circCDR1as/miR-7-5p/RAF1轴参与调控激素性股骨头坏死中的自噬

doi:10.12307/2024.453

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (28): 4455-4460.doi: 10.12307/2024.453

• 骨组织构建 bone tissue construction • 上一篇下一篇

circCDR1as/miR-7-5p/RAF1轴参与调控激素性股骨头坏死中的自噬

翟生，艾克热木江•阿尔肯，张峥，日夏提•帕尔哈提，郝飞虎

新疆医科大学第五附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000

收稿日期:2023-07-17 接受日期:2023-08-09 出版日期:2024-10-08 发布日期:2023-11-27
通讯作者: 翟生，硕士，主任医师，新疆医科大学第五附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000
作者简介:翟生，男，1975年生，河南省驻马店市人，汉族，2005年新疆医科大学毕业，硕士，主任医师，主要从事骨与关节创伤的研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2021D01C426)，项目负责人：翟生

CircCDR1as/miR-7-5p/RAF1 axis promotes autophagy levels in steroid-induced necrosis of the femoral head

Zhai Sheng, Aikeremujiang • Aerken, Zhang Zheng, Rixiati • Paerhati, Hao Feihu

Department of Orthopedics, The Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2023-07-17 Accepted:2023-08-09 Online:2024-10-08 Published:2023-11-27
Contact: Zhai Sheng, Department of Orthopedics, The Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Zhai Sheng, Master, Chief physician, Department of Orthopedics, The Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2021D01C426 (to ZS)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

激素性股骨头坏死：是一种因长期或大剂量使用皮质类固醇药物而引发的疾病，导致骨组织缺血和坏死。激素性股骨头坏死的发病机制至今尚未完全明了，目前认为与皮质激素导致的血脂代谢异常和细胞损伤等因素有关。近年来，有研究发现环状RNA可能在调控皮质激素诱导的股骨头坏死的过程中发挥重要作用。
自噬：是细胞内的一种自我清理和更新的过程，其由细胞内的自噬体进行，可以帮助细胞保持内部环境的稳定和清洁，是维持细胞生命活动正常进行的重要机制。自噬过程主要分为3个阶段：自噬体的形成、自噬体与溶酶体的融合以及溶酶体对自噬体内物质的降解。

背景：自噬可能参与激素性股骨头坏死的病理过程。有研究证实环状RNA(circular RNA，circRNA)在激素性股骨头坏死中具有调控机制，然而，circCDR1as是否在激素性股骨头坏死中影响自噬尚未被研究。

目的：探讨激素性股骨头坏死中自噬水平及circCDR1as的调控机制。
方法：①从GSE26316数据集中获取激素性股骨头坏死及对照组大鼠的基因表达谱并进行差异表达分析，随后分析差异表达基因的生物学功能。通过数据库预测circCDR1as的靶标miRNAs及靶标基因。比较靶标基因与差异表达基因，构建circCDR1as的调控网络。②收集激素性股骨头坏死患者及健康对照人群的股骨头样本；同时应用骨髓间充质干细胞进行细胞实验：随机分为骨髓间充质干细胞组、模型组(甲泼尼龙处理)、模型+si-NC组、模型+ si-CDR1as组。利用RT-qPCR检测组织和细胞circCDR1as及靶标基因的表达，Western blot检测自噬相关蛋白的表达。③构建荧光素酶报告基因载体：pmirGLO-CDR1as (WT)、pmirGLO-RAF1 (WT)、pmirGLO-CDR1as (MUT)和pmirGLO-RAF1 (MUT)，转染到细胞中，并设miR-7-5p mimic和mimic NC组，检测circCDR1as网络的靶向调控关系。

结果与结论：①大鼠激素性股骨头坏死组与对照组之间鉴定了1 283个差异表达基因，主要参与细胞凋亡和自噬信号通路。预测发现circCDR1as靶向调控6个miRNAs，这些miRNAs靶向调控305个靶标基因，其中有31个靶标基因在激素性股骨头坏死中差异表达，RAF1参与自噬被选择为关键基因，并构建了circCDR1as/miR-7-5p/RAF1的调控网络。②与对照组比较，circCDR1as，RAF1和自噬水平在激素性股骨头坏死患者及激素诱导的骨髓间充质干细胞中表达上调(P < 0.05)，miR-7-5p表达下调(P < 0.05)；敲降circCDR1as后细胞自噬水平显著下降(P < 0.05)。③双荧光素酶报告检测证实了circCDR1as与miR-7-5p以及miR-7-5p与RAF1的靶向调控关系。④结论：CircCDR1as/miR-7-5p/RAF1可能通过自噬信号促进激素性股骨头坏死，靶向circCDR1as是通过部分自噬修复治疗激素性股骨头坏死的潜在策略。

https://orcid.org/0009-0003-8365-5132(翟生)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 激素性股骨头坏死, 自噬, circCDR1as, RAF1, 信号通路, 靶向调控

Abstract: BACKGROUND: Autophagy may be involved in the pathological process of steroid-induced necrosis of the femoral head (SINFH). Some studies have confirmed that circular RNAs (circRNAs) have a regulatory mechanism in SINFH; however, whether circCDR1as affects autophagy in SINFH has not been investigated.
OBJECTIVE: To explore the level of autophagy and the regulatory mechanism of circCDR1as in SINFH.
METHODS: Gene expression profiles of SINFH and control rats were extracted from the GSE26316 dataset and differential expression analysis was performed. Subsequently, the biological functions of differentially expressed genes were analyzed. Then, the target miRNAs of circCDR1as and the target genes of target miRNAs were predicted. Further, the target genes were compared with the differentially expressed genes to construct the regulatory network of circCDR1as. In addition, femoral head samples from patients with SINFH and healthy control individuals were collected. Bone marrow mesenchymal stem cells were also applied for cellular experiments and randomly divided into bone marrow mesenchymal stem cell group, model group (methylprednisolone-treated), model+si-NC group, and model+si-CDR1as group. RT-qPCR was used to detect the expression of circCDR1as and target genes in cells and tissue samples. Western blot was used to examine the expression of autophagy proteins. The luciferase reporter gene vectors, pmirGLO-CDR1as (WT), pmirGLO-RAF1 (WT), pmirGLO-CDR1as (MUT), and pmirGLO-RAF1 (MUT), were constructed and transfected into the cells. miR-7-5p mimic and mimic NC groups were established. The target-regulatory relationship of the circCDR1as network was detected.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 1 283 differentially expressed genes were identified between the SINFH and control groups, which were mainly involved in apoptotic and autophagic signaling pathways. Prediction analysis revealed that circCDR1as targeted 6 miRNAs, which in turn regulated 305 target genes. Among these target genes, 31 showed differential expression in SINFH. Among the differentially expressed target genes, RAF1, involved in autophagy, was selected as a key gene, leading to the construction of the circCDR1as/miR-7-5p/RAF1 regulatory network. Compared with the control group, circCDR1as, RAF1, and autophagy levels were upregulated in patients with SINFH and in hormone-induced bone marrow mesenchymal stem cells (P < 0.05), while miR-7-5p expression was downregulated (P < 0.05). Knockdown of circCDR1as significantly decreased cellular autophagy levels (P < 0.05). Dual-luciferase reporter assays confirmed the targeting relationships between circCDR1as and miR-7-5p, as well as between miR-7-5p and RAF1. To conclude, the CircCDR1as/miR-7-5p/RAF1 may potentially promote SINFH through autophagy. Targeting circCDR1as is a potential strategy for partial autophagic repair in the treatment of SINFH.

Key words: steroid-induced necrosis of the femoral head, autophagy, circCDR1as, RAF1, signaling pathway, target regulation

中图分类号:

翟生, 艾克热木江•阿尔肯, 张峥, 日夏提•帕尔哈提, 郝飞虎. circCDR1as/miR-7-5p/RAF1轴参与调控激素性股骨头坏死中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4455-4460.

Zhai Sheng, Aikeremujiang • Aerken, Zhang Zheng, Rixiati • Paerhati, Hao Feihu. CircCDR1as/miR-7-5p/RAF1 axis promotes autophagy levels in steroid-induced necrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(28): 4455-4460.

图/表（结果） 6

2.1 SINFH中的差异表达基因通过在GSE26316中对大鼠SINFH组和对照组进行差异分析鉴定了1 283个差异表达基因，其中包括个649上调表达基因和634个下调表达基因，见图1A。富集分析发现这些差异表达基因主要参与细胞凋亡和自噬信号通路，见图1B。

2.2 鉴定circCDR1as调控网络为了探究circRNA在SINFH中的调控机制，通过3个数据库对circCDR1as的靶向miRNAs进行了预测，最终发现circCDR1as可能调控6个miRNAs(见图2A)。进一步的分析发现，这些miRNAs可以靶向调控305个基因(见图2B)，其中包括31个基因在SINFH中表现出差异表达的基因(见图2C)。在31个基因中，RAF1参与自噬通路而作为研究重点，并构建了circCDR1as/miR-7-5p/RAF1的调控网络(见图2D)。

2.3 调控网络和自噬水平的验证对SINFH患者的股骨头样本检测后发现，相较于对照组，SINFH患者中circCDR1as和RAF1的mRNA水平显著升高(P < 0.05)，而miR-7-5p的表达则显著下降(P < 0.05)；与对照组比较，SINFH患者的自噬相关蛋白LC3B和p62的mRNA水平也显著升高(P < 0.05)，见图3A；与对照组比较，SINFH患者中的RAF1、LC3B和p62的蛋白水平也显著升高(均为P < 0.05)，见图3B。

2.4 circCDR1as调控网络促进自噬对激素诱导的BMSCs检测后发现，转染si-circCDR1as显著提高了BMSCs的增殖(见图4A)。与对照组比较，模型组中circCDR1as和RAF1的mRNA水平显著升高(P < 0.05)，转染si-circCDR1as后显著下降；miR-7-5p的表达则显著下降(P < 0.05)，转染si-circCDR1as后显著升高；模型组中LC3B和p62的mRNA水平显著升高(P < 0.05)，转染si-circCDR1as后显著下降，见图4B。

与对照组比较，模型组中RAF1的蛋白水平显著升高(P < 0.05)，转染si-circCDR1as后显著下降；模型组LC3B和p62蛋白水平也显著升高(P < 0.05)，转染si-circCDR1as后显著下降，见图5。

2.5 circCDR1as靶向调控miR-7-5p和RAF1的结果双荧光素酶报告检测实验结果证实，circCDR1as可以靶向调控miR-7-5p，而miR-7-5p可以进一步靶向调控RAF1，见图6。

参考文献

[1] FU D, QIN K, YANG S, et al. Proper mechanical stress promotes femoral head recovery from steroid-induced osteonecrosis in rats through the OPG/RANK/RANKL system. BMC Musculoskelet Disord. 2020;21:281.
[2] REN GW, WEN SB, HAN J, et al. Network-Based Pharmacology and Bioinformatics Study on the Mechanism of Action of Gujiansan in the Treatment of Steroid-Induced Avascular Necrosis of the Femoral Head. Biomed Res Int. 2022;2022:8080679.
[3] LIU J, LI C, YANG F, et al. Effects of angiotensin II combined with asparaginase and dexamethasone on the femoral head in mice: A model of steroid-induced femoral head osteonecrosis. Front Cell Dev Biol. 2022;10:975879.
[4] ZHANG F, PENG W, WANG T, et al. Lnc Tmem235 promotes repair of early steroid-induced osteonecrosis of the femoral head by inhibiting hypoxia-induced apoptosis of BMSCs. Exp Mol Med. 2022;54:1991-2006.
[5] ZHAO D, ZHANG F, WANG B, et al. Guidelines for clinical diagnosis and treatment of osteonecrosis of the femoral head in adults (2019 version). J Orthop Translat. 2020;21:100-110.
[6] LI Z, SHAO W, LV X, et al. Advances in experimental models of osteonecrosis of the femoral head. J Orthop Translat. 2023;39:88-99.
[7] LIN T, CAI K, YANG P, et al. Composite indices of femoral neck strength predicts the collapse of steroid-associated osteonecrosis of the femoral head: a retrospective study. BMC Musculoskelet Disord. 2022;23:722.
[8] LU C, QI H, XU H, et al. Global research trends of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head: A 30-year bibliometric analysis. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:1027603.
[9] LIU B, GAO F, XIU X, et al.Denosumab Can Prevent Collapse in Patients with Early-Stage Steroid-Induced Osteonecrosis of the Femoral Head by Inhibiting Osteoclasts and Autophagy. Orthop Surg. 2023;15:256-265.
[10] 刘树义, 李凯, 兰凯, 等. 细胞自噬在激素性股骨头缺血坏死大鼠发病中的作用[J].中国老年学杂志,2023,43(4):896-900.
[11] KRISTENSEN LS, ANDERSEN MS, STAGSTED LVW, et al.The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet. 2019;20: 675-691.
[12] 成衍男, 潘振宇. 激素性股骨头坏死发病机制的研究进展[J].临床外科杂志,2023,31(4):301-304.
[13] CHEN G, WANG Q, LI Z, et al. Circular RNA CDR1as promotes adipogenic and suppresses osteogenic differentiation of BMSCs in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head. Bone. 2020;133:115258.
[14] IRIZARRY RA, HOBBS B, COLLIN F, et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 2003;4:249-264.
[15] LIANG C, LI W, HUANG Q, et al. CircFKBP5 Suppresses Apoptosis and Inflammation and Promotes Osteogenic Differentiation. Int Dent J. 2023;73:377-386.
[16] PAN X, CEN X, ZHANG B, et al. Circular RNAs as potential regulators in bone remodeling: a narrative review. Ann Transl Med. 2021;9:1505.
[17] 艾克热木江•阿尔肯, 日夏提•帕尔哈提, 张峥, 等. 敲低CircCDR1as在糖皮质激素诱导的骨微血管内皮细胞活性及血管生成中的作用研究[J]河北医学,2022,28(12):1937-1943.
[18] KYEI B, LI L, YANG L, et al.CDR1as/miRNAs-related regulatory mechanisms in muscle development and diseases. Gene. 2020;730:144315.
[19] HUANG C, WEN Z, NIU J, et al. Steroid-Induced Osteonecrosis of the Femoral Head: Novel Insight Into the Roles of Bone Endothelial Cells in Pathogenesis and Treatment. Front Cell Dev Biol. 2021;9:777697.
[20] JIANG B, ZHU SH, ZENG JY, et al. Plasma and local expressions of CircRNA CDR1as are linked with disease severity in patients with non-traumatic osteonecrosis of femoral head. J Orthop Surg Res. 2020;15:592.
[21] 高岭, 郅克谦. 低氧微环境下circCDR1as通过AKT/ERK?/mTOR通路调控自噬促进口腔鳞状细胞存活的实验研究[C]. 2019第一届全国口腔颌面-头颈肿瘤学术大会——聚合引领、协同发展论文汇编, 上海:2019.
[22] CUI L, HUANG C, ZHOU D. Overexpression of circCDR1as drives oral squamous cell carcinoma progression. Oral Dis. 2023;29:957-967.
[23] TANG X, WANG J, XIA X, et al. Elevated expression of ciRS-7 in peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients. Diagn Pathol. 2019;14(1):11.
[24] MO L, WANG Z, HUANG H, et al. Integrated Analysis of Crucial Genes and miRNAs Associated with Osteoporotic Fracture of Type 2 Diabetes. Biomed Res Int. 2022;2022:3921570.
[25] HAN J, LUO Z, WANG Y, et al. LncRNA ZFAS1 protects chondrocytes from IL-1beta-induced apoptosis and extracellular matrix degradation via regulating miR-7-5p/FLRT2 axis. J Orthop Surg Res. 2023;18:320.
[26] LIU C, LIU J, CHEN H. Overexpression of miR-7-5p Promoted Fracture Healing Through Inhibiting LRP4 and Activating Wnt/beta-Catenin Pathway. Int J Low Extrem Wounds. 2023:15347346231157443.
[27] WANG C, TANG Z, ZHANG Z, et al. MiR-7-5p suppresses invasion via downregulation of the autophagy-related gene ATG7 and increases chemoresistance to cisplatin in BCa. Bioengineered. 2022;13:7328-7339.
[28] MA C, GU R, WANG X, et al. circRNA CDR1as Promotes Pulmonary Artery Smooth Muscle Cell Calcification by Upregulating CAMK2D and CNN3 via Sponging miR-7-5p. Mol Ther Nucleic Acids. 2020;22:530-541.
[29] LIANG XZ, LUO D, CHEN YR, et al. Identification of potential autophagy-related genes in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head via bioinformatics analysis and experimental verification. J Orthop Surg Res. 2022;17:86.
[30] ZHANG B, LI F, ZHU Z, et al. CircRNA CDR1as/miR-1287/Raf1 Axis Modulates Hepatocellular Carcinoma Progression Through MEK/ERK Pathway. Cancer Manag Res. 2020;12:8951-8964.
[31] ZHANG P, ZHENG Z, LING L, et al. w09, a novel autophagy enhancer, induces autophagy-dependent cell apoptosis via activation of the EGFR-mediated RAS-RAF1-MAP2K-MAPK1/3 pathway. Autophagy. 2017;13: 1093-1112.
[32] 马海龙, 赵振群, 刘万林, 等. 自噬基因微管相关蛋白1轻链3参与模型兔激素性股骨头缺血坏死的发生与发展[J].中国组织工程研究,2022,26(32):5167-5172.

引言

激素性股骨头坏死(steroid-induced necrosis of femoral head，SINFH)是指由长期大剂量或反复使用激素引起的股骨头血液供应中断，进而引起骨细胞死亡[1-2]。SINFH导致骨骼结构改变、骨折和塌陷引起严重的髋关节疼痛和关节功能障碍，影响患者的生活质量[3-4]。随着糖皮质激素的广泛应用，SINFH的发病率越来越高，仅中国就有812万SINFH患者[5]。全髋关节置换术是严重SINFH的必要治疗手段，但给患者和医疗保健系统带来了沉重的经济负担，同时常出现术后并发症[6]。因此，迫切需要开发更有效的SINFH治疗方法。
LIN等[7]认为糖皮质激素延长破骨细胞的存活时间，破坏骨稳态，引起骨密度降低和骨组织死亡。此外，LU等[8]研究显示内皮细胞凋亡和血管生成障碍，骨髓脂肪堆积和髓内压力变化，最终导致股骨头内细胞因缺血缺氧而死亡。在这些病理过程中，细胞死亡在SINFH的发展中起着关键作用。自噬是一种类似程序性细胞死亡的过程，自噬相关蛋白对破骨细胞的产生和分泌功能，以及体外和体内维持平衡具有关键作用[9]。激素诱发过度的自噬可能导致细胞死亡，加重股骨头坏死的程度[10]。
环状RNA(circular RNAs，circRNA)是一种内源性非编码RNA，通过特定的剪接方式形成稳定的共价闭合的连续环结构[11]。CircRNA在许多疾病中起着关键作用，这可能是由于它们摄取miRNAs并解除miRNAs对下游靶基因的抑制作用。目前，已有研究证实circRNA在SINFH中具有调控机制[12]。CHEN等[13]报道，在SINFH-骨髓间充质干细胞中敲除CDR1as显著提高骨细胞分化，同时降低细胞脂肪分化。然而，circCDR1as是否在SINFH中影响自噬尚未被研究。
此次研究旨在探讨circCDR1as在SINFH中对miR-7-5p和RAF1的表达以及自噬水平的调控，结果表明，circCDR1as/miR-7-5p/RAF1轴可能通过调节自噬对SINFH的影响。因此，circCDR1as可能可以作为治疗SINFH的新靶点。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计验证circCDR1as/miR-7-5p/RAF1在SINFH中的靶向调控关系。差异性比较采用t-test或者ANOVA分析。
1.2 时间及地点实验于2022年2月至2023年5月在新疆医科大学第五附属医院完成。
1.3 资料
1.3.1 动物实验数据收集及处理 GSE26316数据来源于
Affymetrix大鼠基因组230 2.0芯片，包含3只SINFH大鼠和3只健康对照大鼠的基因表达谱数据。芯片中大鼠的信息：成年健康雄性Wistar大鼠，体质量(200±10) g，随机分为对照组和SINFH组。所有大鼠腹腔注射大肠杆菌内毒素，剂量为20 μg/kg，分2次注射，间隔24 h；在第2次施用大肠杆菌内毒素后24 h，将甲基强的松龙40 mg/kg施用到SINFH组大鼠的左侧臀肌中，共施用3次，间隔24 h。然后在类固醇给药后6周麻醉后处死大鼠，立即分离左侧股骨头用于RNA提取和Affymetrix芯片测序。
使用稳健多阵列平均值(Robust Multi-array Average，RMA)算法对数据进行标准化[14]，利用PARTEK genomic suit 6.4分析数据。通过偏倚方法进行多重检验校正。利用R语言中的DESeq2包对基因表达谱进行差异表达分析。筛选标准设定为P < 0.05，鉴定SINFH和对照之间的差异表达基因。随后利用clusterProfiler包进行KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。
通过circBank(http://www.circbank.cn/；2023年2月访问)、starBase(https://starbase.sysu.edu.cn/；2023年1月访问)和miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do；2023年1月访问)数据库预测circCDR1as的靶标miRNAs，并进一步利用miRTarBase(https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/；2023年1月访问)、starBase和Targetscan(https://www.targetscan.org；2023年1月访问)数据库预测这些miRNAs的靶标基因。通过比较这些预测的靶标基因与差异表达基因，最终确定了差异表达的靶标基因，并构建circCDR1as的调控网络。
1.3.2 临床样本收集随机选取10例2022年2月至2023年2月于新疆医科大学第五附属医院接受全髋关节置换术的SINFH患者，年龄24-60岁(平均43.6岁)，男女各半。术中，在临床医生的指导下以及严格无菌条件下取出股骨头坏死组织，并将其储存在-80 ℃的冷冻条件下，以备后用。随机收集10例对照组的样本，来自于因骨折等原因需要手术，但影像学检查髋关节功能正常、没有骨质疏松或其他相关骨科疾病的患者，年龄32-52岁(平均40.4岁)，男女各半。术中以相同的方式收集他们的股骨头组织样本。所有参与者对治疗过程完全知情同意，都签署了知情同意书。研究方案已经得到新疆医科大学第五附属医院伦理委员会的批准。
纳入标准：①SINFH样本有明确的激素使用史，依临床病史、症状、影像学检查由2位医生确诊为SINFH患者；②对照人群样本，需在收集前2个月内无任何疾病史、无激素使用史，且相关体检指标正常。
排除标准：①患有严重心、肝、肾等器官疾病，骨质疏松等骨病，或有恶性肿瘤等重大疾病；②怀孕、哺乳、严重感染等。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养及转染人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。将BMSCs接种在含有体积分数10%胎牛血清和1%青链霉素抗体的DMEM中，于37 ℃、体积分数5% CO2的环境中培养。取对数生长阶段的细胞，在胰蛋白酶消化后接种在6孔板中(5×106/孔)。针对circCDR1as的反向剪接点的siRNA由GenePharma设计并合成(si-CDR1as)，同时设乱序siRNA用作阴性对照(si-NC)。根据试剂盒说明，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen，USA)将siRNA转染入BMSCs中。
1.4.2 建立甲泼尼龙诱导模型将BMSCs接种在6孔板中(1×105/孔)，加入50 μmol/L甲泼尼龙(Pfizer Manufacturing Belgium NV)，然后，将BMSCs分为4组：BMSCs组、甲泼尼龙处理BMSCs组(模型组)、模型+si-NC组、模型+si-CDR1as组。分别处理24，48，72 h后CCK-8法进行细胞活性检测。

1.4.3 RT-qPCR检测circCDR1as和自噬相关蛋白的基因表达采用TRIzol试剂(Invitrogen)提取股骨头组织及BMSCs总RNA，然后通过PrimeScript RT reagent Kit(Invitrogen)将RNA转化为cDNA。随后使用SYBR Green定量PCR试剂盒，将cDNA作为模板，与引物一起在Bio‐Rad CFX96定量PCR系统中进行反应。RT‐qPCR反应设定程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40次循环；72 ℃ 20 s；72 ℃ 10 min。U6用作miRNAs的内参对照，β-actin用于mRNAs和circCDR1as的内参对照，通过2-ΔΔCt法计算目标基因CircCDR1as，miR-7-5p，RAF1，LC3B和p62的mRNA的相对表达水平。引物序列由上海生工设计并合成，见表1。

1.4.4 Western blot检测自噬相关蛋白的蛋白表达使用RIPA缓冲液从股骨头组织和BMSCs中提取总蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度。取等量的蛋白质样本通过SDS-PAGE电泳分离，然后转移到PVDF膜。使用5%脱脂奶粉在TBST缓冲液中进行孵育封闭后，将膜在4 ℃与一抗(RAF1，LC3B和p62；武汉爱博泰克，1∶1 000)进行孵育12 h。在室温下，将膜在HRP标记的二抗(1∶5 000)中孵育2 h，使用增强化学发光蛋白质印迹检测试剂检测RAF1，LC3B和p62的蛋白表达。使用凝胶成像系统(BioRad)拍照并使用Image J(美国NIH)进行定量分析，β-actin用于内参对照。
1.4.5 双荧光素酶报告检测首先分别将包含miR-7-5p结合序列的RAF1和circCDR1as的野生型3’UTR序列和突变的3’UTR序列克隆到pmirGLO双荧光素酶表达载体(Promega)中，构建荧光素酶报告基因载体，称为pmirGLO-CDR1as (WT)、pmirGLO-RAF1 (WT)、pmirGLO-CDR1as (MUT)和pmirGLO-RAF1 (MUT)。然后，使用Lipofectamine 3000将构建好的荧光素酶报告基因载体转染到HEK-293T细胞中；同时，将miR-7-5p的模拟物(mimic)(GenePharma)或者其对照(NC)进行各自的共转染。48 h后，使用双荧光素酶测定试剂盒(Promega)测定荧光素酶活性。
1.5 主要观察指标 ①SINFH大鼠中的差异表达基因；②鉴定circCDR1as调控网络的结果；③调控网络和自噬水平的验证；④circCDR1as调控网络促进自噬的结果；⑤circCDR1as靶向调控miR-7-5p和RAF1的结果。
1.6 统计学分析实验数据来自3次独立实验的平均值，并以x±s的形式表示。差异性比较采用t-test或者ANOVA分析。所有的统计分析采用GraphPad Prism 9(美国GraphPad软件公司)进行，P < 0.05被认为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经新疆医科大学第五附属医院生物统计学专家审核。

讨论

此项研究从GSE26316数据集中鉴定了大鼠SINFH组和对照组之间存在的1 283个差异表达基因，这些基因主要参与了细胞凋亡和自噬信号通路。进一步在差异表达基因中鉴定circCDR1as的调控网络，探讨circCDR1as调控网络在SINFH中的潜在分子机制，并研究circCDR1as可能在SINFH的发病过程中对自噬的影响。
CircRNA具有许多重要的生物学功能。CircRNA作为miRNA的海绵，调节miRNA靶基因的功能。最近的研究表明circRNA可能在SINFH中起重要作用，其功能与成骨细胞和破骨细胞的活性、内皮细胞损伤、成骨分化减弱和BMSCs成脂分化增加密切相关[15-16]。因此，circRNA可能在SINFH中作为诊断和治疗生物标志物发挥作用。根据数据库预测以及差异分析结果，circCDR1as可能通过靶向调控miR-7-5p来影响RAF1的表达，从而参与细胞自噬信号通路。此次研究的实验结果进一步支持了关于SINFH患者中circCDR1as/miR-7-5p/RAF1调控关系的预测。
与此项研究结果一致，circCDR1as在SINFH患者股骨头组织内相对表达量显著高于对照组，其敲降后促进骨髓间充质内皮细胞增殖活性[17]。先前的研究表明，circCDR1as在肌肉骨骼系统和血管生成中起着重要作用[18-19]。JIANG等[20]发现非创伤性股骨头坏死患者的血浆circCDR1as表达显著升高，可以作为非创伤性股骨头坏死患者影像学进展的良好标志。此外，circCDR1as通过调控自噬影响口腔鳞状细胞存活[21-22]。然而，尚无研究探讨circCDR1as在SINFH中与自噬的关系。此次研究结果显示敲降circCDR1as能显著提高激素诱导的BMSCs的增殖，显著降低激素刺激BMSCs的自噬水平，这进一步支持了circCDR1as在SINFH中的重要作用。
与健康对照组相比，类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞中miR-7-5p的相对表达显著降低，可能参与PI3K/mTOR信号依赖的成纤维细胞增殖[23]。miR-7-5p可能与骨质疏松性骨折相关[24]。在白细胞介素1β刺激的软骨细胞中，miR-7-5p的过表达可以显著促进细胞活力、降低凋亡和细胞外基质降解的作用[25]。过表达miR-7-5p通过激活Wnt/β-Catenin通路促进骨折愈合[26]。膀胱癌中证实miR-7-5p靶向自噬相关基因抑制自噬[27]。circCDR1as靶向miR-7-5p调控轴介导缺氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞成骨细胞分化和钙化[28]。
另外，RAF1在SINFH与非SINFH之间差异表达[29]。在肝细胞癌中，RAF1的表达受到circCDR1as的调控，进而影响细胞增殖[30]。RAF1是已知参与细胞自噬信号通路的一种蛋白激酶[31]。此外，此次研究结果还观察到SINFH患者的自噬相关蛋白LC3B和p62表达的升高，这表明自噬过程在SINFH患者中可能被激活。敲降circCDR1as能显著抑制激素诱导的BMSCs的自噬水平。LC3的表达可以改善SINFH的疾病进程[32]。此次研究结果提示，在SINFH中circCDR1as可能通过负调控miR-7-5p，释放miR-7-5p对RAF1的抑制作用，上调RAF1的表达，从而促进自噬；双荧光素酶报告实验则证实了circCDR1as/miR-7-5p/RAF1之间的靶向调控关系。
此次研究存在一些局限性。首先样本数量有限，可能影响了结果的准确性和可推广性，未来的研究应增加样本数量，以增强结果的统计效力和外部效度。尽管在体外细胞模型中证明了circCDR1as/miR-7-5p/RAF1调控网络的存在，未来应通过临床试验来验证这一机制在人体中的作用。此外，miR-7-5p和RAF1是否受到其他调控因子的调控，以及如何影响细胞自噬的具体过程还不清楚，未来应探究这些关键因素在细胞自噬过程中的具体作用和机制。
结论：在此项研究中，详细地探讨了SINFH中的基因表达及circCDR1as的作用和其调控机制，证实circCDR1as在SINFH患者中上调表达，并可以靶向调控miR-7-5p，而miR-7-5p可以进一步靶向调控RAF1参与自噬通路。结果提示，circCDR1as可能在SINFH的发病机制中起重要作用，并通过miR-7-5p/RAF1轴影响细胞自噬信号通路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

circCDR1as/miR-7-5p/RAF1轴参与调控激素性股骨头坏死中的自噬

CircCDR1as/miR-7-5p/RAF1 axis promotes autophagy levels in steroid-induced necrosis of the femoral head

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[1]	杨毅峰, 叶楠, 王琳, 郭帅成, 黄健. 右美托咪定抗缺血再灌注损伤的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1464-1469.
[2]	魏娟, 李婷, 郇梦婷, 谢颖, 谢舟煜, 韦庆波, 吴云川. 静力性训练改善2型糖尿病骨骼肌胰岛素抵抗的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1271-1276.
[3]	盛思琪, 谢琳, 赵翔宇, 姜怡邓, 吴凯, 熊建团, 杨安宁, 郝银菊, 焦运. miR-144-3p参与高蛋氨酸饮食诱导Cbs+/-小鼠的肝细胞自噬[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1289-1294.
[4]	岳云, 王佩佩, 袁兆鹤, 何生存, 贾戌生, 刘倩, 李占涛, 付慧玲, 宋斐, 贾孟辉. 巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1186-1192.
[5]	王继, 张敏, 李文博, 杨中亚, 张龙. 有氧运动对2型糖尿病大鼠糖脂代谢、骨骼肌炎症和自噬的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1200-1205.
[6]	刘鑫, 胡满, 赵文杰, 张钰, 孟博, 杨盛, 彭晴, 张亮, 王静成. 镉暴露激活PI3K/Akt信号通路诱导椎间盘纤维环细胞衰老[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1217-1222.
[7]	周邦瑜, 李杰, 阮玉山, 耿福能, 李绍波. 美洲大蠊研粉干预脊髓半横断大鼠运动功能和自噬蛋白Beclin-1的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1223-1228.
[8]	潘小龙, 樊飞燕, 应春苗, 刘飞祥, 张运克. 中药抑制间充质干细胞衰老的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1091-1098.
[9]	黄雨馨, 梁文姿, 陈秀文, 倪娜, 赵颖琳, 林常敏. 自噬在毛发再生中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1112-1117.
[10]	刘麒薇, 张俊辉, 杨袁, 王金娟. 脐带间充质干细胞治疗多囊卵巢综合征的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1015-1020.
[11]	张克凡, 石辉. 细胞因子治疗骨关节炎的研究现状及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 961-967.
[12]	胡智星, 李群, 杨超, 王潇潇, 方罗昌婷, 侯吴琼, 林娜, 陈卫衡, 刘春芳, 林雅. 不同因素影响激素性股骨头坏死家兔模型成模效果的网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 976-984.
[13]	薛晶文, 王芳芳, 张欣, 逄瑞丰, 王肖烨, 马小茹. 灵芝孢子干预糖尿病大鼠睾丸组织线粒体自噬及细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 562-568.
[14]	韦沅汛, 陈锋, 林宗汉, 张驰, 潘成镇, 韦宗波. Notch信号通路与骨质疏松症及中医药防治[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 587-593.
[15]	刘潞兴, 狄鸣远, 杨强. 中药有效成分治疗骨关节炎机制中的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 609-614.