菟丝子治疗骨关节炎：网络药理学分析及实验验证

doi:10.12307/2024.456

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (28): 4516-4521.doi: 10.12307/2024.456

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菟丝子治疗骨关节炎：网络药理学分析及实验验证

张天栋1，彭青平1，刘欢2，冯建国3，易茜4，黄文华1，5

西南医科大学，1中西医结合学院，2基础医学院生理学院，四川省泸州市 646000；3西南医科大学附属中医医院骨科，四川省泸州市 646000；4西南医科大学附属医院麻醉科，四川省泸州市 646000；5南方医科大学基础医学院人体解剖学国家重点学科，广东省数字医学与生物力学重点实验室，广东省医学3D打印应用转化工程技术研究中心，广东省广州市 510515

收稿日期:2023-07-03 接受日期:2023-08-21 出版日期:2024-10-08 发布日期:2023-11-27
通讯作者: 黄文华，教授，西南医科大学中西医结合学院，四川省泸州市646000；南方医科大学基础医学院人体解剖学国家重点学科，广东省数字医学与生物力学重点实验室，广东省医学3D打印应用转化工程技术研究中心，广东省广州市 510515
作者简介:张天栋，男，1997年生，重庆市人，汉族，在读硕士，初级执业中医师，主要从事中医骨伤科学研究。
基金资助:
西南医科大学高层次人才(钟世镇团队)专项支援项目(02061648361)，项目负责人：黄文华；国家重点研发计划项目(2022YFB4600600)，项目负责人：黄文华；国家自然科学基金项目(32271181)，项目负责人：黄文华；泸州市科技计划项目(2021-JYJ-71)，项目负责人：易茜；四川省科技计划联合创新专项项目(2022YFS0609)，项目负责人：易茜；四川省自然科学基金项目(22NSFSC3871)，项目负责人：易茜

Semen cuscutae in the treatment of osteoarthritis: network pharmacology analysis and experimental validation

Zhang Tiandong1, Peng Qingping1, Liu Huan2, Feng Jianguo3, Yi Qian4, Huang Wenhua1, 5

1School of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Department of Physiology, School of Basic Medical Science, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 3Department of Orthopedics, The Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 4Department of Anesthesiology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 5Guangdong Engineering Research Center for Translation of Medical 3D Printing Application, Guangdong Provincial Key Laboratory of Digital Medicine and Biomechanics, National Key Discipline of Human Anatomy, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Received:2023-07-03 Accepted:2023-08-21 Online:2024-10-08 Published:2023-11-27
Contact: Huang Wenhua, Professor, School of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Guangdong Engineering Research Center for Translation of Medical 3D Printing Application, Guangdong Provincial Key Laboratory of Digital Medicine and Biomechanics, National Key Discipline of Human Anatomy, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
About author:Zhang Tiandong, Master candidate, Physician, School of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
Special Support Project for High-level Talents (Zhong Shizhen Team) of Southwest Medical University, No. 02061648361 (to HWH); National Key Research and Development Program of China, No. 2022YFB4600600 (to HWH); National Natural Science Foundation of China, No. 32271181 (to HWH); Luzhou Science and Technology Plan Project, No. 2021-JYJ-71 (to YQ); Sichuan Science and Technology Joint Innovation Special Project, No. 2022YFS0609 (to YQ); Natural Science Foundation of Sichuan Province, No. 22NSFSC3871 (to YQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

分子对接：分子对接技术原理源自19世纪Fisher的受体学说，发展至今人们认为药物与体内蛋白质分子即受体会发生相互作用而进行连接，相互作用的稳定性依赖于两者的空间匹配和能量匹配。该文采用的分子对接技术软件AutoDockTools通过建立药物配体和蛋白质受体结构的半柔性模型，分析判断配体和受体之间是否能够相互作用(空间匹配)，并对作用稳定性进行评分(能量匹配)。
核因子κB信号通路：核因子κB(P 65)是参与关节炎症和组织破坏病理生理的重要转录因子，涉及滑膜、软骨、软骨下骨等多个组织。在骨关节炎中，激活关节软骨细胞表面的机械受体和细胞因子受体的细胞外基质降解产物、纤连蛋白分子、机械应力、老化因素和促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子α或白细胞介素1β)，均可导致核因子κB信号通路的激活，诱发或加重骨关节炎。

背景：菟丝子具有补肝肾、益精髓的功效，而骨关节炎的主要病机为肝肾亏虚，推测菟丝子与骨关节炎之间有一定的联系。

目的：基于网络药理学和分子对接的分析手段挖掘骨关节炎和菟丝子之间的潜在联系，对中药本草菟丝子的作用机制进行合理的推测与验证。
方法：先在中草药数据库TCMSP中筛选菟丝子的有效活性成分和作用靶点，另在疾病数据库GeneCards、OMIM、TTD中收集骨关节炎的相关基因；取交集后进行一系列分析，并筛选出核心基因；通过对核心基因的富集分析选择菟丝子作用于骨关节炎的通路，通过分子对接验证核心基因的作用，并依此选择合适的有效活性成分进行实验验证。

结果与结论：①筛选出11种菟丝子的有效活性成分，菟丝子和骨关节炎有66个交集靶点基因，后续筛选出12个核心基因，包括肿瘤坏死因子、白细胞介素1B、TP53、RACα丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、血管内皮生长因子A、基质金属蛋白酶9、前列腺素过氧合酶2、胱天蛋白酶3、表皮生长因子、过氧化物酶体增生激活受体γ、白细胞介素10、血管细胞黏附因子1；②对核心基因进行富集分析后，选择经典炎症通路核因子κB信号通路进行后续菟丝子缓解骨关节炎炎症的分析验证；根据各活性成分和通路核心基因前列腺素过氧合酶2进行分子对接后得到的结果，选择亲和力最高的芝麻素进行后续细胞实验验证，结果证实了菟丝子的有效成分芝麻素可以通过抑制白细胞介素1β诱导的核因子κB信号通路降低环氧合酶2的表达；③结果表明，菟丝子的活性有效成分芝麻素通过抑制白细胞介素1β诱导的核因子κB信号通路降低环氧合酶2的表达，达到改善骨关节炎炎症的作用，证实了菟丝子在骨关节炎方面的治疗效果。

https://orcid.org/0009-0002-8009-2648(张天栋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 菟丝子, 骨关节炎, 芝麻素, 核因子κB信号通路, 环氧合酶2, 网络药理学, 分子对接, 炎症反应

Abstract: BACKGROUND: Semen cuscutae has the effect of tonifying the liver and kidney system and benefiting the essence. The main pathogenesis of osteoarthritis is deficiency of the liver and kidneys. Therefore, it is hypothesized that there is a link between semen cuscutae and osteoarthritis.
OBJECTIVE: To explore the potential relationship between osteoarthritis and semen cuscutae and validate the mechanism of semen cuscutae based on the network pharmacology and molecular docking analysis.
METHODS: First, the active ingredients and targets of semen cuscutae were screened in TCMSP, and the genes related to osteoarthritis were collected in the disease databases GeneCard’s, OMIM and TTD. The intersected genes were taken and then subjected to a series of analyses and screened for hub genes. Through the enrichment analysis of hub genes, the pathway of semen cuscutae acting on osteoarthritis was selected. The role of hub genes was verified by molecular docking. Therefore, the appropriate active ingredients of semen cuscutae were selected for experimental verification.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 11 active ingredients of semen cuscutae, 66 intersection target genes of semen cuscutae and osteoarthritis, and 12 hub genes, including tumor necrosis factor, interleukin 1B, TP53, RAC-alpha serine/threonine protein kinase (AKT1), vascular endothelial growth factor A, matrix metalloproteinase 9, prostaglandin peroxidase 2, cystatinase 3, epidermal growth factor, peroxisome proliferator-activated receptor gamma, interleukin 10, vascular cell adhesion factor 1. After the enrichment analysis of the hub genes, the classical inflammatory pathway, nuclear factor-κB signaling pathway, was selected for subsequent validation of semen cuscutae to alleviate osteoarthritic inflammation. Through the results obtained after molecular docking of each active ingredient and the hub gene of the pathway prostaglandin peroxidase 2, sesamin with the highest affinity was selected for subsequent cell experiments, and the experimental results confirmed that sesamin, the active ingredient of semen cuscutae, could reduce the expression of cyclooxygenase 2 by inhibiting the nuclear factor-κB signaling pathway induced by interleukin-1β. To conclude, sesamin, the active ingredient of semen cuscutae, reduces the expression of cyclooxygenase 2 by inhibiting the nuclear factor-κB signaling pathway induced by interleukin-1β, thereby improving inflammation in osteoarthritis and expanding the therapeutic effect of semen cuscutae in osteoarthritis.

Key words: semen cuscutae, osteoarthritis, sesamin, nuclear factor-κB signaling pathway, cyclooxygenase 2, network pharmacology, molecular docking, inflammation

中图分类号:

张天栋, 彭青平, 刘欢, 冯建国, 易茜, 黄文华. 菟丝子治疗骨关节炎：网络药理学分析及实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4516-4521.

Zhang Tiandong, Peng Qingping, Liu Huan, Feng Jianguo, Yi Qian, Huang Wenhua. Semen cuscutae in the treatment of osteoarthritis: network pharmacology analysis and experimental validation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(28): 4516-4521.

图/表（结果） 8

2.1 菟丝子有效成分和骨关节炎的共同作用靶点应用TCMSP平台搜索关键词“菟丝子”，根据设置值域口服生物利用度≥30%，药物相似性≥0.18，总共筛选出 11种主要成分，见表1；再利用TCMSP数据库搜索各活性成分对应的靶点信息，整合去重，共获得208个相关靶点，其中SC11 槐醇并没有找到相应的靶点。此外，在OMIM、TTD、GeneCards 数据库中通过关键词“Osteoarthritis”进行检索，其中由于GeneCards检索出的结果太多，共5 031个靶点基因，所以通过取两次相关性分数(Relevance score)筛选数据，最后GeneCards数据库中相关性分数大于1.3的数据被纳入，整合所有数据库结果并去重后获得骨关节炎相关基因靶点1 711个，菟丝子和骨关节炎共同相关靶点基因 66个，见图1。

2.2 菟丝子与骨关节炎共同作用的66个靶基因分析根据数据库所获得药物治疗基因靶点和疾病相关基因的联系，通过 Cytoscape构建了可视化网络图，见图2A。根据结果示意，在菟丝子10个有效成分中，SC1槲皮素和SC5山奈酚的Degree值较高；在66个药物-疾病共同作用靶点基因中，过氧化物酶体增生激活受体γ、前列腺素过氧合酶2、RELA、前列腺素过氧合酶1、胱天蛋白酶3的Degree值较高，并且槲皮素和山奈酚均可以作用于这些靶点。通过将这66个共同作用靶点导入DAVID数据库进行富集分析，取P值最小的前10位富集结果，用微生信平台将结果可视化，见图2B，C。在GO分析中，在生物过程(BP)中有20个靶点基因富集到了炎症反应，14个靶点基因富集到了对脂多糖的反应，14个靶点基因富集到了对外源性刺激的反应，其他包括对肿瘤坏死因子的反应、对机械刺激的反应、衰老、凋亡过程、核因子κB信号通路等；在细胞成分(CC)中有30个靶点基因富集到了胞外间隙，29个靶点基因富集到了胞外区域，其他包括细胞表面、核质、染色质、外泌体等；在分子功能(MF)中，有18个基因富集到酶结合，其他包括蛋白酶结合、蛋白质结合等。在KEGG分析中，富集到了肿瘤坏死因子、核因子κB、PI3K-AKT、低氧诱导因子1等信号通路，大部分都与骨关节炎相关。这些结果证实了菟丝子在骨关节炎治疗中发挥作用的可能性。

2.3 蛋白互作网络和核心基因的初步筛选通过将靶点基因上传至 STRING 数据库，获得了靶点基因对应的蛋白互作网络，并将此网络导入 Cytoscape 软件可视化，见图3A。根据Cytoscape插件CytoNCA分别计算网络节点的拓扑参数：中间度中心性(BC)、贴近中心值参数的中位数。最终获得12个核心基因，分别为肿瘤坏死因子、白细胞介素1B、TP53、RACα丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、血管内皮生长因子A、基质金属蛋白酶9、前列腺素过氧合酶2、胱天蛋白酶3、表皮生长因子、过氧化物酶体增生激活受体γ、白细胞介素10、血管细胞黏附因子1，见图3B。

2.4 菟丝子作用于骨关节炎的通路筛选通过David在线数据库，将筛选后的12个核心基因再次进行富集分析，结果见图4。在GO分析中，富集到的对异生刺激的反应、对细胞凋亡的调节、大分子复合物等，KEGG分析中富集到肿瘤坏死因子、核因子κB、PI3K-AKT、低氧诱导因子1、JAK-STAT、白细胞介素17等许多与炎症相关的信号通路。

根据大量文献查阅[19-20]，选择经典炎症通路核因子κB信号通路进行后续菟丝子缓解骨关节炎炎症的分析验证。核心基因白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、血管细胞黏附因子1和前列腺素过氧合酶2被富集到了核因子κB信号通路，见图5(引用于DAVID数据库)，表示菟丝子可以通过核因子κB信号通路调控白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、血管细胞黏附因子1和前列腺素过氧合酶2的表达产生对骨关节炎的影响。前列腺素过氧合酶2是环氧合酶2的编码基因，临床上常用环氧合酶2抑制剂对骨关节炎进行抗炎镇痛治疗[21]，所以选择环氧合酶2为后续实验验证的检测指标。

2.5 菟丝子活性有效成分作用于骨关节炎的分子对接分子对接已被用于确定活性有效化学成分与其主要靶点之间的结合活性[22]。前列腺素过氧合酶2是菟丝子中有效活性成分SC1槲皮素(MOL000098)、SC7芝麻素(MOL001558)、SC3异鼠李素(MOL000354)、SC4 β-谷甾醇(MOL000358)、SC5山奈酚(MOL000422)的调控靶点。通过AutoDockTools、PyMOL软件将筛选出的菟丝子的有效活性成分槲皮素、芝麻素、异鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚与对应的骨关节炎靶基因PTGS2(PDBID:5F19)进行分子对接，结果见图6A-E。
亲和力是软件用来评估结合能力的分数。人们普遍认为，亲和力评分<-20.920 kJ/mol表明具有良好的结合活性，<-29.288 kJ/mol则具有较强的结合活性[23]，结果见图6F。前列腺素过氧合酶2的蛋白质结构与槲皮素、山奈酚、异鼠李素、芝麻素、β-谷甾醇均具有良好或较强的亲和力，其中芝麻素与前列腺素过氧合酶2的结合力最强，故而后续实验用芝麻素进行验证。

2.6 细胞实验验证首先用芝麻素2.5，5 μmol/L 2个浓度进行CCK-8实验，图7A结果证实2个浓度的芝麻素可促进小鼠成软骨细胞ATDC5的增殖。Western Blot检测证实芝麻素可以作用于核因子κB信号通路与前列腺素过氧合酶2基因，与上述的网络药理学分析结果相吻合，见图7B-D。与对照组相比，芝麻素+白细胞介素1β组的核因子κB信号通路被明显抑制(P < 0.05)；与白细胞介素1β组相比，芝麻素组和芝麻素+白细胞介素1β组能够有效抑制核因子κB信号通路和环氧合酶2的表达(P < 0.01)；另外研究发现，白细胞介素1β组和芝麻素组的磷酸化核因子κB和环氧合酶2的表达与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)。即芝麻素可以通过抑制白细胞介素1β诱导的核因子κB信号通路降低环氧合酶2的表达，以此作用于骨关节炎。

参考文献

[1] MOTTA F, BARONE E, SICA A, et al. Inflammaging and Osteoarthritis. Clin Rev Allerg Immu. 2023;64(2):222-238.
[2] 田代华.黄帝内经素问[M].北京:人民卫生出版社,2007.
[3] 侯成志,李秋月,魏戌,等.独活寄生汤治疗膝骨关节炎的研究[J].中国中医基础医学杂志,2021,27(11):1843-1846.
[4] 易南星,王晓赟,梁倩倩,等.蠲痹汤调控淋巴管回流功能治疗膝骨关节炎的研究[J].世界科学技术-中医药现代化,2019,21(10):2194-2200.
[5] 陈紫军,霍晓乾,任越,等.复方杜仲健骨颗粒治疗骨关节炎的抗炎潜在药效物质及作用机制研究[J]. 中国中药杂志,2022,47(15):4156-4163.
[6] JIN Z, CHANG B, WEI Y, et al. Curcumin exerts chondroprotective effects against osteoarthritis by promoting AMPK/PINK1/Parkin-mediated mitophagy. Biomed Pharmacother. 2022;151:113092.
[7] ZHOU Z, ZHANG L, LIU Y, et al. Luteolin Protects Chondrocytes from H2O2-Induced Oxidative Injury and Attenuates Osteoarthritis Progression by Activating AMPK-Nrf2 Signaling. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:5635797.
[8] MENG Y, YIN D, QIU S, et al. Abrine promotes cell proliferation and inhibits apoptosis of interleukin-1β-stimulated chondrocytes via PIM2/VEGF signalling in osteoarthritis. Phytomedicine. 2022;96:153906.
[9] 陈修园.神农本草经读[M].福州:福建科学技术出版社,2007.
[10] 李时珍.本草纲目[M].王育杰(整理),译.北京:人民卫生出版社,2005.
[11] 陈士绎.本草新编[M].北京:中国中医药出版社,1996.
[12] 杜一峰,刘元禄,郑浩,等.右归丸组方单体对骨关节炎影响机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(2):212-221.
[13] 张向慧,杨豪,蒋振营,等.养血强筋膏联合蠲痹汤治疗肝肾亏虚型膝骨关节炎的疗效及对VAS、HSS评分的影响[J].中医研究,2022,35(11): 37-41.
[14] 邢增宇,肖学锋,魏佳明,等.肖学锋运用自拟补肾活血汤治疗膝痹病[J].中医药临床杂志,2019,31(8):1459-1460.
[15] 侯佳瑶,张亚奇,王小钢,等.淫羊藿与附子治疗膝骨关节炎的网络药理学作用机制研究[J].重庆医学,2023,52(9):139-1398.
[16] 刘宝方,徐斌,陈雷.葛根汤治疗骨关节炎的网络药理学分析及动物实验验证[J].中国组织工程研究,2024,28(2):193-199.
[17] ABRAMSON SB, YAZICI Y. Biologics in development for rheumatoid arthritis: relevance to osteoarthritis. Adv Drug Deliver Rev. 2006;58(2):212-225.
[18] KAPOOR M, MARTEL-PELLETIER J, LAJEUNESSE D, et al. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2011;7(1):33-42.
[19] 兰伟斌,阙武堂,谢建鸿,等.大黄素通过抑制NF-κB信号通路改善骨关节炎的软骨降解分析[J].中国免疫学杂志,2023,39(2):308-312.
[20] DENG Y, LU J, LI W, et al. Reciprocal inhibition of YAP/TAZ and NF-κB regulates osteoarthritic cartilage degradation. Nat Commun. 2018;9(1): 4564.
[21] 方忠,李锋,熊伟,等.特异性COX-2抑制剂保护骨关节炎软骨的临床观察[J].实用骨科杂志,2006,12(1):29-32.
[22] KRYCZKA J, KRYCZKA J, JANCZEWSKI Ł, et al. Isothiocyanates (ITCs) 1-(Isothiocyanatomethyl)-4-phenylbenzene and 1-Isothiocyanato-3,5-bis(trifluoromethyl)benzene-Aldehyde Dehydrogenase (ALDH) Inhibitors, Decreases Cisplatin Tolerance and Migratory Ability of NSCLC. Int J Mol Sci. 2022;23(15):8644.
[23] FERREIRA LG, DOS SANTOS RN, OLIVA G, et al. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 2015;20(7):13384-13421.
[24] LV S, WANG X, JIN S, et al. Quercetin mediates TSC2-RHEB-mTOR pathway to regulate chondrocytes autophagy in knee osteoarthritis. Gene. 2022;820: 146209.
[25] FENG K, CHEN Z, PENGCHENG L, et al. Quercetin attenuates oxidative stress-induced apoptosis via SIRT1/AMPK-mediated inhibition of ER stress in rat chondrocytes and prevents the progression of osteoarthritis in a rat model. J Cell Physiol. 2019;234(10):18192-18205.
[26] 肖嘉聪,麦嘉乐,张罡瑜,等.槲皮素调控关节炎软骨细胞胆固醇代谢的机制研究[J].中国骨质疏松杂志,2022,28(9):1336-1341.
[27] LI J, WU R, QIN X, et al. Isorhamnetin inhibits IL‑1β‑induced expression of inflammatory mediators in human chondrocytes. Mol Med Rep. 2017;16(4): 4253-4258.
[28] TSAI SW, LIN CC, LIN SC, et al. Isorhamnetin ameliorates inflammatory responses and articular cartilage damage in the rats of monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis. Mol Med Rep. 2019;41(4):504-512.
[29] JIANG R, HAO P, YU G, et al. Kaempferol protects chondrogenic ATDC5 cells against inflammatory injury triggered by lipopolysaccharide through down-regulating miR-146a. Int Immunopharmacol. 2019;69:373-381.
[30] XIAO Y, LIU L, ZHENG Y, et al. Kaempferol attenuates the effects of XIST/miR-130a/STAT3 on inflammation and extracellular matrix degradation in osteoarthritis. Future Med Chem. 2021;13(17):1451-1464.
[31] LIAO PC, LAI MH, HSU KP, et al. Identification of β-Sitosterol as in Vitro Anti-Inflammatory Constituent in Moringa oleifera. J Agr Food Chem. 2018; 66(41):10748-10759.
[32] PHITAK T, POTHACHAROEN P, SETTAKORN J, et al. Chondroprotective and anti-inflammatory effects of sesamin. Phytochemistry. 2012;80:77-88.
[33] KONG P, CHEN G, JIANG A, et al. Sesamin inhibits IL-1β-stimulated inflammatory response in human osteoarthritis chondrocytes by activating Nrf2 signaling pathway. Oncotarget. 2016;7(50):83720-83726.
[34] DENG S, ZHOU JL, FANG HS, et al. Sesamin Protects the Femoral Head From Osteonecrosis by Inhibiting ROS-Induced Osteoblast Apoptosis in Rat Model. Front Physiol. 2018;9:1787.
[35] O’DEA E, HOFFMANN A. NF-κB signaling. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2009;1(1):107-115.
[36] SUN K, LUO J, JING X, et al. Hyperoside ameliorates the progression of osteoarthritis: An in vitro and in vivo study. Phytomedicine. 2021;80:153387.
[37] 张卓莉.非甾体抗炎药(包括环氧化酶-2抑制剂)在治疗膝关节骨关节炎所致疼痛中的作用:随机安慰剂对照临床试验的汇总分析[J].英国医学杂志中文版,2005,8(3):154-158.
[38] GALLUZZI L, VITALE I, AARONSON SA, et al. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 2018;25(3):486-541.
[39] YAO X, SUN K, YU S, et al. Chondrocyte ferroptosis contribute to the progression of osteoarthritis. J Orthop Transl. 2021;27:33-43.
[40] GÜLER VG, YALıN S, BERKÖZ M, et al. Eklem Hast Cerrahisi. Eklem Hastaliklari Ve Cerrahisi. 2011;22(1):22-27.
[41] WANG X, LIU Z, PENG P, et al. Astaxanthin attenuates osteoarthritis progression via inhibiting ferroptosis and regulating mitochondrial function in chondrocytes. Chem-Biol Interact. 2022;366:110148.
[42] ZHOU Y, ZHOU H, HUA L, et al. Verification of ferroptosis and pyroptosis and identification of PTGS2 as the hub gene in human coronary artery atherosclerosis. Free Radical Bio Med. 2021;171:55-68.
[43] 林楠.穴位贴敷联合中药熏蒸治疗阳虚寒凝型膝骨性关节炎的意义分析[J].中国现代药物应用,2023,17(10):143-145.
[44] 任树天,王永康,张保卿,等.推拿治疗膝关节骨性关节炎系统评价的研究进展[J].天津中医药,2023,40(5):675-680.
[45] JIANG W, XIANG X, SONG M, et al. An all-silk-derived bilayer hydrogel for osteochondral tissue engineering. Mater Today Bio. 2022;17:100485.
[46] LIU Y, PENG L, LI L, et al. 3D-bioprinted BMSC-laden biomimetic multiphasic scaffolds for efficient repair of osteochondral defects in an osteoarthritic rat model. Biomaterials. 2021;279:121216.

引言

骨关节炎是最常见的关节炎形式，影响全球超过5亿人(约占全球人口的7%)，高龄人群(> 65岁)的患病率尤其高[1]。根据临床表现，中国传统医学将骨关节炎纳入“痹症”范畴，称为“骨痹”，《素问•长刺节论》记载“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹”，另《素问•阴阳应象大论》曰：“肾生骨髓，髓生肝”故而“乙癸同源”[2]，且对于高龄人群而言肝肾多有不足，综上骨痹病机在于肝肾亏虚在里，外邪侵袭在外，合而致病。中医药历史上对骨关节炎的治疗经验颇丰，独活寄生汤[3]、蠲痹汤[4]、复方杜仲健骨颗粒等古今名方对骨关节炎均有一定疗效[5]，但作用机制并不明确。借助现代的药理研究手段，中医药对骨关节炎的作用更加清晰，如近年研究发现，中药单体素姜黄素可以通过AMPK/PINK1/Parkin信号通路激活线粒体自噬，维持线粒体稳态，起到软骨保护作用[6]；木犀草素可以通过AMPK-Nrf2信号通路改善软骨细胞中过氧化氢诱导的氧化应激、炎症、细胞程序性死亡等，改善关节炎[7]；相思子碱通过激活PIM2/血管内皮生长因子信号通路抑制白细胞介素 1β诱导的人源软骨细胞系C2/I2的凋亡等[8]。诸如此类的深入研究让中医药的治疗机制更明确，更好地指导临床治疗。
菟丝子最早记载于《神农本草经》[9]，中医对这味本草的运用超过2000年，为不知几何的患者解决了身体问题。《神农本草经》说其“主续绝伤，补不足，益气力，肥健，汁，去面皯。久服明目，轻身延年。”《本草纲目》将菟丝子归类为上品[10]，记载其“养肌强阴，坚筋骨……久服明目轻身延年精益髓，去腰疼膝冷……”《本草新编》[11]也说其为“入心、肝、肾三经之药。益气强阴，补髓添精，止腰膝疼痛，安心定魂，能断梦遗，坚强筋骨，且善明目。”可见菟丝子对以肝肾亏虚为主要病机的骨关节炎应有对证且对症的治疗效用，临床上确实也有医家运用含菟丝子的复方如右归丸[12]、养血强筋膏[13]、补肾活血方等经方[14]、时方补肝肾、强筋骨以改善骨关节炎的案例，而以现代医学的角度对其作用机制尚未可知。
该文基于网络药理学的分析手段挖掘疾病骨关节炎和中药菟丝子之间的潜在联系，为深入研究中药本草菟丝子对骨关节炎的作用机制进行合理的推测与验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计通过网络药理学分析菟丝子在骨关节炎中的作用通路和治疗靶点，后由分子对接的技术验证分析菟丝子治疗骨关节炎的核心基因，并依据分子对接结果选择菟丝子的有效化合物成分，最后通过细胞实验来进行验证。
1.2 时间及地点实验于2023年2-7月在西南医科大学科技大楼完成。
1.3 资料
1.3.1 生信数据库和分析工具
数据库：TCMSP 数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)，UniProt 数据库 (https://www.UniProt.org/UniProt/)，GeneCard 数据库 (https://www.genecards.org/)，OMIM数据库(https://www.omim.org/)，TTD数据库(https://db.idrblab.net/ttd/)，STRING数据库(https://cn.string-db. org/)，RCSB数据库(https://www.rcsb.org/)，PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。
分析工具：Venny 2.1平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，DAVID平台(https://david.ncifcrf.gov/)，微生信平台(http://www.bioinformatics. com.cn/)，Cytoscape(3.9.1)，AutoDockTools(1.5.6)，PyMOL(4.3.0)，Graphpad prism(8.4.3)，ImageJ。
1.3.2 主要试剂、细胞与设备小鼠成软骨细胞系ATDC5(富衡)；重组鼠源白介素1β(beyotime)；芝麻素(aladdin)；CCK-8试剂 (APExBIO)；β-Actin抗体、环氧合酶2 抗体(Proteintech)；核因子κB(P65)抗体、磷酸化核因子κB(p-P65)抗体 (Abcam)；BCA试剂盒(beyotime)；NC膜(白鲨)；多功能荧光酶标仪 (BioTek)；全自动化学发光图像分析仪(天能)；低温离心机(Eppendorf)。
1.4 实验方法
1.4.1 骨关节炎和菟丝子靶点基因的获取根据前人研究设置口服生物利用度(OB)≥30%，药物相似性(DL)≥0.18[15-16]，在TCMSP 数据库检索出中药菟丝子的活性有效化学成分，以及其相应的靶点信息，通过UniProt 数据库进行数据转换；通过GeneCards数据库、OMIM数据库、TTD数据库检索疾病骨关节炎的靶点基因。
1.4.2 骨关节炎和菟丝子交集基因的获取通过Venny 2.1平台取得骨关节炎和菟丝子的交集基因并将结果可视化；同时通过DAVID平台对交集基因进行富集分析，在微生信平台将富集分析结果可视化。通过Cytoscape软件将骨关节炎-靶点-菟丝子的作用网络进行可视化。
1.4.3 蛋白-蛋白互作网络分析和核心基因的初步筛选在STRING数据库中构建药物菟丝子作用于疾病骨关节炎的靶点基因的PPI网络，并用软件 Cytoscape可视化，使用Cytoscape的CytoHCA 插件中的3种算法：中间度中心性(BC)、贴近中心性(CC)、Degree中心性(DC)，得出每种算法分值的中位数，超过每种算法的中位数的靶点基因被保留，循环运行2次，筛选出重要节点的基因即药物作用于疾病的核心基因。
1.4.4 分子对接研究使用软件AutoDockTools(1.5.6)作为分子对接程序。从RCSB数据库下载靶点蛋白的PDB文件，成分的小分子结构均来源于PubChem数据库，药物成分小分子被指定为配体，靶点蛋白被指定为受体。PyMOL(4.3.0)软件用于分离原始配体和蛋白质结构，脱水和去除有机物，AutodockTools用于氢化，检查电荷和选择所选配体的可扭键。最后，使用Autoduck4对接后，计算蛋白与小分子对接结合的评分，并使用PyMOL进行三维分析和可视化。
1.4.5 细胞实验验证
小鼠成软骨细胞ATDC5常规培养：用含体积分数10%全式金胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基(完全培养基)常规培养ATDC5细胞，2 d换液1次，当细胞铺盖率达到80%左右进行处理。
CCK-8实验：将2×103个小鼠成软骨细胞ATDC5接种到96孔板中，加入含不同浓度芝麻素(0，2.5，5 µmol/L)的完全培养基，在37 ℃孵育24 h后进行CCK-8细胞增殖实验。每个孔清洗后中加入含有10%CCK-8试剂的100 µL培养基。在37 ℃孵育1 h后，测量450 nm处的吸光度值，并根据试剂说明书计算细胞存活率。
Western Blot检测：白细胞介素1β是参与骨关节炎病理生理学的主要促炎因子之一，多项研究证明白细胞介素1β是骨关节炎的重要指标，阻断白细胞介素1β可以改善骨关节炎病理表现[17-18]。
当常规培养下观察小鼠成软骨细胞ATDC5铺盖70%-80%后，将细胞接种于10 cm培养皿中分组培养，每皿4×105个细胞：对照组加入完全培养基，白细胞介素1β组加入含20 ng/mL白细胞介素1β的完全培养基，芝麻素组加入含5 µmol/L芝麻素的完全培养基，白细胞介素1β+芝麻素组加入含20 ng/mL白细胞介素1β与5 µmol/L芝麻素的完全培养基，37 ℃孵育24 h。孵育结束后提取细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。以50 μg蛋白量进行垂直电泳，湿转法将凝胶中蛋白转印至NC膜上，5%血清蛋白封闭1 h后，加入一抗β-Actin(1∶1 000)、P65(1∶3 000)、p-P65(1∶3 000)、环氧合酶2(1∶500)，4 ℃孵育过夜，次日洗膜后加入二抗(1∶5 000)37 ℃温育60 min，洗膜3次后，滴加ECL发光液，凝胶成像分析系统中采集照片，使用Image J软件测定条带灰度值，以目的蛋白灰度值/内参灰度值作为该样本的相对蛋白表达量。
1.5 主要观察指标骨关节炎和菟丝子之间的潜在联系。
1.6 统计学分析应用Graphpad prism软件进行实验数据的统计学分析，计量资料以均数±标准误表示，符合正态分布的计量资料，组间比较采用单因素方差分析，当P < 0.05时表明差异有显著性意义。该文统计学方法已经西南医科大学生物统计学专家审核。

讨论

基于此次研究分析，菟丝子的活性有效成分主要有槲皮素、柱头甾醇、异鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、胆固醇、芝麻素、菜油甾-5-烯-3β-醇、异岩藻甾醇、苦参碱、槐醇，其中在骨关节炎软骨组织中能够通过抑制核因子κB信号通路靶向环氧合酶2的有效成分包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素、芝麻素、β-谷甾醇。槲皮素为一种天然的黄酮类化合物，已经有多项研究在动物模型中证实了其对骨关节炎的正向治疗作用，它可以通过多个信号通路起到减轻软骨细胞炎症、凋亡、细胞外基质降解，以及调控软骨细胞自噬，达到减缓骨关节炎的作用[24-26]，已经是很有潜力的骨关节炎治疗药物。异鼠李素和山奈酚也被证实在骨关节炎的动物模型中具有抗炎和/或抗氧化能力，可以起到保护软骨细胞、减轻炎症的作用[27-30]。β-谷甾醇由于难以溶解度的缘故，难以在体外证实其对疾病的作用，但也有研究报道了它的抗炎能力，可以抑制核因子κB信号通路，减低炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素8 和活性氧以及炎症小体的表达[31]，但其对骨关节炎的研究尚未有明确报道。芝麻素也是菟丝子的活性有效成分的一员，有研究证明芝麻素具有优秀的抗炎症和抗氧化的作用，可以通过抗活性氧和激活Nrf2信号通路等来保护关节炎环境下的关节软骨细胞[32-34]，
但是具体机制还需要进一步挖掘。该文在细胞水平验证了前列腺素过氧合酶2基因是芝麻素治疗骨关节炎的一个关键靶点，芝麻素可以通过抑制白细胞介素1β诱导的核因子κB信号通路降低环氧合酶2的表达，一定程度缓解软骨细胞的炎症损伤。
该文筛选出来菟丝子与骨关节炎相关的关键靶点包括肿瘤坏死因子、白细胞介素1B、TP53、RACα丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、血管内皮生长因子A、基质金属蛋白酶9、前列腺素过氧合酶2、胱天蛋白酶3、表皮生长因子、过氧化物酶体增生激活受体γ、白细胞介素10、血管细胞黏附因子1共12个核心基因，通过富集分析发现核心基因富集到的通路包括核因子κB信号通路在内的多条信号通路，而选择核因子κB信号通路进行验证是因为这条通路是经典炎症通路，可以被多种刺激激活如促炎症因子(肿瘤坏死因子α或白细胞介素1β)、细胞外基质降解产物及机械应力刺激等[35]。另外，核因子κB信号通路的下游蛋白环氧合酶2由前列腺素过氧合酶2基因编码合成，是已知的与骨关节炎炎症相关的指标，靶向降低环氧合酶2表达的治疗被证实可以保护软骨细胞，通过抗炎机制减少软骨细胞凋亡[36]。临床上常用于部分类风湿性关节炎、骨关节炎患者的非类固醇抗炎药便是通过靶向环氧合酶2进行镇痛和缓解炎症，但是研究发现长期口服非类固醇抗炎药(包括环氧合酶2抑制剂)会出现严重的不良反应[37]，所以对于靶向前列腺素过氧合酶2治疗慢性疾病骨关节炎的药物还需要新的发现。故而作者认为若是菟丝子的有效成分能够靶向核因子κB信号通路和环氧合酶2这个蛋白，即是菟丝子能够有效治疗骨关节炎的强有力证据，此后也可以指导研究人员进一步挖掘菟丝子及其有效成分的作用机制与运用。有多项研究报道环氧合酶2的上调与骨关节炎模型中软骨细胞的铁死亡相
关[38–40]。铁死亡在2012年被DIXON等首次发现，根据细胞死亡命名委员会的说法，铁死亡被定义为由谷胱甘肽过氧化物酶4组成控制细胞内微环境的氧化紊乱引起的调节性细胞死亡形式[41-42]，且研究也发现铁死亡相关的代谢障碍参与了骨关节炎的发生与发展。该文通过分子对接手段和后续实验验证了菟丝子的有效成分之一芝麻素能够有效地作用于骨关节炎，促进软骨细胞的增殖，并且可以作用于炎症经典通路——核因子κB信号通路，降低核因子κB的磷酸化与环氧合酶2的表达，证实其优秀的抗炎能力，对软骨细起到一定的保护作用。那么可以推测芝麻素也可以通过靶向环氧合酶2或其蛋白质互作用的相关蛋白调控软骨细胞的铁死亡，进而改善骨关节炎。
目前关于菟丝子和芝麻素对骨关节炎的研究报道并不多，具有很大的研究空间和价值。在临床运用方面，对于骨关节炎的前期保守治疗，中医有自己独特的治疗手段，包括各类药剂、针推、熏蒸等[43-44]，都有不错的减轻症状、缓解疼痛的疗效，菟丝子相关药物同样可以与这些手段相配合，参与骨关节炎的治疗。此外，纳米载药微球是比较新颖的技术[45]，可以缓释药物、控制药物浓度、增加药效时长，若是在疾病早期菟丝子相关药物可以配合纳米载药微球进行关节腔注射，应该可以减缓病情发展；生物3D打印技术也是比较先进的现代治疗手段[46]，在疾病后期进行关节置换时，菟丝子相关药物若能配合生物3D打印技术产生促进软骨细胞增殖、减轻关节炎症，也是非常有意义的运用。
综上所述，该文基于网络药理学分析、分子对接手段和细胞实验验证了，中药菟丝子的活性有效成分芝麻素通过抑制核因子κB信号通路降低环氧合酶2的表达达到改善骨关节炎炎症的作用，证实了菟丝子在骨关节炎方面的治疗潜力。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

菟丝子治疗骨关节炎：网络药理学分析及实验验证

Semen cuscutae in the treatment of osteoarthritis: network pharmacology analysis and experimental validation

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[1]	李永杰, 付申宇, 夏渊, 张达宽, 刘洪举. 膝骨关节炎女性伸膝肌力、步态时空参数与峰值膝关节屈曲/内收力矩关系[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1354-1358.
[2]	齐浩东, 鲁超, 徐韩博, 王孟飞, 郝阳泉. 糖尿病对初次全膝关节置换围术期失血量和疼痛的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1383-1387.
[3]	黄夏荣, 胡莉芝, 孙光华, 彭昕珂, 廖瑛, 廖源, 刘静, 尹林伟, 钟培瑞, 彭婷, 周君, 屈萌艰. 电针干预老年膝骨关节炎大鼠关节软骨及软骨下骨P53、P21的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1174-1179.
[4]	赵嘎日达, 任逸众, 韩长旭, 孔令跃, 贾岩波. 蒙药额尔敦-乌日勒修复骨关节炎大鼠模型的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1193-1199.
[5]	李蕊, 张桂红, 王涛, 樊萍. 人参多糖干预创伤性骨关节炎模型大鼠前列腺素E2/6-酮-前列腺素F1α的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1235-1240.
[6]	张克凡, 石辉. 细胞因子治疗骨关节炎的研究现状及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 961-967.
[7]	申飞燕, 姚吉祥, 苏珊珊, 赵忠民, 唐巍东. 敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 499-504.
[8]	买斯吐热木·黑力力, 张婉霞, 尼加提·努尔穆罕默德, 买买提吐逊·吐尔地. 关节腔注射医用臭氧对早期颞下颌骨关节炎模型大鼠髁突组织学的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 505-509.
[9]	刘宇涵, 樊渝江, 王启光. 早期创伤性膝骨关节炎动物模型构建方案的比较[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 542-549.
[10]	张亚茹, 陈焱君, 张晓东, 陈胜华, 黄文华. 谷胱甘肽过氧化物酶4介导铁死亡在膝骨关节炎滑膜炎发生发展中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 550-555.
[11]	杨雨晴, 陈志宇. 早期短暂M1巨噬细胞在骨组织工程中的作用及应用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 594-601.
[12]	刘潞兴, 狄鸣远, 杨强. 中药有效成分治疗骨关节炎机制中的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 609-614.
[13]	闫炳翰, 李志超, 苏辉, 薛海鹏, 徐展望, 谭国庆. 中药单体靶向自噬治疗骨关节炎的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 627-632.
[14]	陈俊炎, 孟庆奇, 李斯明. 关节腔注射治疗骨关节炎药物载体系统中的软骨靶向功能[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 458-463.
[15]	田勇, 周颖, 古雍翔, 杨国辉. 二甲双胍预处理诱导心脏自噬减轻脓毒症小鼠的心肌损伤[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4469-4476.