METTL3在同型半胱氨酸诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用

doi:10.12307/2024.423

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (26): 4221-4225.doi: 10.12307/2024.423

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

METTL3在同型半胱氨酸诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用

马凌桔1，2，汪乐新2，迟宏扬2，3，张竞文2，彭红建2，4，高春兰2，5，姜怡邓2，黄晖1，杨力1，马胜超2，3

1宁夏医科大学总医院老年与特需医学科，宁夏回族自治区银川市 750004；2国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；3宁夏医科大学检验学院，宁夏回族自治区银川市 750004；4中南大学化学化工学院，湖南省长沙市 410083；5银川市第一人民医院，宁夏回族自治区银川市 750001

收稿日期:2023-06-06 接受日期:2023-07-24 出版日期:2024-09-18 发布日期:2023-10-07
通讯作者: 马胜超，博士，副教授，国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室，宁夏回族自治区银川市 750004；宁夏医科大学检验学院，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:马凌桔，男，1994年生，宁夏回族自治区平罗县人，回族，2022年宁夏医科大学毕业，硕士，医师，主要从事老年慢性代谢性疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年项目(81900273)，项目负责人：马胜超；国家自然科学基金地区项目(82060139，82270492)，项目负责人：马胜超；宁夏自治区自然科学基金优秀青年项目(2023AAC05035)，项目负责人：马胜超；宁夏回族自治区重点研发计划项目(2019BEG03006)，项目负责人：张竞文；宁夏医科大学校级重点项目(XZ2022004)，项目负责人：彭红建

Role of METTL3 in homocysteine-induced autophagy in mouse islet beta cells

Ma Lingju1, 2, Wang Lexin2, Chi Hongyang2, 3, Zhang Jingwen2, Peng Hongjian2, 4, Gao Chunlan2, 5, Jiang Yideng2, Huang Hui1, Yang Li1, Ma Shengchao2, 3

1Department of Geriatrics and Special Need Medicine, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Disease Research of National Health Commission, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 3School of Inspection, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 4College of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, Hunan Province, China; 5The First People’s Hospital of Yinchuan, Yinchuan 750001, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2023-06-06 Accepted:2023-07-24 Online:2024-09-18 Published:2023-10-07
Contact: Ma Shengchao, MD, Associate professor, Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Disease Research of National Health Commission, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; School of Inspection, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Ma Lingju, Master, Physician, Department of Geriatrics and Special Need Medicine, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Disease Research of National Health Commission, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (Youth Project), No. 81900273 (to MSC); National Natural Science Foundation of China (Regional Project), Nos. 82060139 and 82270492 (to MSC); Outstanding Youth Project of Natural Science Foundation of Ningxia Autonomous Region, No. 2023AAC05035 (to MSC); the Key Research and Development Program of Ningxia Hui Autonomous Region, No. 2019BEG03006 (to ZJW); The School-level Key Project of Ningxia Medical University, No. XZ2022004 (to PHJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

自噬：是指以胞质空泡化为特征依赖于溶酶体的一种降解途径，在维持细胞内稳态中发挥重要作用，自噬标志物微管相关蛋白Ⅰ轻链 3 (LC3)、Beclin-1蛋白及p62蛋白反映了自噬流的水平。
N6甲基腺苷甲基转移酶(METTL3) ：是m6A甲基转移酶复合体亚复合物MT-ADE含甲基供体S-腺苷甲硫氨酸的结合位点，分子质量70 kD，在转录后水平发挥重要调控作用，包括前体mRNA的剪接、成熟mRNA的输出、mRNA的稳定性调节等。

背景：高同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)血症与胰岛β细胞功能密切相关，但其具体分子机制尚不完全明确。

目的：探讨METTL3在Hcy诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用。
方法：取第3，4代小鼠胰岛β细胞进行实验。①细胞模型建立和分组：对照组细胞不加入Hcy，Hcy组细胞加入浓度为100 µmol/L Hcy干预48 h；②按LipofectamineTM 2000说明书将过表达质粒Ad-METTL3及si-METTL3转染小鼠胰岛β细胞，设计3种不同干扰片段，PCR验证、筛选出干扰效率最好的干扰片段；③转染后实验分组：对照组、Hcy组、Ad-NC(阴性对照)+Hcy组、Ad-METTL3+Hcy组、si-NC(阴性对照)+Hcy组和si-METTL3+Hcy组；④采用qRT-PCR及Western blot检测细胞中METTL3及细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62的表达；ELISA法测定胰岛素水平来评价胰岛β细胞胰岛素分泌能力；分别过表达和干扰METTL3后检测细胞自噬相关蛋白及胰岛素水平。

结果与结论：①与对照组相比，Hcy组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平升高(P < 0.05)，而p62表达明显降低( P < 0.05)，胰岛素分泌能力明显下降(P < 0.05)；②与对照组相比，Hcy组中METTL3蛋白及mRNA水平表达均降低(P < 0.05)；③胰岛β细胞中沉默METTL3后，Hcy进一步上调了细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ的表达(P < 0.05)，而p62表达显著下降(P < 0.05)，细胞中胰岛素水平增加(P < 0.05)；过表达METTL3后，Hcy则使LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著降低且p62 表达则增高( P < 0.05)；④结论：METTL3参与了Hcy诱导的胰岛β细胞自噬调控，对胰岛素的分泌发挥着调控作用。

https://orcid.org/0009-0003-5188-3181(马凌桔)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: N6-甲基腺苷甲基转移酶3, 胰岛β细胞, 同型半胱氨酸, 细胞自噬, LC3Ⅱ/Ⅰ

Abstract: BACKGROUND: Hyperhomocysteinemia is closely related to the function of islet β cells, but its specific molecular mechanism is not fully understood.
OBJECTIVE: To investigate the role of N6 methyltransferase-like 3 (METTL3) in homocysteine (Hcy)-induced autophagy of mouse islet β cells.
METHODS: The 3rd and 4th generation mouse islet β cells were taken for the experiment. (1) Cell modeling and grouping: cells in control group were not treated with Hcy, while those in homocysteine group were treated with 100 µmol/L Hcy for 48 hours. (2) The mouse islet β-cells were transfected with the plasmids overexpressing Ad-METTL3 and si-METTL3 according to the instructions of LipofectamineTM 2000. Three different interfering fragments were designed, and the one with the best interfering efficiency was verified and screened by PCR. (3) After transfection, the cells were divided into control group, Hcy group, Ad-NC (negative control)+Hcy group, Ad-METTL3+Hcy group, si-NC (negative control)+Hcy group and si-METTL3+Hcy group. (4) qRT-PCR and western blot were used to detect the expression levels of METTL3 and autophagy-related proteins LC3II/I and p62 in cells. Insulin level was determined by ELISA to evaluate insulin secretion capacity of islet cells. Autophagy-related proteins and insulin level were detected after overexpression and interference with METTL3.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the expression level of LC3II/I was increased (P < 0.05), the expression of p62 was significantly reduced (P < 0.05), and the insulin secretion capacity was significantly decreased (P < 0.05) in the Hcy group. Compared with the control group, the protein and mRNA levels of METTL3 were reduced in the Hcy group (P < 0.05). After METTL3 silencing in islet β cells, Hcy further upregulated the expression of LC3II/I (P < 0.05), significantly dowregulated the expression of p62 (P < 0.05), and increased the insulin level (P < 0.05). After overexpression of METTL3, Hcy significantly decreased the LC3II/I expression and increased the p62 expression in islet β cells (P < 0.05). To conclude, METTL3 is involved in the Hcy-induced autophagy regulation of islet β cells and plays a role in the regulation of insulin secretion.

Key words: methyltransferase-like 3, islet β cell, homocysteine, autophagy, LC3II/I

中图分类号:

马凌桔, 汪乐新, 迟宏扬, 张竞文, 彭红建, 高春兰, 姜怡邓, 黄晖, 杨力, 马胜超. METTL3在同型半胱氨酸诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4221-4225.

Ma Lingju, Wang Lexin, Chi Hongyang, Zhang Jingwen, Peng Hongjian, Gao Chunlan, Jiang Yideng, Huang Hui, Yang Li, Ma Shengchao. Role of METTL3 in homocysteine-induced autophagy in mouse islet beta cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(26): 4221-4225.

图/表（结果） 5

2.1 Hcy对胰岛β细胞自噬水平的影响用Western blot 检测小鼠胰岛β细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ与p62的表达水平，结果显示，与对照组相比，Hcy组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表达升高(P < 0.05)，而 p62表达明显降低(P < 0.05)，见图 1。

2.2 Hcy对METTL3蛋白及mRNA的影响用Western blot检测小鼠胰岛β细胞METTL3蛋白表达水平，结果显示，与对照组相比，Hcy组METTL3表达水平降低(P < 0.05)；用qRT-PCR检测小鼠胰岛β细胞METTL3的mRNA表达水平，结果显示，与对照组相比，Hcy组中的mRNA表达降低(P < 0.05)，见图 2。

2.3 Hcy对的胰岛β细胞分泌胰岛素的影响为了了解Hcy对小鼠胰岛β细胞胰岛素分泌能力，采用ELISA法测定胰岛素含量。与空白对照组比较，Hcy组小鼠胰岛β细胞分泌胰岛素水平降低(P < 0.05)。与si-NC+Hcy组比较，si-METTL3组小鼠胰岛β细胞分泌胰岛素水平升高(P < 0.05)，见图3。

2.4 过表达和沉默METTL3在胰岛β细胞中对自身表达的影响为了明确METTL3在Hcy诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用，在小鼠胰岛β细胞分别转染ad-METTL3及si-METTL3后采用qRT-PCR检测METTL3的mRNA表达。结果显示：转染ad-METTL3后，与ad-NC+Hcy组相比METTL3的mRNA表达上调(P < 0.05)；转染si-METTL3 后，与si-NC+Hcy组相比METTL3的mRNA表达下调(P < 0.05)，且si-METTL3-2干扰效果最佳。表明METTL3干扰和过表达片段转染成功，并能在小鼠胰岛β细胞中稳定的表达，见图4。

2.5 过表达和沉默METTL3对Hcy诱导胰岛β细胞自噬的影响为了进一步探讨METTL3对Hcy诱导小鼠胰岛β细胞自噬的作用，小鼠胰岛β细胞转染ad-METTL3及si-METTL3后，同时给予100 μmol/L Hcy干预24 h，采用Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和p62的表达。结果显示，转染ad-METTL3后与ad-NC+Hcy组相比，LC3Ⅱ/Ⅰ表达降低且p62 表达明显增高( P < 0.05)；转染 si-METTL3后与si-NC+Hcy组相比，LC3Ⅱ/Ⅰ表达增高( P < 0.05)，p62表达降低( P < 0.05)，见图5。

参考文献

[1] GUIEU R, RUF J, MOTTOLA G. Hyperhomocysteinemia and cardiovascular diseases. Ann Biol Clin (Paris). 2022;80(1):7-14.
[2] CHENG Y, WANG C, ZHANG X, et al. Circulating homocysteine and folate concentrations and risk of type 2 diabetes: A retrospective observational study in Chinese adults and a Mendelian randomization analysis. Front Cardiovasc Med. 2022;9:978-998.
[3] 陈辛玲,王生兰.细胞自噬过程、通路、调控及其与肺动脉高压的多重相关性[J].中国组织工程研究,2021,25(2):311-316.
[4] 丁宇,王彦丰,李小溪,等.细胞自噬与常见老年病的关联性研究进展[J].国际老年医学杂志,2022,43(4):468-471.
[5] 高源,揭育祯,马天龙,等.miR-488-3p靶向调控RAP1A在同型半胱氨酸介导肝细胞自噬的作用研究[J].中国比较医学杂志,2022,32(9):1-9.
[6] 赵钎汐,杨淑德,郭澍.METTL3对细胞分化调控的研究进展[J].中国美容整形外科杂志,2022,33(8):508-509,514-515.
[7] LI X, JIANG Y, SUN X, et al. METTL3 is required for maintaining β-cell function. Metabolism. 2021;116:154702.
[8] 张晴,高春兰,于飞飞,等.同型半胱氨酸致胰岛β细胞凋亡中肝配蛋白A型受体2 DNA甲基化升高[J].中国组织工程研究,2023,27(5):714-719.
[9] SUN H, SAEEDI P, KARURANGA S, et al. IDF Diabetes Atlas: Global, regional and country-level diabetes prevalence estimates for 2021 and projections for 2045. Diabetes Res Clin Pract. 2022;183:109119.
[10] KOTWAS A, KARAKIEWICZ B, ZABIELSKA P, et al. Epidemiological factors for type 2 diabetes mellitus: evidence from the Global Burden of Disease. Arch Public Health. 2021;79(1):110.
[11] 吕承安,王若然,孟卓贤.2型糖尿病进程中胰岛β细胞功能变化的分子机制[J].遗传,2022,44(10):840-852.
[12] CASSIDY FC, SHORTISS C, MURPHY CG, et al. Impact of type 2 diabetes mellitus on human bone marrow stromal cell number and phenotypic characteristics. Int J Mol Sci. 2020;21:2476.
[13] 陈艳,王萍.同型半胱氨酸和总胆红素对胰岛β细胞功能的交互作用分析[J].中国糖尿病杂志,2023,31(1):47-52.
[14] 揭育祯,杨慧霞,周瑜瑾,等.TRPC6 DNA甲基化在同型半胱氨酸致胰岛β细胞焦亡中的作用研究[J].广东医学,2022,43(2):162-168.
[15] MIZUSHIMA N, LEVINE B. Autophagy in Human Diseases. N Engl J Med. 2020;383(16): 1564-1576.
[16] GE X, WANG L, FEI A, et al. Research progress on the relationship between autophagy and chronic complications of diabetes. Front Physiol. 2022;13:956344.
[17] KIM J, PARK K, KIM MJ, et al. An autophagy enhancer ameliorates diabetes of human IAPP-transgenic mice through clearance of amyloidogenic oligomer. Nat Commun. 2021;12(1):183.
[18] 任海文,王林华,龚权,等.胰岛β细胞自噬及其影响因素[J].中国糖尿病杂志, 2022,30(10):796-800.
[19] ZHANG Y, ZHOU XA, LIU C, et al. Vitamin B6 Inhibits High Glucose-Induced IsletβCell Apoptosis by Upregulating Autophagy. Metabolites. 2022;12(11):1048.
[20] CAI XS, SHE MQ, XU MY, et al. GLP - 1 treatment protects endothelial cells from oxidative stress -induced autophagy and endothelial dysfunction. Int J Biol Sci. 2018;14: 1696-1708.
[21] LAMBELET M, TERRA LF, FUKAYA M, et al. Dysfunctional autophagy following exposure to pro - inflammatory cytokines contributes to pancreatic β-cell apoptosis. Cell Death Dis. 2018;9(2):96.
[22] MARIÑO G, NISO SM, BAEHRECKE EH, et al. Self-consumption: the interplay of autophagy and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15(2):81-94.
[23] SU X, QU Y, MU D. The Regulatory Network of METTL3 in the Nervous System: Diagnostic Biomarkers and Therapeutic Targets. Biomolecules. 2023;13(4):664.
[24] WANG JN, WANG F, KE J, et al. Inhibition of METTL3 attenuates renal injury and inflammation by alleviating TAB3 m6A modifications via IGF2BP2-dependent mechanisms. Sci Transl Med. 2022;14(640):eabk2709.
[25] LI X, YUAN B, LU M, et al. The methyltransferase METTL3 negatively regulates nonalcoholic steatohepatitis (NASH) progression. Nat Commun. 2021;12(1):7213.
[26] CHEN H, PAN Y, ZHOU Q, et al. METTL3 Inhibits Antitumor Immunity by Targeting m 6 A-BHLHE41-CXCL1/CXCR2 Axis to Promote Colorectal Cancer. Gastroenterology. 2022;163(4):891-907.
[27] PENG Z, GONG Y, WANG X, et al. METTL3-m 6 A-Rubicon axis inhibits autophagy in nonalcoholic fatty liver disease. Mol Ther. 2022;30(2):932-946.
[28] 伍义文,曹健斌,黄维佳,等.m6A甲基转移酶METTL3介导miR-127调控非小细胞肺癌细胞系自噬的机制研究[J].现代检验医学杂志,2022,37(2):12-16+32.
[29] ZHOU S,SUN Y,XING Y, et al. Exenatide ameliorates hydrogen peroxide-induced pancreaticβ-cell apoptosis through regulation of METTL3-mediated m 6 A methylation. Eur J Pharmacol. 2022;924:174960.
[30] WANG Y, SUN J, LIN Z, et al. m6A mRNA Methylaon Controls Funconal Maturaon in Neonatal Murine β-Cells. Diabetes. 2020;69(8):1708-1722.
[31] CHENG Y, YAO XM, ZHOU SM, et al. The m 6 A Methyltransferase METTL3 Ameliorates Methylglyoxal-Induced Impairment of Insulin Secretion in PancreaticβCells by Regulating MafA Expression. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:910868.
[32] FANG J, CHEN Z, LAI X, et al. Mesenchymal stem cells-derived HIF-1α-overexpressed extracellular vesicles ameliorate hypoxia-induced pancreaticβcell apoptosis and senescence through activating YTHDF1-mediated protective autophagy. Bioorg Chem. 2022;129:106194.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。
1.2 时间及地点实验于2022年8月至2023年6月在国家卫生健康委代谢性心血管疾病研究重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞小鼠胰岛β细胞株(Min6，上海晶抗生物工程有限公司)。
1.3.2 主要试剂及仪器 DMEM培养基、胎牛血清(美国 Gibco公司)；Hcy粉末(Sigma公司)；青霉素-链霉素双抗、胰蛋白酶(北京碧云天生物技术公司)；蛋白提取试剂盒(中国上海凯基生物技术有限公司)；胰岛素浓度ELISA 测定试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司)；兔抗LC3单克隆抗体(货号 ab192890)、兔抗p62 单克隆抗体(货号ab109012)(美国Abcam公司)；HRP标记的山羊抗兔二抗(货号ZB-2306，北京中杉金桥生物技术有限公司)；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光PCR试剂盒(中国北京天根公司)；METTL3上下游引物(中国上海生物生工程公司)；METTL3干扰、过表达质粒(Ad-METTL3、si-METTL3)及阴性对照(Ad-NC、si-NC)(上海吉玛制药技术有限公司)；蛋白上样缓冲液(上海碧云天有限公司)；化学发光显色剂(中国新赛美公司)；荧光定量PCR仪(德国 Analytik Jena AG公司)；Bio-Rad 凝胶成像系统显影(货号 MG8600，Thmorgan 公司)； CO2 培养箱和5415D 型微量台式离心机(美国Eppendorf 公司)；超净工作台(中国苏州安泰有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞模型建立与分组用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养小鼠胰岛β细胞，每 2 d 换液，取对数增长期第3，4代细胞用于实验。对照组细胞不加入Hcy，Hcy组细胞加入浓度为100 µmol/L Hcy干预，48 h 后，将细胞收集于离心管中进行后续Western blot和qRT-PCR检测实验[8]。
1.4.2 细胞转染与分组根据LipofectamineTM 2000说明书将过表达质粒Ad-METTL3及si-METTL3 转染小鼠胰岛β细胞。转染前在250 μL的DMEM培养基中接种2×105个细胞，待细胞生长密度达到70%时，开始进行转染。配制转染液，A液：250 μL DMEM 纯培养基与5 μL的Ad-METTL3或si-METTL3混合，吹打两三次混匀；B液：250 μL DMEM纯培养基与6 μL的LipofectamineTM 2000混合，吹打两三次混匀，静置5 min。将A液加B液混匀吹打两三次，于室温下静置20 min，加入350 μL纯培养基混匀。将培养瓶置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，8 h后更换培养液，Hcy干预48 h后收细胞，以便进行后续其他实验。
实验分组：转染Ad-METTL3及si-METTL3后，PCR分组：①对照组(不做处理)、Ad-NC+Hcy组、Ad-METTL3组；②对照组(不做处理)、si-NC+Hcy组和si-METTL3-1组、si-METTL3-2组、si-METTL3-3组，设计3种不同干扰片段，PCR验证、筛选出干扰效率最好的干扰片段。Western blot 分组：①对照组(不做处理)、Hcy组、Ad-NC+Hcy组、Ad-METTL3+Hcy组；②对照组(不做处理)、Hcy组、si-NC+Hcy组和si-METTL3+Hcy组。
1.4.3 Western blot检测细胞自噬相关蛋白 LC3Ⅱ/Ⅰ、p62及METTL3蛋白表达收集各组细胞，用5 000 r/min离心5 min，弃上清，根据凯基蛋白提取试剂盒说明书提取总蛋白，用BCA法测定浓度定量，加50 μL蛋白上样缓冲液，金属浴99 ℃煮沸5 min变性，经SDS-PAGE凝胶电泳90 V 20 min，120 V 30 min湿转2 h转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，用稀释比1∶1 000的兔抗P62、兔抗LC3、兔抗METTL3，抗体4 ℃孵育过夜，PBST液洗膜3次，每次10 min，用稀释比1∶1 000的兔二抗孵育2 h，PBST液洗膜3次，每次10 min，通过Image Lab 图像分析进行扫描采取图像，以β-actin为内参，计算P62、LC3Ⅱ/Ⅰ和METTL3与β-actin内参灰度值的比值做定量分析。
1.4.4 qRT-PCR方法检测METTL3 的mRNA表达水平收集各组细胞，按照试剂盒相关步骤进行总RNA的提取，反转录成 cDNA后进行qRT-PCR的检测。采用GenBank数据库查询METTL3基因序列并设计引物。METTL3：上游：5’-CTG GGC ACT TGG ATT TAA GGA A-3’；下游：5’-TGA GAG GTG GTG TAG CAA CTT-3’。荧光定量 PCR扩增程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40个循环，并以内参GADPH为对照进行平衡，同体系扩增目的基因的相对量。反应结束后，根据扩增曲线数据，根据公式 2-ΔΔCt 计算，ΔΔCt =[Ct 目的基因(待测样本)-Ct GAPDH(待测样本)]-[Ct 目的基因(校正样本)-Ct GAPDH(校正样本)]。
1.4.5 酶联免疫吸附测定胰岛素分泌水平空白对照组，Hcy组，si-NC+Hcy组，si-METTL3组细胞培养24 h后，分别以2.8 mmol/L和30 mmol/L葡萄糖刺激1 h，吸取上清溶液，按照胰岛素ELISA试剂盒说明书进行。根据标准曲线计算胰岛素水平。
1.5 主要观察指标 ①Hcy对胰岛β细胞自噬的影响；②Hcy对METTL3蛋白和mRNA的影响；③Hcy对的胰岛β细胞分泌胰岛素的影响；④过表达和沉默METTL3在胰岛β细胞中对自身表达的影响；⑤过表达和沉默METTL3对Hcy诱导胰岛β细胞自噬的影响。
1.6 统计学分析上述实验结果均为计量资料，采用Graphpad Prism 9. 3 统计软件对实验数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料采用x±s表示，两样本均数间结果的比较采用独立样本t检验，多样本比较采用单因素方差分析，P < 0.05 为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经由宁夏医科大学统计学专家审核。

讨论

随着社会经济的发展和人类生活方式的改变，糖尿病逐渐成为严重威胁人类身体健康的慢性代谢性疾病之一[9]。随着病程的发展，糖尿病并发症累及心脏、肾脏、眼及神经等多个器官，使糖尿病患者致残率与死亡率也在逐年上升，给全球带来了极大的疾病负担[10]。胰岛β细胞通过分泌胰岛素来调节机体血糖水平，而机体的代谢应激反应是胰岛β细胞功能调节的关键机制，近年来研究发现胰岛β细胞的功能状态在2型糖尿病的发生发展过程中至关重要[11]。因此研究胰岛β细胞衰竭的分子机制，采取手段保护胰岛β细胞的功能将会是治疗糖尿病的重要治疗靶点[12]。
Hcy作为一种巯基氨基酸，是机体氨基酸的代谢产物，主要参与甲硫氨酸或半胱氨酸的转化。研究发现高Hcy水平与糖尿病患者胰岛β细胞功能受损相关[13]，此次实验室前期研究也发现，高Hcy可以促进胰岛β细胞凋亡和焦亡[8，14]，因此Hcy与胰岛β细胞功能密切相关。自噬是细胞出现的一种复杂的自降解过程，其参与神经退行性疾病、癌症、炎症性疾病和自身免疫性等疾病的发生发展[15]。同样自噬与糖尿病的发生发展密切相关，已有研究发现使用自噬抑制剂或敲除自噬相关基因来调节糖尿病自噬[16]，如KIM等[17]报道细胞自噬通过清除淀粉样蛋白生成的人IAPP (hIAPP) 寡聚体抑制寡聚体介导的胰岛β细胞凋亡，以此开发自噬增强剂如MSL-7，可能具有治疗以胰岛淀粉样蛋白积聚为特征的人类糖尿病的潜力。既往研究发现影响胰岛β细胞自噬的因素多是：氧化应激、炎症、未折叠蛋白质反应等[18]，但在高Hcy诱导下的胰岛β细胞自噬情况研究尚少。此次研究结果显示：与对照组相比，Hcy组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平升高，p62 表达降低，并且Hcy组中胰岛素分泌水平明显低于对照组。进一步分析其作用机制认为，自噬在正常生理状态下，可以帮助机体清除多余、老化的细胞，降低炎症因子水平，来维持胰岛β细胞稳态并促进胰岛素合成[19]，但高Hcy水平可能通过促进氧化应激[20]、促进炎症因子释放等导致细胞过度自噬可引起自噬性细胞死亡[21-22]，导致胰岛分泌功能障碍。然而Hcy诱导胰岛β细胞发生自噬的机制目前尚不明确。
METTL3作为m6A甲基转移酶复合物组成之一，是m6A修饰过程中重要的酶复合体，被证实在多种疾病中发挥重要作用[23]，如WANG等[24]提出，METTL3在人类和小鼠的急性肾损伤中被诱导表达，抑制METTL3通过IGF2BP2依赖机制减轻TAB3 m6A修饰可减轻肾损伤和炎症；而LI等[25]发现METTL3是非酒精性脂肪性肝炎发病机制的关键负调节因子，METTL3过表达通过组蛋白修饰途径抑制调节肝Cd36和Ccl2基因转录以防止非酒精性脂肪性肝炎进展。另外，METTL3调节因子在肿瘤发生发展过程中也具有重要功能。如CHEN等[26]发现METTL3通过靶向m6 ABHLHE41-CXCL1/CXCR2轴抑制抗肿瘤免疫促进结直肠癌的发展。同时相关研究也发现METTL3在细胞自噬调节过程中同样发挥着重要作用，如PENG等[27]发现METTL3过表达与Rubicon mRNA结合并介导m6A修饰，抑制自噬体-溶酶体融合，抑制肝细胞自噬；伍义文等[28]研究发现沉默METTL3基因可以抑制miR-127表达，促进非小细胞肺癌H460细胞发生自噬。可见METTL3在不同细胞对细胞自噬的调节作用是不同的。另外METTL3可以通过调节血糖稳态、胰岛素敏感性以及胰岛β细胞存活和功能，从而抑制葡萄糖不耐受和2型糖尿病的发展，ZHOU等[29]研究发现，艾塞那肽通过上调 METTL3表达促进m6A甲基化，从而在胰腺β细胞中产生抗凋亡作用。因此猜测METTL3可能作为一种关键调节因子调控胰岛β细胞自噬水平。
此次实验结果显示：与对照组相比，METTL3在Hcy组中表达降低；抑制METTL3后，胰岛β细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达增高，p62表达明显降低，胰岛素分泌水平上升；过表达METTL3后，LC3Ⅱ/Ⅰ表达降低且p62表达增高。分析其作用机制认为，Hcy促进的胰岛β细胞自噬过程中，Hcy下调了METTL3基因表达，促进胰岛β细胞自噬，这可能是因为METTL3依赖m6A甲基化修饰调节mRNA稳定性参与胰岛β细胞转录因子的表达，调节胰岛β细胞功能[30]。Hcy促进了胰岛β细胞自噬，作者之前分析认为：细胞过度自噬引起自噬性细胞死亡，损害胰岛β细胞分泌能力，导致胰岛素分泌水平下降；但此次实验的结果却截然相反，因此作者查阅了一些同类文献，发现胰岛β细胞特异性缺失METTL3，会导致胰岛素分泌受损[31]。因此考虑可能是，Hcy干预后，胰岛β细胞通过保护性自噬维持了一定的细胞分泌能力[32]，当然也不排除因为实验环境、人为因素等造成的实验误差所致，但总的来说METTL3参与了胰岛β细胞的分泌调控过程，具体机制还需要进一步研究说明。
综上所述，此次研究发现，METTL3在Hcy诱导下胰岛β细胞中低表达，且METTL3负向调控Hcy诱导的胰岛β细胞自噬水平，对胰岛β细胞分泌胰岛素具有调控作用，可能为临床治疗糖尿病提供一种潜在的新方法。此研究仅局限于体外实验，体内实验情况需进一步证实，另外只探讨了METTL3对胰岛β细胞自噬的影响，还需进一步深入研究METTL3是如何调控胰岛β细胞的自噬水平，其具体调控机制及METTL3是否还通过其他机制来影响胰岛β细胞的功能，还需进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

METTL3在同型半胱氨酸诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用

Role of METTL3 in homocysteine-induced autophagy in mouse islet beta cells

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[1]	盛思琪, 谢琳, 赵翔宇, 姜怡邓, 吴凯, 熊建团, 杨安宁, 郝银菊, 焦运. miR-144-3p参与高蛋氨酸饮食诱导Cbs+/-小鼠的肝细胞自噬[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1289-1294.
[2]	裴建升, 杨文娟, 何静, 燕茹, 黄晖, 贾绍斌. 骨形态发生蛋白2介导同型半胱氨酸促进血管钙化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 4027-4033.
[3]	况园军, 于素美, 钟颖怡, 章旭红, 马胜超, 杨安宁, 郝银菊, 熊建团, 焦运, 姜怡邓. 环状RNA hsa-circ-0001360在同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 4060-4064.
[4]	莫坚, 叶森涛, 章晓云. 中药单体及复方在膝骨关节炎中的治疗进展[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(11): 1756-1761.
[5]	马岁录, 何志军, 刘涛, 李岩, 何元旭, 何波, 王威威, 魏晓涛. 中药单体调控“细胞自噬”防治皮瓣坏死[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 153-158.
[6]	聂晨晨, 苏凯奇, 高静, 凡勇福, 阮晓迪, 袁洁, 段昭远, 冯晓东. 环状RNA调控脑缺血发病的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1286-1291.
[7]	张晴, 高春兰, 于飞飞, 张正皓, 马芳, 高源, 李桂忠, 姜怡邓, 马胜超. 同型半胱氨酸致胰岛β细胞凋亡中肝配蛋白A型受体2 DNA甲基化升高[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 714-719.
[8]	陶柏楠, 王咏兰, 江露, 张宗星, 刘道忠, 万星, 黄德斌, 袁林. 柔肝降酶方含药血清抑制人肝星状细胞的活化及自噬[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5334-5341.
[9]	陈财, 曾平, 刘金富. 介导软骨细胞相关机制调控骨性关节炎的长链非编码RNA[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4729-4735.
[10]	陈佳丽, 高航, 赵子莹, 王光义. 中药热敷颈椎病模型兔椎间盘自噬及凋亡相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4181-4186.
[11]	刘吉焕, 王鹏, 袁顺灵, 简晔, 黄少泽, 姚思思, 刘文锋. 有氧耐力运动调控大鼠心肌细胞自噬的机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(23): 3714-3720.
[12]	李媛媛, 孙岳, 宝瑞, 畅思容, 王梦, 余梦雪, 杨安宁, 刘志宏. 铁死亡参与高蛋氨酸饮食诱导ApoE-/-小鼠肝损伤的发病过程[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(17): 2681-2686.
[13]	王雅欣, 林一璨, 郭伊诺, 张博, 马玉滢, 贺小平. 中医药调控细胞自噬治疗脊髓损伤的方法、技术及未来[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(13): 2116-2123.
[14]	赵千增, 赵振群, 刘万林. 激素性股骨头缺血坏死过程中内质网应激调控自噬与凋亡的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(29): 4685-4690.
[15]	刘昆, 谢琳, 曹军, 丁宁, 徐灵博, 马胜超, 李桂忠, 姜怡邓, 卢冠军. 同型半胱氨酸致足细胞凋亡中FoxO1 DNA甲基化水平增高[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 269-273.