100C5)；细胞因子Recombinant Rat 白细胞介素1β(美国Pepro Tech公司，货号：400-01B)；RNAEx ZOL总RNA提取试剂(Trizol)和RNA提取辅助试剂(广州亿涛生物科技有限公司，货号：EK-5301和ES-8522)；反转录体系Evo M-MLV RT Premix for qPCR和qPCR体系SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit Low Rox Plus(湖南艾科瑞生物工程有限公司，货号：AG11707和AG11720)。
1.3.2   实验仪器   离心机(5810R，德国艾本德公司)；倒置显微镜(DMI3000B，德国Leica公司)；超净工作台(ZHJH-C1109，上海智城分析仪器制造有限公司)；恒温水浴锅(Quintix513-1CN，赛多利斯科学仪器北京有限公司)；荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems QuantStudio 5，美国Thermo Fisher公司)；梯度PCR仪(T100，美国BIO-RAD公司)；低温离心机(5424R，德国艾本德公司)；倒置显微镜(DMI3000B，德国Leica公司)；医用离心机(TDL-mini6K，山东百欧医疗科技有限公司)；微量紫外分光光度计(ND2000，美国Thermo Fisher公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   差异表达基因的生物信息学筛选及分析
数据集获取：GEO(Gene Expression Omnibus)是由美国国立生物技术信息中心NCBI创建并维护的基因表达数据库，是一个公共的、具有功能性的基因组学数据库，供用户查询和下载相关的基因表达数据。在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中搜索与骨关节炎相关芯片，搜索的关键词为“osteoarthritis”，筛选条件为“Expression profiling by array”和“Homo sapiens”，获得GPL20844平台上由 BROPHY等[13]提供的芯片数据集GSE98918。
数据处理及差异表达基因的筛选：GEO2R是一个交互式网络工具，使用来自Bioconductor的GEOquery和limma R包，用于比较GEO数据集中的两组或多组样本，以识别在不同实验条件下表达差异的基因。使用GEO2R分析获得差异表达基因列表，下载列表后，使用R语言devtools包和ggbiplot包进行主成分分析(PCA)，使用Excel表格筛选差异表达基因，条件为adj.P. Value < 0.05，|log FC|> 1，获得符合筛选条件的差异表达基因，分别使用R语言ggplot2包和pheatmap包绘制火山图和热图。
GO分析和KEGG分析：基因本体(gene ontology，GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析常用于差异表达基因的功能富集分析。在GENE ONTOLOGY(http://geneontology.org/)网站上对差异表达基因进行GO分析，分别对生物过程、细胞成分、分子功能进行富集分析；在DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中对差异表达基因进行KEGG富集分析，P < 0.05为结果有意义。
基因集富集分析：基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)是一种计算方法，以确定一组预先定义的基因是否在两种生物状态之间显示统计学上显著的差异。使用软件GSEA 4.2.3对数据集GSE98918所有基因表达数据进行GSEA分析，随机组合设置为100次，筛选条件为P < 0.05，|NES|>1，获得差异较显著的信号通路。
蛋白互作网络构建及Hub筛选：将筛选出的差异表达基因结果在string网站(https: //www.string-db.org)上分析，“minimum required interaction score”设置为0.4，获得蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)结果，下载TSV格式文件。使用Cytoscape软件中的MCODE插件对PPI网络进行功能模块分析，并在DAVID数据库分别对SCORE值排名前三的功能模块进行KEGG通路富集分析，P < 0.05为有统计学意义。使用Cytoscape软件对蛋白互作结果进行拓扑分析，利用CytoHubba插件，选择使用MCC算法，筛选评分最高的10个Hub基因。
1.4.2   体外实验验证Hub基因的表达
大鼠半月板细胞的提取：SPF级SD大鼠3只，雄性，4周龄，体质量80-100 g，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2018-0002。实验获得广州中医药大学实验动物伦理委员会批准。腹腔注射2%戊巴比妥钠(2 mL/kg)
麻醉大鼠，麻醉后用体积分数75%乙醇喷湿大鼠，置于岭南医学研究中心小动物手术室的超净台中，剪开大鼠皮肤，取双侧下肢放入含有3%青霉素-链霉素的PBS中暂存；随后转移入细胞房超净台，在培养皿里剔除膝关节周围的肌肉和韧带，暴露膝关节腔，用眼科剪、手术刀取出半月板，用PBS洗半月板组织3次后，把组织修剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，把剪碎后的组织块移入T25培养瓶，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶，在37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱消化1 h；随后加入等体积0.2%胶原酶Ⅱ，在培养箱中消化4 h(每1 h取出培养瓶摇晃2.0-3.0 min)，消化后加入等体积DMEM/F12+体积分数10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素培养基终止消化，吹打重悬，吸取上清过100 μm细胞筛，室温1 200 r/min离心10 min，接种到T25培养瓶中，放入培养箱中培养。细胞贴壁后，每2 d或3 d换一次液，按1∶3的比例传代。使用第2-5代细胞进行实验。
细胞分组与处理：研究表明，细胞因子白细胞介素1β用于刺激软骨细胞，通过提高基质金属蛋白酶、透明质酸酶和聚糖酶来对关节软骨进行酶降解[14]，以诱导骨关节炎表型。此次实验使用白细胞介素1β刺激半月板细胞来构建骨关节炎模型。将大鼠半月板细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板中，24 h后用PBS洗2次，对照组加入DMEM+体积分数10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素，实验组加入DMEM+体积分数10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素和10 ng/mL白细胞介素1β，每组3个复孔，干预24 h。

RT-qPCR检测：干预24 h后，用RNAEx ZOL总RNA提取试剂提取RNA。提取RNA后用紫外分光光度计测量RNA的浓度及纯度。用Evo M-MLV RT Premix for qPCR体系反转录成cDNA，使用SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit (Low Rox Plus)体系在荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR，检测Hub基因mRNA的表达。引物序列如表1，以GAPDH作为内参，计算2-ΔΔCt值和P值，比较基因的相对表达量。

1.5   主要观察指标   差异表达基因的生物信息学分析及RT-qPCR检测Hub基因的表达。
1.6   统计学分析   结果均使用GraphPad Prism 8进行分析，以x±s表示。两组间比较使用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经广州中医药大学生物统计学专家审核。

如今，骨关节炎是世界性疾病，据估计，全球大约3 亿人患有骨关节炎[15]，主要包括髋关节和膝关节骨关节炎。自1990年以来，年龄标准化患病率、发病率和残疾损失生命年增加了8%-10%[16]。随着中国人口老龄化的加剧，骨关节炎发病率呈逐渐上升的趋势，骨关节炎会导致患者关节疼痛、功能丧失和生活质量下降，是老年人残疾的主要原因。骨关节炎不仅严重影响了患者的生活，还给家庭和社会带来了沉重的精神压力和经济负担。骨关节炎的发病机制复杂，涉及了多种细胞和分子机制，由于缺乏能停止或减缓关节组织变化的病因性治疗，目前对骨关节炎的治疗多以对症治疗为主，主要使用止痛药和消炎药[17]。因此，此次研究基于生物信息学筛选与骨关节炎相关的关键基因，再用体外细胞实验加以验证，对寻找治疗骨关节炎的潜力靶点有重要意义。
此次研究通过GEO数据库筛选出骨关节炎的相关数据集，通过多种富集分析方法如GSEA、GO、KEGG，对基因进行富集分析，显著富集的生物过程和通路等对了解骨关节炎提供了更详细的分子机制。通过KEGG和GSEA通路富集分析发现，相关基因主要在辅助性T细胞17 (Th17)细胞分化和白细胞介素17通路中显著富集。Th17是新发现的可分泌白细胞介素17的T细胞亚群，Th17是在白细胞介素6和白细胞介素23刺激下从幼稚T细胞分化而来的辅助性T细胞，主要分泌白细胞介素17、白细胞介素22等促炎因子，在炎症性疾病中起重要作用[18]。已有研究证明，骨关节炎滑膜组织中的T细胞和B细胞数量高于健康对照组，研究者认为在评估免疫细胞和炎症细胞的作用时，T细胞在骨关节炎疾病进展中的作用是一个新兴的研究领域[19-20]。GSEA、GO和功能模块的KEGG富集分析结果均表示骨关节炎相关基因与细胞外基质有密切联系。在骨关节炎中，细胞外基质的破坏被认为是疾病的标志。细胞外基质在许多过程中均发挥着重要作用，包括细胞间黏附、信号传导和组织修复[21]。细胞外基质的成分和结构的完整性对于软骨组织的正常功能至关重要。在膝关节软骨中，细胞外基质富含胶原蛋白、蛋白聚糖和其他含量较低的成分，如纤维蛋白和弹性蛋白。细胞外基质的降解是骨关节炎患者软骨组织丢失的基础，且随着骨关节炎的发展，细胞外基质的组成和结构也会发生变化，如在骨关节炎晚期会出现胶原蛋白降解、蛋白多糖组分丢失[22-23]。GSEA富集分析显示，骨关节炎相关基因富集在缺氧诱导因子1亚基α通路上。据研究报道，缺氧诱导因子1亚基α在骨关节炎软骨中表达增加，以介导软骨细胞对缺氧的反应[24]。缺氧诱导因子1亚基α的表达增加可促进细胞外基质的合成和抑制细胞凋亡，在软骨稳态中至关重要[25-27]。
此次研究进一步通过Cytoscape软件对蛋白互作结果进行拓扑分析，构建PPI网络，利用插件CytoHubba，选用了性能较优的MCC算法，筛选出评分最高的10个Hub基因，分别为COL1A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2、COL6A3、LOX、LOXL1、LOXL2、POSTN、PLOD1。
GO分析结果所示，差异表达基因在胶原纤维组织、含有胶原蛋白的细胞外基质、胶原蛋白三聚体中显著富集，可见胶原蛋白在骨关节炎的疾病进程中发挥了重要的作用。COL1A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2、COL6A3均属于胶原蛋白家族。胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，约占蛋白总量的30%，是细胞外基质的主要组成部分。胶原的共同结构特征是存在三螺旋结构。Ⅰ型胶原是一种形成纤维的胶原蛋白，在大多数结缔组织中都有发现，其中在骨骼、角膜、真皮和肌腱中含量丰富。COL1A1编码Ⅰ型胶原蛋白的α1链，研究发现COL1A1与软骨细胞去分化和纤维化有关，在骨关节炎软骨缺损中，重塑的软骨表现出纤维化特征，Ⅰ型胶原和α-SMA表达水平发生改变[4，28]。COL3A1编码Ⅲ型胶原蛋白的α1链，Ⅲ型胶原蛋白是一种纤维状胶原蛋白，常见于可扩张、延展的结缔组织，如皮肤、肺、子宫、肠和血管系统，常与Ⅰ型胶原蛋白有关。LI等[29]研究表明COL3A1和MMP9的基因和蛋白表达水平与炎症程度和炎症活动相关。BAYRAM等[30]研究发现在转化生长因子β1存在下，随着胶原基质沉积，COL1A1和COL3A1 mRNA表达增加。然而，COL1A1在骨关节炎中的差异表达仍存有争议，COL1A1为骨形成的相关蛋白，创伤后骨关节炎的疾病过程中伴随着软骨和骨小梁含量的减少，KE等[31]的研究结果显示，创伤后骨关节炎模型大鼠COL1A1的表达水平明显受到抑制。COL1A1和COL3A1在骨关节炎中表达趋势的差异可能与疾病进程和不同的模型建立方法有关。基因COL5A1、COL5A2编码一种低丰度纤维状胶原蛋白的α链，Ⅴ型胶原蛋白存在于含有Ⅰ型胶原蛋白的组织中。经REMST等[32]证实，COL5A1的表达与细胞外基质更新、滑膜纤维化有关。据报道，细胞外基质构成了肿瘤微环境的支架，并调节肿瘤的发生发展[33-34]。COL5A2的差异表达影响细胞外基质受体的相互作用，与肺神经内分泌肿瘤的转移[35]、结直肠癌的预后相关[36]，也有研究证明该基因与细胞外基质过度沉积导致的肝纤维化有关[37]，但该基因在骨关节炎疾病中仍缺少相关研究。COL6A3基因编码α3链，Ⅵ型胶原蛋白是一种珠状丝状胶原蛋白，存在于大多数结缔组织中，Ⅵ型胶原蛋白的α3链比α1和α2链大，很大程度上是由于子结构域数量的增加，这些结构域已被证明与细胞外基质蛋白结合。已经证实，COL6A3参与骨关节炎的进展，有研究认为骨关节炎软骨细胞COL6A3的差异表达可能影响骨关节炎纤维化进程[38]。综上可见，胶原蛋白与细胞外基质有着密切联系，胶原家族基因在骨关节炎的发生发展中发挥了非常关键的作用。
赖氨酰氧化酶(LOX)是一种铜依赖性胺氧化酶，由基因LOX编码。LOX基因家族包含了5个成员，分别是LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL3、LOXL4。LOXs编码的酶的活性在细胞外基质蛋白如胶原蛋白和弹性蛋白的交联中起作用，与纤维化进展密切相关[39]，对细胞外基质结构的调控和功能重塑有关键作用。刘荣清等[40]研究发现，类风湿关节炎和骨关节炎活动期患者膝关节滑膜中的LOX蛋白表达量均高于膝外伤患者，骨关节炎组的基因表达趋势与此次研究结果一致，研究者认为基因的表达差异可能与慢性滑膜炎、软骨骨质破坏和重建及其程度有关。但LOX在骨关节炎和正常组织中的差异表达存在争议。有研究表明，骨关节炎软骨组织中LOX表达显著下调，伴随着软骨形态的松散和软骨完整性被破坏。有研究表明，外源LOX可逆转肿瘤坏死因子α诱导的细胞增殖停滞和细胞凋亡，抑制肿瘤坏死因子α诱导的炎症响应，这说明了LOX有利于炎症的治疗和软骨的重塑[41-42]。LOXL1、LOXL2是赖氨酰氧化酶蛋白家族的成员，已有研究证明LOXL1与肝纤维化有关，研究者认为LOXL1是抗纤维化的潜力靶点[39，43]。TASHKANDI等[44]发现LOXL2在小鼠骨折愈合期间的再生反应中升高，并在软骨分化中发挥关键作用。如今LOX基因家族和骨关节炎相关的研究仍较少，但以上研究表明了LOXs可能参与纤维化、软骨重塑、抑制细胞凋亡等过程，从而影响疾病的发展，作者认为LOXs有望成为骨关节炎治疗的潜力靶点。
骨膜蛋白由基因POSTN编码，是一种在骨组织中发现的分泌型细胞外基质蛋白[45]，其通过与细胞外基质相互作用，从而对各种生理过程进行调控[46]。POSTN在正常关节软骨组织中表达较低，当骨关节炎发生时，由于关节面的不稳定等因素导致POSTN表达增高[47]，与此次研究基因表达趋势一致。该数据集原文研究表明，POSTN在半月板中的表达与软骨组织中表达不同，研究数据显示终末期骨关节炎患者半月板中POSTN表达降低，但作者也提出了半月板中POSTN的表达变化可能与骨关节炎的疾病进程有关[48-49]。研究表明，POSTN参与了成骨细胞的重塑、软骨细胞退化等进程[50-51]，由此可见，POSTN在骨关节炎疾病的研究中有重要价值。
PLOD基因家族包括PLOD1、PLOD2、PLOD3 3个成员，PLOD1基因编码赖氨酸羟化酶1(LH1)[52]，该酶催化胶原蛋白样肽中赖氨酰残基的羟基化，生成的羟基基团是胶原蛋白中碳水化合物的附着位点，该酶促进细胞外基质分子间交联，有利于细胞外基质结构的稳定和成熟。近年来，许多研究报道了PLOD1在其他疾病的作用，如恶性胶质瘤[53]、胸主动脉瘤[54]，但仍缺少有骨关节炎相关的研究报道。
纤维软骨细胞是维持半月板结构主要的细胞，同时具有成纤维细胞和软骨细胞的特征[55]，但其在骨关节炎疾病中的机制研究仍较少。此次研究基于生物信息学筛选与骨关节炎相关的差异表达基因，并进行通路富集分析，其中免疫反应、细胞外基质、胶原蛋白等相关生物学功能和通路的显著富集，为了解骨关节炎的发生和发展提供了更详细的分子机制。此次研究进一步筛选出10个评分最高的Hub基因，结合半月板细胞的培养及干预，对Hub基因的表达进行了qPCR验证，其中，POSTN、胶原蛋白家族中的COL5A1、COL5A2、COL6A3以及LOX家族基因在骨关节炎的研究中较少涉及，此次研究对Hub基因的筛选及验证可能为骨关节炎的靶向治疗提供新的见解。研究也存在不足之处，虽进行了体外细胞实验以验证Hub基因的表达，但体外实验有一定的局限性，往后应进行体内实验进一步验证。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

Hub基因： 是基于生物信息学分析筛选出的关键基因，在疾病发生发展中发挥至关重要的作用，常作为疾病的潜在治疗靶点。
生物信息学：是一门新兴的交叉学科，结合了生物学与计算科学，在揭示疾病的分子机制中具有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

近年来，在骨关节炎相关研究中，体外细胞实验多以滑膜细胞、透明软骨细胞作研究，对于半月板细胞的研究仍较少，此次研究可为日后对半月板细胞在骨关节炎发生发展的机制研究提供新的依据。此次研究基于生物信息学分析筛选骨关节炎Hub基因，其中部分关键基因在骨关节炎的研究中涉及较少，功能未被完全阐明，通过提取大鼠半月板细胞进行qPCR验证Hub基因的表达，为日后骨关节炎机制的研究、疾病的治疗和预后提供新思路。研究中使用多种生物信息学工具如R语言、cytoscape进行可视化分析，帮助读者更直观地获取信息。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

	阅读次数
	全文
	摘要