绝经后骨质疏松症潜在铁死亡及细胞焦亡相关诊断生物标志物

doi:10.12307/2024.493

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (28): 4511-4515.doi: 10.12307/2024.493

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绝经后骨质疏松症潜在铁死亡及细胞焦亡相关诊断生物标志物

李树栋1，梁学振1，2，骆帝2，李嘉程1，2，阎博昭1，李刚1，2

1山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250014；2山东中医药大学附属医院，山东省济南市 250014

收稿日期:2023-07-27 接受日期:2023-09-22 出版日期:2024-10-08 发布日期:2023-11-27
通讯作者: 李刚，博士，教授，主任医师，山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250014；山东中医药大学附属医院，山东省济南市250014
作者简介:李树栋，男，1990年生，山东省滨州市人，汉族，硕士，主要从事代谢性骨病的临床与基础研究。
基金资助:
山东省重点研发计划项目(重大科技创新工程)(2021CXG0105010)，项目负责人：李刚；山东省自然科学基金资助项目(ZR2020KH012)，项目负责人：李刚

Identification of biomarkers associated with ferroptosis and pyroptosis for the potential diagnosis of postmenopausal osteoporosis

Li Shudong1, Liang Xuezhen1, 2, Luo Di2, Li Jiacheng1, 2, Yan Bozhao1, Li Gang1, 2

1First Clinical Medical School, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; 2Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China

Received:2023-07-27 Accepted:2023-09-22 Online:2024-10-08 Published:2023-11-27
Contact: Li Gang, MD, Professor, Chief physician, First Clinical Medical School, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China; Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
About author:Li Shudong, Master, First Clinical Medical School, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
Supported by:
Shandong Provincial Key R&D Program (Major Science and Technology Innovation Project), No. 2021CXG0105010 (to LG); Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2020KH012 (to LG)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

铁死亡：于2012年提出的一种由脂质过氧化驱动、受调节的铁依赖性细胞程序性死亡方式，其本质是谷胱甘肽耗尽、谷胱甘肽过氧化物酶活性降低，脂质氧化物无法发生还原反应，Fe2+氧化脂质产生活性氧，诱导铁死亡发生。铁死亡广泛参与了肌肉骨骼疾病的发生发展进程，在防治绝经后骨质疏松症方面具有巨大潜力。

细胞焦亡：是一种新的细胞裂解性程序性死亡方式，主要表现为细胞胀大导致细胞膜破裂，释放细胞内容物进而激活炎症反应。细胞焦亡的机制分为经典途径和非经典途径，经典途径主要依赖于Caspase-1，非经典途径则主要依赖于Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11。成骨细胞焦亡可能是绝经后骨质疏松症的发病机制之一，基于细胞焦亡的绝经后骨质疏松症治疗策略是新的研究方向。

背景：铁死亡及细胞焦亡可能在绝经后骨质疏松症的发生发展过程中起到作用，可能存在诊断绝经后骨质疏松症的相关生物标志物。
目的：利用生物信息学手段寻找绝经后骨质疏松症过程中铁死亡及细胞焦亡相关的关键基因，以进一步阐明其生物学机制。
方法：使用美国国家基因表达综合数据库(GEO数据库)下载绝经后骨质疏松症的数据集GSE56815和GSE7429，对两数据集进行预处理，借助R软件limma包进行数据差异表达分析，通过DIVID、KOBAS数据库进行富集分析，借助STRING、Cytoscape绘制蛋白互作网络，通过CytoHubba选取Hub基因，通过铁死亡基因数据库及细胞焦亡数据库筛选关键基因。利用CIBERSORT包测定绝经后骨质疏松症样本的免疫浸润情况，进行关键基因与免疫细胞的相关性分析。

结果与结论：①于实验样本中共计筛选出30个绝经后骨质疏松症的差异基因，其中9个基因表达上调，21个基因表达下调；②GO、KEGG通路富集显示差异主要集中在丝氨酸型内肽酶活性、先天免疫反应、特殊颗粒管腔、肾素分泌等；③PPI网络显示差异基因的相关性，CytoHubba选出Degree值前10的Hub基因；④Hub基因与FerrDb铁死亡数据库及细胞焦亡数据集取交集得到关键基因ELANE、LCN2；⑤受试者工作特征曲线及箱图表明，ELANE、LCN2在绝经后骨质疏松症血清样本中的表达较正常样本明显降低，具有良好的诊断价值；⑥免疫浸润分析显示，ELANE可能与记忆性静息CD4 T细胞、M0巨噬细胞、M2巨噬细胞有关，LCN2可能与M0巨噬细胞有关。

https://orcid.org/0009-0009-1052-9382(李树栋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 铁死亡, 细胞焦亡, 绝经后骨质疏松, 生物信息学, 生物标志物, 免疫浸润

Abstract: BACKGROUND: Ferroptosis and pyroptosis may play a role in the development of postmenopausal osteoporosis. There may be relevant biomarkers for the diagnosis of postmenopausal osteoporosis.
OBJECTIVE: To search for the key genes related to ferroptosis and pyroptosis in postmenopausal osteoporosis using bioinformatics so as to further elucidate their biological mechanisms.
METHODS: The data sets GSE56815 and GSE7429 of postmenopausal osteoporosis were downloaded from the GEO database, the national comprehensive gene expression database of the United States, and the two data sets were preprocessed. The differential expression analysis of the data was carried out by the limma package of R software, and the enrichment analysis was performed by DIVID and KOBAS. The protein-protein interaction network was mapped by STRING and Cytoscape, the Hub gene was selected by CytoHubba, and the key genes were screened by the ferroptosis database and pyroptosis database. The CIBERSORT package was used to determine the immune infiltration of postmenopausal osteoporosis samples and to analyze the correlation between key genes and immune cells
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 30 differential genes of postmenopausal osteoporosis were screened in the experimental samples, of which 9 genes were up-regulated and 21 genes were down-regulated. The enrichment of GO and KEGG pathways showed that the differences were mainly in “serine-type endopeptidase activity,” “innate immune response,” “special particle lumen,” and “renin secretion.” The protein-protein interaction network showed the correlation of differential genes and the top 10 Hub genes with “Degree” value were selected using CytoHubba. Hub gene was intersected with the FerrDb database and cell pyroptosis dataset to obtain key genes ELANE and LCN2. Receiver operating characteristic curve and box diagram showed that the expression of ELANE and LCN2 in serum samples of postmenopausal osteoporosis was significantly lower than that in normal samples, indicating a good diagnostic value. Immune infiltration analysis showed that ELANE may be related to memory resting CD4+ T cells, M0 and M2 macrophages. LCN2 may be related to M0 macrophages.

Key words: ferroptosis, pyroptosis, postmenopausal osteoporosis, bioinformatics, biomarker, immune infiltration

中图分类号:

李树栋, 梁学振, 骆帝, 李嘉程, 阎博昭, 李刚. 绝经后骨质疏松症潜在铁死亡及细胞焦亡相关诊断生物标志物[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4511-4515.

Li Shudong, Liang Xuezhen, Luo Di, Li Jiacheng, Yan Bozhao, Li Gang. Identification of biomarkers associated with ferroptosis and pyroptosis for the potential diagnosis of postmenopausal osteoporosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(28): 4511-4515.

图/表（结果） 5

2.1 筛选差异基因对数据集(GSE56815)和数据集(GSE7429)进行数据差异表达分析，共找出30个差异基因，其中9个上调基因、21个下调基因，见图1。

2.2 GO、KEGG富集分析 DAVID分析共得到43个GO富集条目，其中包括21个生物过程(biological process，BP)条目，10个细胞组分(cell component，CC)条目，11个分子功能(molecular function，MF)条目，生物过程主要集中在丝氨酸型内肽酶活性、铁离子结合、相同蛋白结合等。细胞组分主要富集在特定颗粒腔、胞外区、三级颗粒管腔等。分子功能主要集中在先天免疫反应、对细菌的防御反应、抗真菌体液反应等。使用KOBAS进行KEGG分析得到10个富集条目，主要富集在肾素分泌、系统性红斑狼疮等，见图2。

2.3 蛋白互作网络构建、筛选生物标志物通过 STRING数据库构建差异基因的蛋白互作网络， CytoHubba 插件取Degree值最大的前10个基因，即ELANE、CAMP、LTF、S100A12、LCN2、ARG1、MMP8、DEFA4、CEACAM8、HP。网络由10个节点和34条边组成(图3A)。取FerrDb 数据库中铁死亡相关基因与差异基因映射得到潜在基因LCN2，33个细胞焦亡相关基因与差异基因映射得到潜在基因ELANE(图3B)。

2.4 绘制箱图及受试者工作特征曲线验证作箱图比较ELANE、LCN2在健康样本与PMOP样本中的表达情况，结果显示PMOP样本中ELANE、LCN2均显著下调(图4)。进一步对ELANE、LCN2进行受试者工作特征曲线分析得到其ELANE(曲线下面积AUG=0.664)、LCN2(曲线下面积AUG=0.704)，证明ELANE、LCN2能够较为准确地诊断PMOP，存在潜在的诊断价值。

2.5 ELANE与LCN2免疫浸润特征通过CIBERSORT算法分析PMOP样本中免疫浸润特征，其在PMOP患者样本和健康样本上的组成以及免疫细胞之间的关系如图5A-C所示。研究PMOP患者标本和健康人群标本中的ELANE、LCN2表达水平以及免疫细胞浸润状态以确定两者之间的关系。免疫细胞浸润分析显示，ELANE与免疫细胞M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、记忆性静息CD4 T细胞相关(图5D)，LCN2与免疫细胞 M0巨噬细胞相关(图5E)。这提示ELANE、LCN2可能通过调节多个免疫细胞参与了PMOP的进展，这表明ELANE、LCN2可能成为潜在的诊断PMOP的生物标志物。

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引言

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是由雌激素缺乏引起的全身性骨骼疾病，是全球最常见的疾病之一，其特征为骨密度降低、骨的微观结构恶化[1]。研究表明，雌激素能够在促进成骨分化、成骨细胞成熟的同时抑制破骨细胞形成，使得骨的形成和吸收达到平衡状态。女性绝经后雌激素水平下降，骨的平衡状态被改变，导致PMOP发生[2]。PMOP极大增加了脊柱、髋部、腕部等部位的骨折风险，成为困扰人类健康的又一严重的公共卫生问题[3]。骨密度测定是诊断PMOP的主要手段，但其诊断与应用存在一定局限性[4]。近年来，研究者试图从炎症系统、基因等方面寻找新的诊断方式并阐述PMOP的发病机制[5-7]，但其发生发展过程受到多因素、多阶段共同调控，涉及多种相互作用，具体发病机制尚未完全明确。
铁死亡、细胞焦亡、免疫细胞与骨骼系统存在密切联系[8-11]。铁死亡是2012年由STOCKWELL[12]提出的一种具有铁依赖性、非凋亡性的细胞程序性死亡模式，其特征是脂质活性氧的积累。ZHANG等[13]的研究认为，铁死亡过程中积累的脂质活性氧能够激活细胞内多种信号通路，进而促进骨的吸收、抑制骨的形成。细胞焦亡是1992年由
ZYCHLINSKY等提出的，被细胞死亡命名委员会(Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD)定义的由Gasdermin介导的细胞裂解性程序性死亡[14]。TAO等[15]的研究发现，在细胞焦亡过程中白细胞介素1β和白细胞介素18的前体被Caspase-1加工，白细胞介素1β和白细胞介素18等可直接或间接促进造血干细胞和前破骨细胞分化为成熟破骨细胞，使破骨细胞过度形成，导致骨吸收和骨重塑失衡。作为免疫器官之一，骨髓能够生成多种免疫细胞，这些免疫细胞与骨骼系统的细胞相互作用共同调控着骨代谢[10，16]。FISCHER等[17]的研究表明，雌激素水平下降时可诱发淋巴T细胞活化作用于骨髓间充质干细胞及成骨细胞以改变骨的平衡状态。上述研究表明，铁死亡、细胞焦亡、免疫细胞可能与PMOP的发病机制密切相关，通过药物或遗传手段影响PMOP中的铁死亡、细胞焦亡、免疫细胞状态可能是新的治疗策略。但PMOP的分子机制尚未明确，仍需要通过进一步研究探索其关键基因和作用机制。
PMOP的发生发展受到多因素共同调控。作为细胞死亡的常见方式，铁死亡及细胞焦亡同样被认为与免疫系统存在着密切联系[18]。此次实验借助生物信息学方法筛选铁死亡及细胞焦亡相关基因，评估免疫细胞浸润水平并进行相关性分析，有助于探索PMOP发生发展的分子机制，进一步揭示免疫系统与绝经后骨质疏松症的作用机制，为临床诊疗PMOP提供可能的潜在生物标志物和新的免疫治疗靶点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分子生物信息学实验，免疫浸润分析。
1.2 时间及地点实验于2023年5-6月在山东中医药大学第一临床医学院中医骨伤教研室完成。
1.3 资料
数据收集：通过 FerrDb 数据库(http://www.zhounan.org/ferrdb/current/)下载与铁死亡相关的基因数据库。在PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行文献检索，选取相关文章常用的33个细胞焦亡相关基因定义为细胞焦亡基因。于美国国家基因表达综合数据库(GEO数据库)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中筛选PMOP患者和健康人群患者的相关芯片数据，排除动物模型。得到数据集GSE56815及GSE7429。数据集共包含PMOP样本30例及健康人群样本30例。
1.4 方法
1.4.1 数据集中的差异基因表达分析使用R软件对样本数据集GSE5681和GSE7429进行预处理，使用“Limma”R包进行差异分析，差异筛选标准设定为 |log2 fold change (FC)|> 1.2，adj.P < 0.05，通过“pheatmap” R包及“ggplot2”R包对筛选得到数据进行可视化。
1.4.2 功能富集分析通过 DIVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对差异基因的基因本体论 (gene ontology，GO)通路进行富集分析，使用KOBAS数据库(http://bioinfo.org/kobas)对差异基因的京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路进行富集分析，通过“ggplot2”R包进行可视化。
1.4.3 构建蛋白互作网络及筛选Hub 基因通过 STRING 数据库 (https://www.string-db.org/)进行蛋白互作分析(protein-protein interaction，PPI)，confidence评分> 0.4。通过 CytoHubba 插件利用拓扑网络算法挖掘 Hub 基因，筛选出前10个基因确定为Hub基因。
1.4.4 筛选生物标志物绘制受试者工作特征曲线将从FerrDb数据库中得到的铁死亡相关基因及33个细胞焦亡相关基因分别与Hub基因取交集，筛选出候选生物标志物，通过“pROC”包绘制受试者工作特征曲线，分析筛选基因的表达情况，进一步确定其诊断价值。
1.4.5 CIBERSORT分析使用R软件中的“CIBERSORT”包，通过CIBERSORT算法进行反卷积分析，评估样本中22个免疫细胞的免疫浸润情况，观察潜在生物标志物在绝经后骨质疏松症患者样本及健康样本中免疫细胞的差异表达情况，分析其免疫浸润特征。
1.5 主要观察指标利用生物信息学手段寻找绝经后骨质疏松症过程中铁死亡及细胞焦亡相关的关键基因。

讨论

PMOP是一种好发于女性绝经期后的常见骨代谢疾病，其主要发病原因是雌激素缺乏、吸烟等导致的钙流失[19]。作为多系统参与的代谢性疾病，PMOP发病机制已不再是单纯的“雌激素缺乏-骨代谢紊乱-骨质流失”模式，其与雌激素缺乏诱导的氧化应激、铁过载等多因素相关[20]。多靶点诊疗方式是治疗PMOP的新思路。因此，及时诊断PMOP显得尤为重要，而临床实践中仍然缺乏早期诊断手段。
高通量数据库的建立为发掘此类疾病的潜在生物标志物提供了有效数据支撑[21-22]，基于高通量数据研究最终得到关键基因LCN2和
ELANE。ELANE是由中性粒细胞表达的弹性蛋白酶编码基因，是人类的6个弹性蛋白酶编码之一。同时ELANE能够介导中性粒细胞中GSDMD的裂解来促进细胞焦亡，是细胞焦亡发生的重要基因[23]。关于ELANE的研究囊括了中性粒细胞减少症范围、癌症、支气管扩张、神经胶质瘤、骨骼肌肉疾病等各个领域[24-27]。FANG等[28]的研究认为，ELANE与成骨相关通路如过氧化物酶体增殖物激活受体、白细胞介素17和PI3K/AKT密切相关。ELANE的低表达增强了破骨细胞的分化和骨丢失。ZHANG等[29]
认为ELANE还可能是潜在的骨关节炎的诊断标记物。LCN2是一种先天性免疫蛋白编码基因，其表达产物也被称为中性粒细胞明胶酶相关脂质运载运载蛋白[30]，它存在于中性粒细胞、肝细胞、巨噬细胞等多种细胞中[30]。LCN2具有抗炎、抗菌等多个作用，被认为是诸多疾病的潜在治疗靶点[31-32]。研究表明，LCN2表达能够减少铁积累和氧化损伤而抑制铁死亡，是铁死亡的关键调节因子[33]。LCN2在维持骨稳态方面同样发挥着重要作用。CAPULLI等[34]研究发现，敲除LCN2的小鼠骨质减少、骨小梁数量明显减少，但破骨细胞变化并不明显。JIANG等[35]的研究发现，LCN2能够通过与小鼠成纤维细胞中的低密度脂蛋白受体相关蛋白6相互作用减少 Wnt/β-catenin 信号传导，进而抑制骨形态发生蛋白9 诱导的成骨分化，其可能通过影响成骨细胞导致骨质疏松症的发生。
此次实验首次发现在PMOP与健康样本中ELANE、LCN2的表达水平异常。受试者工作特征曲线分析进一步证实，可以通过ELANE、LCN2的表达情况实现对PMOP和健康样本的鉴别。值得关注的是，对LCN2和ELANE的免疫相关性分析发现，ELANE与LCN2均与差异表达的M0巨噬细胞密切相关。YAO等[36]认为巨噬细胞能够分化形成破骨细胞，而巨噬细胞-破骨细胞轴在骨免疫中发挥着重要的作用，因而作者推测ELANE、LCN2可能通过共同影响巨噬细胞的表达参与了PMOP的发生发展。铁死亡及细胞焦亡共同影响免疫细胞的差异表达，可能是PMOP潜在的发病机制之一。但研究仍存在部分限制，仅能支持ELANE、LCN2免疫细胞间的相关性分析，并不能揭示其因果关系，其和免疫细胞之间的作用机制仍需要进一步研究。此外，缺乏大样本研究和动物实验从外部验证生物信息学分析。
综上，基于GEO数据库，借助铁死亡数据库和细胞焦亡数据库，通过对PMOP样本与健康样本比较筛选得到差异基因ELANE、LCN2，它们可能是绝经后骨质疏症病理过程中的关键基因。此次研究结果为揭示PMOP的潜在分子水平因果关系提供了思路，为PMOP的诊疗提供了潜在靶点，并为其免疫治疗研究提供了新的方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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