二甲双胍预处理诱导心脏自噬减轻脓毒症小鼠的心肌损伤

doi:10.12307/2024.340

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (28): 4469-4476.doi: 10.12307/2024.340

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二甲双胍预处理诱导心脏自噬减轻脓毒症小鼠的心肌损伤

田勇1，2，周颖1，古雍翔1，杨国辉3

1贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；2铜仁市人民医院重症医学科，贵州省铜仁市 554300；3贵州医科大学附属医院，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2023-04-18 接受日期:2023-06-01 出版日期:2024-10-08 发布日期:2023-11-27
通讯作者: 杨国辉，主任医师，教授，贵州医科大学附属医院，贵州省贵阳市 550004
作者简介:田勇，贵州省印江县人，土家族，贵州医科大学在读硕士，铜仁市人民医院重症医学科主治医师，主要从事重症感染、自噬的相关研究。
基金资助:
贵州医科大学国家自然科学基金培育项目(gyfynsfc-2021-54)，项目负责人：杨国辉；贵州省卫生健康委科学技术基金项目(gzwjkj2020-1-026)，项目负责人：杨国辉

Metformin pretreatment induces cardiac autophagy to reduce myocardial injury in septic mice

Tian Yong1, 2, Zhou Ying1, Gu Yongxiang1, Yang Guohui3

1Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Intensive Care Unit, Tongren City People’s Hospital, Tongren 554300, Guizhou Province, China; 3Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2023-04-18 Accepted:2023-06-01 Online:2024-10-08 Published:2023-11-27
Contact: Yang Guohui, Professor, Chief physician, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Tian Yong, Master candidate, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Intensive Care Unit, Tongren City People’s Hospital, Tongren 554300, Guizhou Province, China
Supported by:
Culture Program for the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, The National Natural Science Foundation of China, No. gyfynsfc-2021-54 (to YGH); Guizhou Provincial Health Commission Science and Technology Fund Project, No. gzwjkj2020-1-026 (to YGH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

二甲双胍：一种从山羊豆中提取的胍类化合物，作为2型糖尿病的一线用药，可通过激活腺苷单磷酸激酶影响神经和内分泌系统，发挥降低血脂、减轻体质量、参与抗炎、减轻氧化应激、调控自噬等作用，从而对心血管疾病发挥保护作用。
自噬：是一种进化上保守的细胞内消化过程，细胞通过自噬将胞质中的物质运送到溶酶体中进行降解，根据降解方式将自噬分为3 种类型：巨自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬，文中所讲的自噬为巨自噬，适当的自噬有利于维持细胞内环境稳态及生存。

背景：脓毒症并发心肌损伤具有高死亡率的特点，二甲双胍可通过抗炎、改善氧化应激、减少细胞凋亡等多种方式对脓毒症器官功能障碍发挥保护作用，而二甲双胍诱导的自噬在脓毒症心肌损伤中是否扮演重要的角色尚不清楚。

目的：探究二甲双胍预处理对脓毒症小鼠心肌损伤的作用。
方法：雄性昆明小鼠40只，随机分为假手术组、模型组、二甲双胍组、二甲双胍+3-甲基腺嘌呤组，每组10 只，后2 组在每日固定时间予二甲双胍连续腹腔注射14 d，二甲双胍+3-甲基腺嘌呤组在建模前1 h腹腔注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤；在末次注射二甲双胍后24 h，采用盲肠结扎穿孔术构建脓毒症小鼠心肌损伤模型，假手术组不结扎及穿孔。所有小鼠在术后24 h处死并留取血液及心肌标本。ELISA检测血清中炎症因子及心肌损伤标志物水平，RT-qPCR检测心肌组织自噬标志物LC3B、p62的mRNA表达，Western blot检测心肌组织中LC3B、Beclin-1、p62、p-AMPK及AMPK的蛋白表达，苏木精-伊红染色观察心肌组织的病理变化。

结果与结论：①脓毒症小鼠心肌损伤模型中自噬处于抑制状态；②与假手术组相比，模型组血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白T水平均升高(P < 0.05)，p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK无显著变化(P > 0.05)；③与模型组相比，二甲双胍组肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白T、p62水平均下降(P < 0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-AMPK/AMPK、Beclin-1均升高(P < 0.05)；④与二甲双胍组相比，二甲双胍+3-甲基腺嘌呤组肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白T、p62均升高(P < 0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1均下降(P < 0.05)；⑤假手术组心肌纤维正常，模型组心肌纤维排列紊乱，间质水肿，见大量炎症细胞浸润；二甲双胍组局部见少量空泡状改变；二甲双胍+3-甲基腺嘌呤组心肌纤维排列稍紊乱，见较多空泡状改变；⑥以上结果表明，二甲双胍预处理可能通过激活AMPK信号通路诱导自噬减轻脓毒症小鼠心肌损伤。

https://orcid.org/0009-0000-5657-6744(田勇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 二甲双胍, 自噬, 脓毒症, 炎症反应, 心肌损伤

Abstract: BACKGROUND: Sepsis complicated by myocardial injury is characterized by a high mortality. Metformin can prevent sepsis-induced myocardial dysfunction by exerting anti-inflammatory effects, improving oxidative stress, and reducing apoptosis. However, it is unclear whether metformin-induced autophagy plays an important role in the protective effect against sepsis-induced myocardial injury.
OBJECTIVE: To explore the effect of metformin pretreatment on myocardial injury in septic mice.
METHODS: A total of 40 male Kunming mice were randomly divided into sham operation group, model group, metformin group, and metformin+3-methyladenine group, with 10 mice in each group. The latter two groups were intraperitoneally injected with metformin for 14 days at a fixed time every day, and the metformin+3-methyladenine group was intraperitoneally injected with 3-methyladenine 1 hour before modeling. Twenty-four hours after the last injection of metformin, cecal ligation and perforation were used to construct a model of myocardial injury in septic mice. The sham operation group was not ligated and perforated. All mice were sacrificed 24 hours after surgery, and blood and myocardial specimens were collected. The levels of inflammatory factors and myocardial injury markers in serum were detected by ELISA. The mRNA expression of autophagy markers LC3B and p62 in myocardial tissue was detected by RT-qPCR. The protein expression of LC3B, Beclin-1, p62, p-AMPK, and AMPK in myocardial tissue was detected by western blot. The pathological changes in myocardial tissue were detected by hematoxylin-eosin staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Autophagy was inhibited in septic mice with myocardial injury. Compared with the sham operation group, the levels of serum tumor necrosis factor-α, interleukin-1β, interleukin-6, creatine kinase isoenzyme, and troponin T were increased in the model group (P < 0.05), but there was no significant difference in p62, LC3II/LC3I, and p-AMPK/AMPK between the two groups (P > 0.05). Compared with the model group, the levels of tumor necrosis factor-α, interleukin-6, creatine kinase isoenzyme, troponin T, and p62 were decreased in the metformin group (P < 0.05), while LC3II/LC3I, p-AMPK/AMPK and Beclin-1 level were increased (P < 0.05). Compared with the metformin group, the levels of tumor necrosis factor-α, interleukin-6, creatine kinase isoenzyme, troponin T, and p62 were increased in the metformin+3-methyladenine group (P < 0.05), while LC3II/LC3I and Beclin-1 level were decreased (P < 0.05). Myocardial hematoxylin-eosin staining indicated that myocardial fibers arranged normally in the sham operation group, but disorderedly in the model group, with interstitial edema and a large number of infiltrated inflammatory cells. A small amount of vacuolar changes were observed in the metformin group. The arrangement of myocardial fibers in the metformin+3-methyladenine group was slightly disordered, with more vacuolar changes. To conclude, metformin pretreatment may reduce myocardial injury in septic mice by activating the AMPK signaling pathway and inducing autophagy.

Key words: metformin, autophagy, sepsis, inflammatory response, myocardial injury

中图分类号:

田勇, 周颖, 古雍翔, 杨国辉. 二甲双胍预处理诱导心脏自噬减轻脓毒症小鼠的心肌损伤[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4469-4476.

Tian Yong, Zhou Ying, Gu Yongxiang, Yang Guohui. Metformin pretreatment induces cardiac autophagy to reduce myocardial injury in septic mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(28): 4469-4476.

图/表（结果） 8

2.1 造模小鼠的一般情况分析假手术组10 只小鼠及CLP 6 h组10 只小鼠全部存活，假手术组小鼠术后24 h精神、活动及进食正常，无腹泻、畏寒、排泄物异常增多等情况；CLP 6 h组小鼠精神稍萎靡，活动基本正常，无腹泻；CLP 12 h组在术后12 h内死亡1 只小鼠，余存活9 只小鼠出现畏寒、腹泻，进食明显减少，活动明显减少，精神萎靡；CLP 24 h组死亡4 只小鼠，存活6 只小鼠出现嗜睡、拒食、腹泻、竖毛、呼吸急促、眼部有较多分泌物、运动迟缓、不能直立。
2.2 造模小鼠炎症因子及心肌损伤标志物的变化 ELISA检测各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、CK-MB及cTnT水平，如图1所示，与假手术组相比，CLP各组炎症因子TNF-α、IL-1β水平均升高(P < 0.05)，以CLP 24 h组最为显著；与假手术组相比，CLP 12 h组和CLP 24 h组CK-MB、cTnT水平均显著升高(P < 0.05)，以CLP 24 h组更显著，而CLP 6 h组与假手术组相比无统计学差异(P > 0.05)，表明在CLP 12 h脓毒症小鼠心肌损伤模型构建成功，且CLP 24 h组较CLP 12 h组心肌损伤更重。

2.3 造模小鼠心肌组织中自噬水平 Western blot检测各组造模小鼠心肌组织自噬标志物(LC3B、p62)的表达水平，如图2所示，与假手术组相比，CLP 6 h组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ显著升高(P < 0.05)，之后逐渐降低，在CLP 24 h降至基础水平；与假手术组相比，CLP 6 h组p62表达水平显著降低(P < 0.05)，之后逐渐恢复，在CLP 24 h已恢复至基础水平，CLP 24 h组与假手术组相比无统计学差异(P > 0.05)，这提示在脓毒症早期，自噬处于高表达水平，但在脓毒症心肌损伤中自噬处于抑制状态，在CLP 24 h脓毒症小鼠中自噬处于基础水平，且心肌损伤较CLP 12 h严重，故此研究选择脓毒症心肌损伤中自噬处于显著抑制的时间点(24 h)进行后续研究。

2.4 二甲双胍预处理可诱导脓毒症小鼠心肌损伤中自噬水平 Western blot检测心肌组织中LC3B、Beclin-1及p62的表达情况，如图3所示，与模型组相比，二甲双胍组自噬标志物(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1)显著升高(P < 0.05)，且自噬底物p62显著降低(P < 0.05)；加用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对自噬进行抑制后，与二甲双胍组相比，二甲双胍+3-甲基腺嘌呤组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin-1降低且p62升高(P < 0.05)，这表明二甲双胍预处理可增强脓毒症小鼠心肌损伤中自噬水平，且可被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤部分抑制。

2.5 各组小鼠心肌组织中LC3B、p62的mRNA表达变化 RT-qPCR检测心肌组织中自噬标志物(LC3B、p62)的总mRNA表达水平，如图4所示，与模型组相比，二甲双胍组LC3B mRNA表达水平显著升高且p62 表达水平降低(P < 0.05)，与二甲双胍组相比，二甲双胍+3-甲基腺嘌呤组LC3B降低且p62升高(P < 0.05)，该结果与Western blot检测结果一致，这表明二甲双胍预处理可增强脓毒症小鼠心肌损伤中自噬水平。

2.6 二甲双胍预处理可减轻脓毒症小鼠心肌损伤用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中心肌损伤标志物(CK-MB、cTnT)水平，如图5所示，与假手术组相比，模型组心肌损伤标志物CK-MB、cTnT均显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，二甲双胍组心肌损伤标志物(CK-MB、cTnT)显著降低(P < 0.05)，表明二甲双胍预处理可减轻脓毒症心肌损伤；与二甲双胍组相比，二甲双胍+3-甲基腺嘌呤组CK-MB及cTnT均升高(P < 0.05)，二甲双胍对脓毒症心肌损伤的保护作用被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤部分消除，这表明二甲双胍预处理增强自噬在脓毒症小鼠心肌损伤的保护作用中扮演重要角色。

2.7 苏木精-伊红染色评估小鼠心肌组织病理改变如图6所示，假手术组光镜下心肌纤维细胞分界清楚，无紊乱及坏死，未见炎症细胞浸润；模型组心肌纤维排列紊乱，间质水肿，少量红细胞渗出，可见大量炎症细胞浸润；二甲双胍组心肌纤维稍水肿，局部见少量空泡状改变；二甲双胍+3-甲基腺嘌呤组心肌纤维排列稍紊乱，空泡状改变较二甲双胍组明显增多，见少量炎症细胞浸润，提示二甲双胍预处理对脓毒症心肌组织损伤具有一定的保护作用，这种保护作用可被3-甲基腺嘌呤部分逆转。

2.8 二甲双胍预处理诱导自噬减轻脓毒症心肌损伤中的炎症反应用ELISA检测各组血清中炎症因子TNF-α、IL-6水平，如图7所示，与假手术组相比，模型组TNF-α、IL-6水平均显著升高(P < 0.05)，与模型组相比，二甲双胍组TNF-α、IL-6水平均显著降低(P < 0.05)，加用3-甲基腺嘌呤对自噬进行抑制后，炎症因子(TNF-α、IL-6)水平升高(P < 0.05)，这表明二甲双胍预处理可通过增强自噬减少脓毒症小鼠炎症因子的释放。

2.9 二甲双胍预处理心肌中磷酸化AMPK的表达变化用Western blot检测AMPK信号通路中p-AMPK、AMPK的表达，如图8所示，模型组与假手术组相比p-AMPK/AMPK无统计学差异(P > 0.05)，与模型组相比，二甲双胍组p-AMPK/AMPK显著升高(P < 0.05)，二甲双胍可通过依赖性及非依赖性AMPK信号通路发挥药理作用，这结果表明二甲双胍可能主要通过激活AMPK信号通路来诱导脓毒症心肌损伤中的自噬水平。

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引言

脓毒症是指因感染引起宿主反应失调而导致危及生命的器官功能障碍[1]。心脏是脓毒症最常受损的靶器官之一，研究报道40%-50%的脓毒症患者并发有心肌损伤，随着疾病发展可引起心肌功能障碍，脓毒症心肌功能障碍(sepsis-induced myocardial dysfunction，SIMD)患者的死亡率可高达70%-90%[2-3]，这意味着迫切需要有效的治疗方法来降低SIMD患者的死亡率。但目前尚无治疗SIMD的特效药，且引起SIMD的机制尚未完全清楚，既往研究表明主要与感染引起的微循环障碍、炎症因子释放、自噬紊乱、氧化应激及线粒体功能障碍等息息相关[4]。目前研究认为适当的自噬水平在脓毒症并发心肌损伤中发挥重要的保护作用[5]。
二甲双胍作为2 型糖尿病的一线用药，研究发现其在脓毒症器官功能障碍中也发挥着重要的作用[6]。有研究表明腺苷单磷酸激酶[adenosine monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK]是二甲双胍发挥药理作用的重要靶点，二甲双胍的有益作用可能主要是通过调控AMPK信号通路来介导的，二甲双胍可通过上调AMPKα亚基的Thr172位点磷酸化来激活AMPK信号通路，活化的 AMPK可直接磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ULK1(unc-51-like kinase 1)促进自噬小体的形成而增强自噬[7-8]。自噬则是细胞利用溶酶体途径对胞内物质如过剩或功能受损的细胞器、蛋白质进行“自我消化”的降解过程[9]。自噬在脓毒症心肌细胞受损过程中起到保护心肌细胞并清除受损细胞器的作用，其在脓毒症早期即可参与受损细胞和细胞器的修复、回收及再利用等过程，从而减轻心肌损伤[10-11]。但自噬过强或不足均会导致组织器官损伤，在SIMD中自噬处于显著抑制状态，因此维持适当的自噬水平对脓毒症受损的心肌细胞起到重要的保护作用[12]。
研究表明二甲双胍可通过减轻炎症反应、氧化应激及调节免疫等多种机制对脓毒症心肌损伤发挥保护作用[6]，但尚未见二甲双胍是否可通过调控自噬减轻脓毒症小鼠心肌损伤的研究报道。基于二甲双胍可调控自噬的理论基础，作者推测二甲双胍也可能通过诱导自噬减轻脓毒症小鼠心肌损伤。该研究采用盲肠结扎穿孔术(cecum ligaction and puncture，CLP)构建脓毒症小鼠心肌损伤模型，在二甲双胍预处理后进行造模，ELISA检测炎症因子及心肌损伤标志物的表达，Western blot及PCR检测心肌中自噬蛋白的表达，苏木精-伊红染色观察心肌组织病理改变，探究二甲双胍预处理是否能诱导脓毒症小鼠心肌损伤的自噬水平及对受损心肌的影响，以期为二甲双胍用于治疗脓毒症心肌功能障碍提供新的理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022 年8-11 月在贵州医科大学实验动物中心造模及取材，其余实验于2022 年9 月至2023 年4 月在贵州医科大学分子生物学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性昆明小鼠80 只，其中40 只用于前期模型的验证，另外40 只用于后期的药物干预实验，健康清洁级，6-8 周龄，体质量25-30 g，购自贵州医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK(辽)2020-0001。饲养条件：小鼠每笼10 只，在贵州医科大学实验动物中心喂养，条件一致，自然光照，自由进食及饮水，环境温度23-25 ℃，湿度50%-55%，每天定时更换饮用水、饲料及笼内垫料，常规适应性喂养7 d后进行后续实验。实验得到贵州医科大学实验动物伦理委员会批准，批准号：2201502。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂及仪器盐酸二甲双胍(美国Sigma)；3-甲基腺嘌呤(美国MCE)；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒(Solarbio公司)；兔源单克隆LC3B抗体(货号：T55992)、兔源单克隆Beclin-1抗体(货号：T55092)及兔源单克隆p62抗体(货号：T55546)(Abmart公司)；兔源单克隆二抗(货号：T55546，Signalway Antibody公司)；山羊抗鼠二抗(雅酶公司)；肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)ELISA试剂盒、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)ELISA试剂盒及白细胞介素1β (interleukin-1β，IL-1β)ELISA 试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司)；电泳及转膜仪(北京东方瑞利科技有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 脓毒症心肌损伤动物模型的构建按随机数字表法将40 只雄性昆明小鼠分为假手术组、CLP 6 h组、CLP 12 h组及CLP 24 h组，每组10 只。术前禁食12 h、禁饮6 h。参照课题组蒋大军等[13]的制模方法，各组小鼠术前给予2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)右下腹腹腔注射，待麻醉满意后，仰卧位固定，手术部位常规备皮、消毒及铺巾，在腹正中偏左0.5 cm处作长约1 cm 纵行切口，钝性分开腹膜，找到盲肠，用直尺测量长度并选距盲端1/2处结扎，在结扎端中段用22 号针头避开血管来回穿刺2 次，轻柔挤出少许肠内容物后将盲肠放回腹腔并逐层缝合，术后在颈背部皮下注射1 mL温(37 ℃)生理盐水补液，分笼放回动物房，苏醒后自由进食饮水。假手术组小鼠除未进行盲肠结扎穿孔外，余同CLP组。假手术组在术后24 h，CLP组在术后相应时间点麻醉后用摘眼采血法采血，采血完成后用颈椎脱臼法处死小鼠，立即留取心脏。
1.4.2 药物干预实验按随机数字表法将剩余40 只雄性昆明小鼠分为假手术组、模型组、二甲双胍组、二甲双胍+3-甲基腺嘌呤组，每组10 只。参考JINPIAO等[14]给药剂量及给药时间，即在每日固定时间点给予二甲双胍(200 mg/kg，1 次/d)，连续腹腔注射14 d，假手术组及模型组注射相同溶剂的生理盐水，二甲双胍+3-甲基腺嘌呤组参照LI等[15]的给药剂量及方式在建模前1 h给予3-甲基腺嘌呤(10 mg/kg)腹腔注射，余组注射相同剂量的生理盐水，在末次注射二甲双胍后24 h对小鼠进行手术建模，各组小鼠在术后24 h时间点麻醉后用摘眼采血法采血，采血完成后用颈椎脱臼法处死小鼠，立即留取心脏用于后续实验。
1.4.3 血清TNF-α、IL-1β、IL-6、cTnT、CK-MB水平测定小鼠麻醉后剪去胡须，取右侧眼球血0.3-0.7 mL，常温放置30 min后4 ℃、2 500 r/min离心20 min，吸取上清并放-80 ℃冰箱保存，根据ELISA试剂盒测定各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、cTnT及CK-MB水平，酶标仪450 nm波长处测吸光度值，绘制标准曲线并计算各指标水平。
1.4.4 心肌苏木精-伊红染色切取左心室最大横径冠状面的心肌组织，放入10 倍体积的体积分数10%中性甲醛固定液中，固定后包埋并切厚为0.3-0.5 μm的切片，进行苏木精-伊红染色，光镜下观察各组心肌组织病理学变化，剩余的心肌组织冻存于-80 ℃冰箱，用于后续的实时荧光定量PCR及Western blot 检测。

1.4.5 实时荧光定量PCR检测心肌组织中p62、LC3B mRNA的表达在取材后的5 个月内完成p62、LC3B mRNA检测，引物设计及合成由上海生工生物工程股份有限公司完成，见表1。按照Trizol 试剂说明书操作提取心肌组织中总RNA，测定浓度，A260 nm/A280 nm在1.8-2.0之间，取1 μg RNA的量反转录成cDNA，将反转录的cDNA分装并保存于-80 ℃冰箱。适时荧光定量PCR，第1步：预变性 95 ℃ 30 s 循环1 次，第2步：变性95 ℃(15 s)，退火/延伸60 ℃(30 s)，循环40次，仪器默认熔解曲线95 ℃(10 s)、65 ℃(5 s)、95 ℃(0.5 s)，进行扩增。每组设3 个复孔进行重复，以2-∆∆Ct计算心肌组织中p62、LC3B mRNA相对表达量。

1.4.6 Western blot检测AMPK及自噬蛋白的表达从-80 ℃冰箱取出小鼠心脏，称取约50 mg心肌组织，每管加入含蛋白酶磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液350 μL，在冰上用眼科剪尽可能剪碎心肌组织，用超声波碎裂组织3 次，继续在冰上裂解30 min，裂解完成后置于4 ℃离心机中12 000 r/min离心20 min，收集上清并行BCA定量，最后恒温干浴锅100 ℃，高温煮沸变性10 min，使用10%、12%的 SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗LC3B(1∶1 500)、Beclin-1(1∶1 500)、p62(1∶7 500)，GAPDH(1∶200 000) 4 ℃摇床孵育过夜，二抗室温孵2 h(1∶6 000)，ECL显影，Image J软件对条带灰度值分析。
1.5 主要观察指标 ①各组小鼠的一般情况；②血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平评估小鼠炎症反应；③血清cTnT、CK-MB水平评估小鼠心肌损伤情况；④Western blot检测自噬蛋白LC3B、p62、Beclin-1的相对表达量；⑤苏木精-伊红染色观察心肌组织病理改变；⑥RT-qPCR检测心肌组织中LC3B、p62的mRNA表达水平。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析并绘制统计图，多组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较，当方差齐时，采用最小显著性差异(LSD)分析，当方差不齐时，采用 Tamhane 检验分析。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学分析方法由贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

脓毒症仍是全世界面临的主要健康问题之一，其具有高发病率、高死亡率的特点，尽早识别、有效干预及防治并发症仍是降低死亡率的关键[16-17]。心肌损伤是脓毒症常见且严重的并发症，脓毒症并发心肌损伤是脓毒症患者死亡的主要原因之一[18]，但引起脓毒症心肌损伤的病理生理机制尚未完全清楚，目前研究认为主要与感染引起的过度炎症反应、氧化应激、自噬紊乱、线粒体功能障碍等因素有关，作为脓毒症心肌损伤重要保护机制之一的自噬仍是目前研究的热点[4]。有研究报道适当的自噬水平可通过清除病原体、对受损细胞及细胞器的修复、回收及再利用等方式保护受损细胞，但在脓毒症心肌损伤严重阶段自噬处于显著抑制状态[5，11]。因此，作者推测适当提高自噬水平可能对脓毒症心肌损伤具有一定的保护作用。该研究采用CLP构建脓毒症小鼠心肌损伤模型，模拟临床上消化道穿孔诱发多菌性腹膜炎，进而并发脓毒症心肌损伤，该模型是目前较为成熟的研究方式[19]。研究结果表明，在CLP术后6 h小鼠炎症因子(TNF-α、IL-1β)水平高于假手术组，小鼠能正常活动，精神稍差，在CLP术后12 h及24 h，炎症因子(TNF-α、IL-1β)水平及心肌损伤标志物(cTnT、CK-MB)相较于假手术组均显著升高，24 h时间点升高更显著，且小鼠精神萎靡、活动明显减少、眼眶有较多分泌物，这些结果表明在CLP术后6 h小鼠出现脓毒症的表现，在CLP术后12 h小鼠脓毒症心肌损伤造模成功，CLP术后24 h时间点较12 h时间点脓毒症心肌损伤更重。在建模的基础上进行了自噬表达水平变化的探究，研究发现在CLP术后6 h自噬关键标志物LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平较假手术组显著升高，在CLP术后24 h已降低至基础水平；自噬底物p62在CLP术后6 h较假手术组显著降低，在CLP术后24 h已恢复至基础水平，这些结果表明在脓毒症早期自噬水平显著增高，在脓毒症并发心肌损伤阶段自噬处于相对抑制状态。与此研究结果一致的文献报道[20]，在CLP所诱导的脓毒症C56BL/6 小鼠模型中，心脏中自噬标志物LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在CLP术后4-6 h达到峰值，自噬溶酶体在CLP术后8 h开始下降，自噬底物p62开始堆积，这些指标在CLP术后24 h已恢复至基础水平，脓毒症心肌损伤中自噬的抑制加速了心肌细胞的凋亡，进一步加重心肌的损伤。因此适当提高自噬水平可能是治疗脓毒症心肌损伤的潜在治疗靶点，该研究最终选择脓毒症心肌损伤严重自噬处于抑制状态的CLP术后24 h时间点进行后续的药物干预研究。
二甲双胍于20 世纪首先在法国被发现，现已广泛用作2 型糖尿病的一线用药[21]。近年来发现其除具有抗肿瘤、降血脂、抗衰老等作用外，在脓毒症并发器官功能障碍中也具有一定的保护作用[6，22]。有研究报道，二甲双胍可通过减轻内毒素所诱导的炎症反应，从而减轻脓毒症小鼠及斑马鱼心肌细胞炎性损伤[23-24]；二甲双胍可通过调节肠道微生物群和代谢产物，减轻脓毒症所并发的肝及神经损伤[25-26]；二甲双胍可通过减轻氧化应激，减轻脓毒症所并发的肺及脑损伤[27-28]。
但二甲双胍对脓毒症心肌损伤的保护机制尚未完全阐明，尚未见二甲双胍是否可通过诱导自噬减轻脓毒症小鼠心肌损伤的研究报道，基于此作者进行了相关探究。该研究发现，相较于模型组，二甲双胍组心肌组织中自噬标志物LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1的表达水平显著升高，而自噬底物p62降低，这些结果都表明二甲双胍预处理可诱导脓毒症小鼠心肌损伤中自噬；经ELISA检测二甲双胍组血清中心肌损伤标志物(CK-MB、cTnT)及炎症因子(TNF-α、IL-6)显著低于模型组，同时心肌组织苏木精-伊红染色也发现二甲双胍组心肌组织炎症因子浸润、细胞紊乱较模型组明显减轻，这些结果提示二甲双胍预处理诱导自噬与脓毒症小鼠心肌损伤的减轻可能存在相关性。但自噬是把“双刃剑”，既往动物及细胞实验也表明二甲双胍可通过减轻炎症反应、氧化应激及细胞凋亡等多种机制对脓毒症心肌损伤起到一定的保护作用[6，29-30]，二甲双胍所诱导的自噬在脓毒症心肌损伤中所扮演的角色尚不清楚，为进一步探究二甲双胍诱导的自噬对脓毒症心肌损伤的作用，在二甲双胍干预的基础上加用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对自噬进行抑制，结果发现二甲双胍+3-甲基腺嘌呤组较二甲双胍组心肌组织中自噬水平降低，小鼠心肌组织损伤加重，血清炎症因子及心肌损伤标志物升高，二甲双胍对脓毒症心肌损伤的保护作用被部分逆转，这些结果表明二甲双胍所诱导的自噬在脓毒症小鼠心肌损伤中具有一定的保护作用，经文献检索尚未发现有关二甲双胍诱导自噬减轻脓毒症小鼠心肌损伤的研究报道。与此研究结果一致，WU等[31]研究表明在体外及体内实验中木犀草素可通过增强自噬、减轻炎症反应、减少细胞凋亡等多种方式保护脓毒症心肌损伤，加用3-甲基腺嘌呤对自噬进行抑制后木犀草素的保护作用被减弱；TANG等[32]研究发现水仙环素可通过增强自噬减轻脓毒症并发的心肌损伤，应用基因敲除技术对小鼠自噬基因ATG5敲低后，水仙环素对脓毒症心肌损伤的保护作用减弱；WANG等[33]研究发现氯马斯汀可通过促进自噬减轻心肌细胞凋亡；WU等[34]研究也发现二甲双胍可通过调节自噬通量减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。这些结果都表明增强自噬对心肌细胞损伤具有一定的保护作用，有趣的是此研究还发现二甲双胍所诱导的自噬可减轻脓毒症小鼠心肌损伤中的炎症反应。
脓毒症心肌损伤的机制极其复杂，是感染导致宿主反应失调的结果，而不是单纯某一方面占主导地位，作为重要保护机制的自噬也处于抑制状态，适当提高自噬水平可通过调节T细胞、B细胞及异常的巨噬细胞直接或间接地改善免疫抑制、减轻炎症反应而减轻心肌损伤[35-36]。自噬则是二甲双胍发挥药理作用的重要介质，但二甲双胍对自噬具有双重调节作用，其既可通过AMPK相关信号通路诱导自噬，也可通过AMPK/核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路抑制自噬[37]，这意味着如需研究二甲双胍对自噬的调控作用，则需将二甲双胍的药理作用与不同组织或器官的病理生理有机结合起来。有研究报道，二甲双胍在心肌缺血再灌注损伤中既可通过促进自噬对受损心肌发挥保护作用，也可通过抑制自噬对受损心肌发挥保护作用，这可能与自噬在心肌缺血阶段处于低表达水平而在再灌注阶段处于高表达水平有关[38-39]。
该研究在前期建模中已表明在CLP术后24 h时间点自噬处于基础水平，与作者预期的结果一致，长时程二甲双胍预处理在CLP术后24 h时间点增强自噬减轻了脓毒症小鼠心肌损伤，但在其他时间点二甲双胍是否可诱导自噬对脓毒症心肌损伤发挥保护作用尚不清楚，这有待进一步研究。
AMPK是一种高度保守的新陈代谢主要调节剂，可在细胞及机体生理水平的代谢应激期间调控能量平衡，二甲双胍发挥对心血管疾病保护作用的药理靶点可能主要通过调控AMPK来实现，二甲双胍可直接抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ，导致ADP/ATP比值增加而激活AMPK[40-41]。AMPK作为自噬的经典信号通路，它在自噬启始的最上游发挥作用，其可激活自噬的关键启始因子ULK1、Beclin-1而诱导自噬[42-43]。因此，二甲双胍在脓毒症小鼠心肌损伤中诱导自噬可能与激活AMPK信号通路有关。该研究结果也表明二甲双胍组p-AMPK/AMPK比值较模型组显著增高，这也提示二甲双胍预处理增强脓毒症小鼠心肌损伤中自噬水平可能是通过激活AMPK信号通路来实现的，有研究报道，二甲双胍可直接抑制NF-κB信号通路减少TNF-α、IL-6等炎症因子的释放从而减轻脓毒症[44]。在脓毒症中抑制炎症可诱导自噬，因此后续还需应用抑制剂或基因敲除等方法来进一步验证二甲双胍是否主要通过激活AMPK信号通路来增强脓毒症小鼠心肌损伤中的自噬。有研究报道，长时程二甲双胍预处理相对于急性给药能显著提高血药浓度，更有利于激活AMPK信号通路而诱导自噬，在脓毒症中短时程的二甲双胍预处理甚至可抑制自噬[45-47]。该研究采用二甲双胍连续腹腔注射14 d预处理干预脓毒症心肌损伤小鼠模型。众所周知，二甲双胍的常见不良反应是胃肠道反应及乳酸性酸中毒，虽然二甲双胍灌胃更接近临床，但灌胃有不稳定的弊端，可能出现灌入气道、呕吐、胃肠道反应轻重不一等因素影响药物的一致性，因此最终采用腹腔注射给药。有研究表明，虽然二甲双胍有发生乳酸性酸中毒的风险，但正常剂量给药极为罕见，而是利大于弊[48]。
在脓毒症中自噬与炎症是动态变化的，在脓毒症早期自噬被激活，在脓毒症严重阶段自噬处于紊乱状态，自噬功能的失调在动物模型及人类疾病中通常表现为炎症反应的失调。脓毒症可激活机体的免疫系统，释放TNF-α、IL-1β、IL-6等大量的炎症因子导致心肌损伤，且炎症反应失衡是脓毒症心肌损伤的重要基础[49-51]。自噬则在调节脓毒症免疫细胞炎症反应中起着关键作用，适当的自噬水平有利于细胞维持稳态，在细胞应激反应中对维持细胞正常功能起到关键作用[12]。该研究结果也表明二甲双胍预处理既可通过诱导自噬减轻脓毒症心肌损伤，也可通过诱导自噬减少脓毒症炎症因子的释放。与此研究结果一致的是，NIKOUEE等[52]研究发现在脓毒症中Beclin-1的过表达可促进自噬，减轻炎症反应，改善心肌线粒体损伤，从而改善脓毒症心肌损伤。
该研究采用脓毒症模型研究的“金标准”CLP来诱导脓毒症小鼠心肌损伤，模拟临床上消化道穿孔所诱导的脓毒症心肌损伤，探讨二甲双胍诱导自噬对脓毒症心肌损伤的作用。但该研究也存在一些不足：首先，由于经费有限等原因，仅在动物层面进行研究，并未采用细胞转染技术对通路进行沉默，未应用基因敲除技术对自噬及信号通路从基因层面进行验证；其次，自噬是动态变化过程，该研究仅选择其中一个时间点进行研究，并且未在人体方面进行验证，这都需要后续的进一步研究。当然增强自噬减轻炎症反应改善脓毒症心肌损伤也只是治疗脓毒症心肌损伤的一部分，仍需将抗生素的规范使用、容量管理及宿主的调控等多因素结合起来才能更有利于脓毒症心肌损伤患者的治疗。
综上所述，脓毒症心肌损伤是脓毒症常见且严重并发症，在严重脓毒症心肌损伤阶段自噬处于抑制状态，二甲双胍预处理可能通过激活AMPK信号通路诱导自噬减轻脓毒症小鼠心肌损伤。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

二甲双胍预处理诱导心脏自噬减轻脓毒症小鼠的心肌损伤

Metformin pretreatment induces cardiac autophagy to reduce myocardial injury in septic mice

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