中药热敷颈椎病模型兔椎间盘自噬及凋亡相关因子的表达

doi:10.12307/2023.445

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (26): 4181-4186.doi: 10.12307/2023.445

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

中药热敷颈椎病模型兔椎间盘自噬及凋亡相关因子的表达

陈佳丽1，高航1，赵子莹1，王光义2

1贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；2贵州医科大学附属医院，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2022-05-16 接受日期:2022-07-09 出版日期:2023-09-18 发布日期:2023-01-28
通讯作者: 王光义，硕士，教授，主任医师，贵州医科大学附属医院，贵州省贵阳市 550004
作者简介:陈佳丽，女，1996年生，湖南省浏阳市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事针灸治疗颈椎病、风湿性疾病的研究。
基金资助:
贵阳市科技计划项目[筑科合同(2019)9-1-4]，项目负责人：王光义

Effect of traditional Chinese medicine hot compress on autophagy and expression of apoptosis related factors in the intervertebral disc of rabbits with cervical spondylosis

Chen Jiali1, Gao Hang1, Zhao Ziying1, Wang Guangyi2

1Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2022-05-16 Accepted:2022-07-09 Online:2023-09-18 Published:2023-01-28
Contact: Wang Guangyi, Master, Professor, Chief physician, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Chen Jiali, Master candidate, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the Guiyang Municipal Science and Technology Plan Program, No. (2019)9-1-4 (to WGY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

中药热敷：是将中药热奄包敷于机体体表，通过外热作用，使药物性能充分发挥作用，同时可避免药物内服所产生的毒副反应。此次研究使用的中药热奄包来源于贵州医科大学附属医院针灸科自拟方“通痹方”，该方具有祛风除湿、温经通络、活血止痛的功效，其临床疗效稳定，深得患者赞誉。
细胞自噬：自噬是溶酶体降解自身细胞质蛋白或细胞器的总称，是一种维持体内代谢和稳态的自我降解过程，被认为是变性疾病的重要保护机制。在正常情况下，椎间盘中自噬水平处于动态平衡，而这种平衡被破坏则是发生椎间盘退变及推进其病理改变的重要原因。

背景：中药热敷作为治疗颈椎病的常用方法，具有操作便捷、临床疗效稳定、不良作用少的优势，但其效应机制尚不明确。
目的：观察中药热敷对颈椎病模型兔椎间盘自噬及凋亡相关因子的影响，探讨其治疗颈椎病的作用机制。
方法：将24只新西兰兔随机分为对照组、模型组、中药热敷组，每组各8只。除对照组外，其余两组建立颈椎病兔模型。通过对比造模前、后颈椎影像学变化，观察是否有颈椎生理曲度变化、椎间孔变小、椎间隙变窄以及骨赘生成等改变，作为造模评价标准。动物模型建成后，中药热敷组予中药热敷干预治疗，20 min/次，每5 min更换一次药包，每日治疗一次，疗程共20次；其余两组正常饲养，不做干预。通过苏木精-伊红染色法观察各组兔颈椎间盘组织形态改变；采用TUNEL法检测颈椎间盘细胞凋亡情况；运用qRT-PCR法测定颈椎间盘组织Bcl-2、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3 mRNA的相对表达水平。

结果与结论： ①模型组兔颈椎间盘组织形态学评分比对照组高(P < 0.05)，中药热敷组椎间盘组织形态学评分比模型组低(P < 0.05)；②模型组兔颈椎间盘中细胞凋亡率较对照组增高(P < 0.05)，中药热敷组兔颈椎间盘中细胞凋亡率较模型组下降(P < 0.05)；③模型组兔颈椎间盘自噬及凋亡相关因子Bcl-2、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3 mRNA的相对表达水平较对照组降低(P < 0.05)，而中药热敷组兔颈椎间盘中Bcl-2、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3 mRNA的相对表达水平高于模型组(P < 0.05)；④提示中药热敷可以增加颈椎病模型兔椎间盘自噬因子的表达，减少椎间盘细胞凋亡，从而保护椎间盘，改善颈椎病。

https://orcid.org/0000-0003-3520-4356 (陈佳丽)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 中药热敷, 颈椎病, 椎间盘退变, 细胞自噬, 细胞凋亡

Abstract: BACKGROUND: Traditional Chinese medicine hot compress is a common method to treat cervical spondylosis. It has the unique advantages of convenient operation, stable curative effect and few side effects, but its effect mechanism is not clear.
OBJECTIVE: To observe the effect of traditional Chinese medicine hot compress on autophagy and expression of apoptosis related factors in the intervertebral disc of rabbits with cervical spondylosis and to explore its mechanism in the treatment of cervical spondylosis.
METHODS: Twenty-four New Zealand white rabbits were randomly divided into control group, model group, and traditional Chinese medicine hot compress group (drug group), with eight rabbits in each group. Except for the control group, 16 rabbits in the other two groups were used to establish the animal model of cervical spondylosis. The imaging changes of the cervical spine before and after modeling were compared to observe whether there were changes in the physiological curvature of the cervical spine, smaller intervertebral foramen, narrowing of the intervertebral space, and the formation of osteophytes, which could be used as the evaluation standard of modeling. After the animal model was established, the drug group was treated with traditional Chinese medicine hot compress intervention, 20 minutes per day, and the medicine bag was changed every 5 minutes, once a day, for 20 days in total. The other two groups were fed normally without intervention. The morphological changes of the cervical intervertebral disc of rabbits in each group were observed by hematoxylin-eosin staining. The apoptosis of intervertebral disc cells in each group was observed by TUNEL. The relative mRNA expression levels of Bcl-2, Beclin1, and microtubule-associated protein 1 light chain 3 in the cervical intervertebral disc were measured by real-time fluorescence quantitative PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The histological score of the cervical intervertebral disc in the model group was higher than that in the control group (P < 0.05), and the histological score of the intervertebral disc in the traditional Chinese medicine hot compress group was lower than that in the model group (P < 0.05).The apoptosis rate of rabbit cervical intervertebral disc in the model group was higher than that in the control group (P < 0.05), and the apoptosis rate of rabbit cervical intervertebral disc in the traditional Chinese medicine hot compress group was lower than that in the model group (P < 0.05). The relative mRNA expression levels of Bcl-2, Beclin1, and microtubule-associated protein 1 light chain 3 in the model group were lower than those in the control group (P < 0.05), while the relative mRNA expression levels of Bcl-2, Beclin1, and microtubule-associated protein 1 light chain 3 in the traditional Chinese medicine hot compress group were significantly higher than those in the model group (P < 0.05). To conclude, traditional Chinese medicine hot compress can increase the expression of autophagy factors in the intervertebral disc of rabbits with cervical spondylosis and reduce the apoptosis of intervertebral disc cells, so as to protect the intervertebral disc and improve cervical spondylosis.

Key words: traditional Chinese medicine hot compress, cervical spondylosis, intervertebral disc degeneration, autophagy, apoptosis

中图分类号:

陈佳丽, 高航, 赵子莹, 王光义. 中药热敷颈椎病模型兔椎间盘自噬及凋亡相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4181-4186.

Chen Jiali, Gao Hang, Zhao Ziying, Wang Guangyi. Effect of traditional Chinese medicine hot compress on autophagy and expression of apoptosis related factors in the intervertebral disc of rabbits with cervical spondylosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(26): 4181-4186.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数据分析实验选用24只新西兰大白兔，随机分为3组，16只造模后大白兔经评估均造模成功，全部进入结果分析。
2.2 造模结果评估 ①颈椎X射线片情况：造模后，对照组大白兔颈椎生理曲度、椎间隙宽度、椎间孔大小等较造模前均无明显改变。与造模前相比，造模后的模型组和中药热敷组大白兔均出现不同程度的颈椎生理曲度改变、椎间隙变窄、椎间孔变小及骨赘生成等变化，见图1。②颈椎影像学评分：造模后模型组和中药热敷组大白兔颈椎影像学评分均高于对照组(P < 0.05)，且模型组与中药热敷组无明显差异，见表2。结合大白兔颈椎X射线片情况及影像学评分显示模型组和中药热敷组大白兔造模成功。

2.3 各组兔颈椎间盘组织形态观察及评分 ①椎间盘苏木精-伊红染色可见：对照组兔纤维环结构正常，层次分明，排列紧密，未出现断裂，且纤维环与髓核组织之间无中断；模型组兔纤维结构遭到破坏，纤维之间出现较多空隙、排列松散紊乱，出现较多撕裂；中药热敷组纤维相对整齐，纤维束排列之间出现少量间隙，未出现纤维撕裂的情况，见图2。②椎间盘组织形态学评分：模型组兔颈椎间盘组织形态学评分比对照组高(P < 0.05)，中药热敷组椎间盘组织形态学评分比模型组低(P < 0.05)，见表3。

2.4 各组兔颈椎间盘细胞凋亡情况兔颈椎间盘 TUNEL染色结果提示：与对照组相比，模型组兔颈椎间盘中细胞凋亡率明显增高(P < 0.05)；与模型组相比，中药热敷组兔颈椎间盘中细胞凋亡率明显下降(P < 0.05)，见图3及表4。

2.5 各组兔颈椎间盘组织Bcl-2、Beclin1、LC3 mRNA的相对表达量模型组颈椎间盘组织中自噬及凋亡相关因子Bcl-2、Beclin1和LC3 mRNA的表达水平较对照组明显降低(P < 0.05)；而中药热敷组颈椎间盘组织中Bcl-2、Beclin1和LC3 mRNA的表达水平明显高于模型组(P < 0.05)，见表5。

参考文献

[1] 岳寿伟,魏慧,邵山.颈椎病评估与康复治疗进展[J].中国康复医学杂志,2019,34(11):1273-1277.
[2] HOY D, MARCH L, WOOLF A, et al. The global burden of neck pain: estimates from the global burden of disease 2010 study. Ann Rheum Dis. 2014;73(7):1309-1315.
[3] HURWITZ EL, LI D, GUILLEN J, et al. Variations in Patterns of Utilization and Charges for the Care of Neck Pain in North Carolina, 2000 to 2009: A Statewide Claims’ Data Analysis. J Manipulative Physiol Ther. 2016; 39(4):240-251.
[4] SKILLGATE E, PICO-ESPINOSA OJ, HALLQVIST J, et al. Healthy lifestyle behavior and risk of long duration troublesome neck pain or low back pain among men and women: results from the Stockholm Public Health Cohort. Clin Epidemiol. 2017;9:491-500.
[5] DING F, SHAO ZW, YANG SH, et al. Role of mitochondrial pathway in compression-induced apoptosis of nucleus pulposus cells. Apoptosis. 2012;17(6):579-590.
[6] HE R, WANG Z, CUI M, et al. HIF1A Alleviates compression-induced apoptosis of nucleus pulposus derived stem cells via upregulating autophagy. Autophagy. 2021;17(11):3338-3360.
[7] GONG C, ZHANG HH. Autophagy as a potential therapeutic target in intervertebral disc degeneration. Life Sci. 2021;273:119266.
[8] WANG D, HE X, WANG D, et al. Quercetin Suppresses Apoptosis and Attenuates Intervertebral Disc Degeneration via the SIRT1-Autophagy Pathway. Front Cell Dev Biol. 2020;8:613006.
[9] ZHANG S, LIANG W, ABULIZI Y, et al. Quercetin Alleviates Intervertebral Disc Degeneration by Modulating p38 MAPK-Mediated Autophagy. Biomed Res Int. 2021;2021:6631562.
[10] ZHENG Z, WANG ZG, CHEN Y, et al. Spermidine promotes nucleus pulposus autophagy as a protective mechanism against apoptosis and ameliorates disc degeneration. J Cell Mol Med. 2018;22(6):3086-3096.
[11] JIANG W, ZHANG X, HAO J, et al. SIRT1 protects against apoptosis by promoting autophagy in degenerative human disc nucleus pulposus cells. Sci Rep. 2014;4:7456.
[12] 杨帏勋,李威廷,苏菲德.中医针灸结合中药热敷治疗颈椎病疼痛的效果[J].中医临床研究,2019,11(31):50-51.
[13] 张桂平.中药热敷治疗颈椎病的临床疗效及护理观察[J]. 中国医药指南,2019,17(28):208-209.
[14] 余家阔,吴毅文,戴先进,等.颈椎病生物力学发病机制实验研究[J]. 安徽医科大学学报,1990(1):47-51.
[15] 徐银琴,高航,王光义.通痹方热敷对颈椎病家兔颈部痛阈和椎间盘退变的影响[J].贵州医科大学学报,2020,45(3):298-303.
[16] MASUDA K, AOTA Y, MUEHLEMAN C, et al. A novel rabbit model of mild, reproducible disc degeneration by an anulus needle puncture: correlation between the degree of disc injury and radiological and histological appearances of disc degeneration. Spine (Phila Pa 1976). 2005;30(1):5-14.
[17] 李跃兵,王焕梅.向贤德教授针药结合治疗神经根型颈椎病临床经验撷菁[J]. 湖南中医药大学学报,2019,39(12):1503-1506.
[18] 丁明明,陈文莉,戴益辉,等.简述中药热奄包的临床应用近况[J].江西中医药,2019,50(8):72-74.
[19] 牛明镜,王顺云.中医综合疗法治疗神经根型颈椎病97例[J].中医正骨,2012,24(3):61-62.
[20] 常献,陈斌,李长青.髓核细胞老化机制研究进展[J].中国矫形外科杂志,2014,22(1):40-42.
[21] 孟祥宇,夏建龙,杨挺,等.椎间盘退变的机制及修复[J].中国组织工程研究,2015,19(11):1768-1773..
[22] 李文举, 李亦梅. 椎间盘退变机制研究现状及生物治疗展望[J]. 中国骨与关节外科,2014,7(1):66-69.
[23] PENG B, DEPALMA MJ. Cervical disc degeneration and neck pain. J Pain Res. 2018;11:2853-2857.
[24] 苏树燕,黄瑞滨,周晓柔,等.颈椎曲度变直对青年人颈椎间盘早期退变的影响:基于56例磁共振T2-mapping[J]. 分子影像学杂志, 2020,43(2):296-299.
[25] 李沅骋,李开平,宋子琪,等.长期低头位与寒湿刺激建立颈型颈椎病动物模型的研究[J].中华中医药学刊:1-20[2022-05-14].
[26] HASCHTMANN D, STOYANOV JV, GEDET P, et al. Vertebral endplate trauma induces disc cell apoptosis and promotes organ degeneration in vitro. Eur Spine J. 2008;17(2):289-299.
[27] 邹璟,姜梦雅,李解,等.细胞凋亡参与电针对退变椎间盘保护作用的研究[J]. 时珍国医国药,2017,28(9):2271-2273.
[28] AVIN-WITTENBERG T. Autophagy and its role in plant abiotic stress management. Plant Cell Environ. 2019;42(3):1045-1053.
[29] HU YX, HAN XS, JING Q. Autophagy in Development and Differentiation. Adv Exp Med Biol. 2019;1206:469-487.
[30] MIZUSHIMA N, KOMATSU M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 2011;147(4):728-741.
[31] D’ARCY MS. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biol Int. 2019;43(6):582-592.
[32] RYTER SW, MIZUMURA K, CHOI A. The Impact of Autophagy on Cell Death Modalities. Int J Cell Biol. 2014;2014(1):502676.
[33] HE C, ZHU H, LI H, et al. Dissociation of Bcl-2–Beclin1 Complex by Activated AMPK Enhances Cardiac Autophagy and Protects Against Cardiomyocyte Apoptosis in Diabetes. Diabetes. 2013;62(4):1270-1281.
[34] NAKASHIMA A, AOKI A, KUSABIRAKI T, et al. Role of autophagy in oocytogenesis, embryogenesis, implantation, and pathophysiology of pre-eclampsia. J Obstet Gynaecol Res. 2017;43(4):633-643.
[35] GRILO AL, MANTALARIS A. Apoptosis: A mammalian cell bioprocessing perspective. Biotechnol Adv. 2019;37(3):459-475.
[36] GARCÍA-SÁEZ AJ. The secrets of the Bcl-2 family. Cell Death Differ. 2012; 19(11):1733-1740.
[37] SUN T, LI X, ZHANG P, et al. Acetylation of Beclin 1 inhibits autophagosome maturation and promotes tumour growth. Nat Commun. 2015;6:7215.
[38] ZHANG TW, LI ZF, DONG J, et al. The circadian rhythm in intervertebral disc degeneration: an autophagy connection. Exp Mol Med. 2020; 52(1):31-40.
[39] 孙忠人,栾逸先,尹洪娜,等. 夹脊电针通过调控细胞死亡治疗脊髓损伤的相关机制研究进展[J]. 中华中医药杂志,2021,36(4):2213-2215.
[40] 赵军,师建平,党赢.椎动脉型颈椎病的血管内皮细胞自噬与血瘀气虚关系探讨[J]. 中医学报,2021,36(6):1184-1186.
[41] LIU Y, SHI L, QIU W, et al. Ferulic acid exhibits anti-inflammatory effects by inducing autophagy and blocking NLRP3 inflammasome activation. Mol Cell Toxicol. 2022;18(4):509-519.
[42] WU C, CHEN H, ZHUANG R, et al. Betulinic acid inhibits pyroptosis in spinal cord injury by augmenting autophagy via the AMPK-mTOR-TFEB signaling pathway. Int J Biol Sci. 2021;17(4):1138-1152.
[43] 蔡慧倩, 粟胜勇, 张熙, 等. 温和灸对神经根型颈椎病大鼠脊髓Beclin-1/Bcl-2表达的影响[J]. 针刺研究,2020,45(10):799-805.
[44] ZHAO K, ZHANG Y, LIANG K, et al. Methylation of microRNA-129-5P modulates nucleus pulposus cell autophagy by targeting Beclin-1 in intervertebral disc degeneration. Oncotarget. 2017;8(49):86264-86276.
[45] 徐银琴, 史红美, 王光义. 通痹方热敷联合针刺治疗对退变椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响[J]. 中国组织工程研究,2021,25(5):713-718.
[46] 徐银琴,王光义.通痹方热奄包外敷对家兔退变颈椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3和Bcl-2 mRNA的影响[J].贵州医科大学学报, 2020,45(4):438-443.

引言

材料方法

1.1 设计随机分组对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较使用LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2021年4月至2022年1月在贵州医科大学动物实验中心和贵州医科大学附属医院临床医学研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物及分组选择24只5月龄健康新西兰大白兔，体质量(2.5±0.5) kg，雌雄均等，购于贵州医科大学动物实验中心，实验动物合格证编号：SYXK(黔)2018-0001。大白兔于温度16-26 ℃、湿度50%-65%的饲养室内自由饮食，单笼适应性喂养1周后，将24只家兔进行编号，使用计算机随机函数法随机分为对照组、模型组、中药热敷组，每组8只，雌雄均等。实验方案经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。大白兔在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂和仪器中药热奄包，自拟方“通痹方”，组方：葛根20 g、桂枝12 g、没药20 g、赤芍15 g、细辛10 g、川芎15 g、红花10 g、防风10 g、独活15 g、路路通10 g、伸筋草10 g、牛膝10 g、威灵仙15 g、秦艽15 g，购于贵州医科大学附属医院。
40 g/L多聚甲醛固定液(Biosharp，货号：BL539A)，无水乙醇(国药集团，货号：10009218)，二甲苯(国药集团，货号：10023418)，细胞凋亡检测试剂盒(Vazyme，货号：AF488)，抗荧光淬灭封固剂(Southernbiotech，货号：0100-01)，DAPI(碧云天，货号：C1002)，改良兔固定盒(振华仪器，型号：ZH-TGX)，数字化悬吊式X射线系统(山东佳田医学影像股份有限公司，型号：4054-2010)，PCR仪(东胜创新生物科技有限公司，型号：EDC-810)，生物显微镜(奥林巴斯，型号：BX53)，水平电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司，型号：JY300)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验模型建立 ①造模方法：参照无创颈椎生物力学诱导法造模[14]。模型组及中药热敷组兔使用动物剃毛器剔去颈部兔毛，置于改良兔固定盒，降低头部固定高度，去除上固定板，扩大家兔后肢活动空间。在大白兔颈部敷上保湿水袋，使其呈低头屈曲位45°，每日造模5 h，造模时长共8周。②评估标准：于造模前、造模后2个时间节点做大白兔颈椎左侧位X射线片检查，观察各组兔是否有颈椎生理曲度变化、椎间孔变小、椎间隙变窄以及骨赘生成等改变，并参考文献[14]进行影像学评分，作为模型评估方法。评估者不知晓分组情况。
1.4.2 干预方法 ①对照组：正常饲养，仅每日抓取一次，不做任何处理；②模型组：仅造模处理，每日抓取一次，余不做其他干预；③中药热敷组：造模完成后次日开始进行中药热敷干预治疗，根据成人(170 cm，65 kg)与兔(3 kg)表面积计算法换算比值确定动物的用药剂量(约为23 g/只)。将药物碎成细末后分装至10 cm×15 cm的纯棉纱布袋中，包裹成袋并封口，放入恒温壶中煮30 min后，待温度降至50 ℃，并将恒温壶设定为该温度下保温。然后将大白兔置于固定盒内，于颈部敷上纱布后放置经煮后的中药包，20 min/次，每5 min更换一次药包，每日治疗一次，疗程共20次[15]。

1.4.3 取材及保存方法治疗结束后，使用耳缘静脉空气栓塞法处死大白兔，并快速切开大白兔颈部皮肤，逐层剥离肌肉，钝性分离出C2-C6完整椎间盘，用PBS冲去椎间盘组织上残余血液，根据不同实验要求置于-80 ℃冰箱保存或40 g/L多聚甲醛固定液中备用。

1.4.4 观察及评估颈椎间盘组织形态变化取出固定于40 g/L多聚甲醛溶液中完整的C4/5椎间盘，用PBS浸洗后，置于EDTA脱钙液中脱钙，经石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色法染色，光学显微镜下观察组织形态学变化，参照MASUDA等[16]的方法，通过观察纤维环、纤维环与髓核之间的边界、髓核细胞、髓核基质对椎间盘组织形态进行评分。
1.4.5 TUNEL法测定椎间盘组织细胞凋亡率将各组大白兔椎间盘组织经脱钙，包埋，切片，脱蜡后，加入ProteinaseK(100 μL，20 μg/mL)，室温下孵育20 min；滴加100 μL 1×Equilibration Buffer，室温下孵育15 min；再加入TdT孵育缓冲液，放于湿盒中37 ℃条件下孵育60 min；然后滴加DAPI避光孵育5 min，进行染核，再用抗荧光淬灭剂封固，观察并采集图像。每个样本随机选取3个高倍视野(400倍)，用Image J分析统计阳性细胞数，计算出细胞凋亡率。

1.4.6 qRT-PCR检测颈椎间盘Bcl-2、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain3，LC3)mRNA的相对表达量使用Trizol法提取兔C3/4颈椎间盘组织总RNA，评估RNA质量，判断其是否满足实验要求。根据吸光光度值计算样品RNA的浓度，然后将总RNA放再低温冰箱内保存备用，使用反转录反应体系反转录为对应的cDNA。引物设计由北京擎科生物技术有限公司设计合成，进行目的基因的扩增。以GAPDH为内参基因，运用2-ΔΔCt计算方法，计算出目的基因和内参基因吸光度比值作为相对表达量。引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①观察造模前后大白兔颈椎左侧位X射线结果及影像学评分；②大白兔颈椎间盘组织形态学观察及评分；③TUNEL法测定椎间盘组织细胞凋亡率；④qRT-PCR检测颈椎间盘Bcl-2、Beclin1、LC3 mRNA的相对表达量。
1.6 统计学分析实验数据均使用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较使用LSD检验。以P < 0.05作为差异有显著性意义的标准。文章统计学方法已经贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

颈椎病属于中医“痹证”“项痹”的范畴，其多因风寒湿邪侵袭人体颈项部，阻碍机体经络气血运行所致。早在春秋战国时期，《类证治裁》中就有关于“痹证”发病机制的记载：“诸痹，风寒湿三气杂合，而犯其经络之阴也。”中医治疗痹证主要以补益气血、滋补肝肾治其本；散寒除湿、活血通络、理气止痛治其标[17]。因此，此次研究选用临床疗效稳定、操作方便，且具有祛风除湿、温经通络、行气活血功效的自拟方“通痹方”热敷于颈部使药物有效成分直达病所，通过促进颈部微循环，修复受损组织，缓解颈部不适症状[18-19]。作者前期研究发现，使用通痹方热敷颈椎病模型兔颈部，能有效提高局部痛阈[15]。此次研究观察显示，中药热敷组兔颈椎间盘纤维排列较为整齐，纤维束之间间隙较少，且椎间盘组织形态学评分较模型组降低，表明中药热敷干预可减轻或修复椎间盘组织损伤，从而缓解颈部疼痛症状。
椎间盘由髓核、纤维环和上下软骨终板组成，主要作用是减振，维持脊柱的稳定性，合理分散脊柱轴向压力[20-22]。现代医学认为，颈椎病主要是由于颈椎间盘退行性病变所致，而长期处于异常应力状态则是加速其退行性改变的主要因
素[23-24]。因而，此次研究使用改良兔固定盒，经长期低头位诱导建立模型兔颈椎病模型，以模拟人类颈椎间盘退变的主要诱因；研究中发现，经过8周造模后，兔颈椎影像学均出现不同程度的改变，主要表现为颈椎生理曲度改变、椎间孔缩小、椎间隙变窄及关节处伴有骨赘生成，与李沅骋等[25]通过长期低头位建立颈椎病动物模型的影像学结果一致。
近年来，自噬对椎间盘作用的研究备受关注，研究者发现，在正常机体内椎间盘自噬水平、营养成分及细胞凋亡均处于动态平衡的状态，而这些平衡被破坏则是椎间盘退变发生和发展的重要因素[26-27]。自噬是一种维持体内代谢和稳态的自我降解过程[28-29]，被认为是变性疾病的重要保护机制。自噬上调启动溶酶体自我降解，使细胞免受凋亡，保护椎间盘[30-31]。因此，适度上调椎间盘细胞自噬水平可减少椎间盘细胞凋亡。自噬体形成是细胞发生自噬的关键，哺乳动物酵母 Atg6(Beclin-1)能够募集和引导自噬体的结构蛋白相结合，促进自噬体成熟[32-33]；LC3是自噬体的膜蛋白；Beclin-1和LC3在自噬体形成中起关键作用，故常被作为自噬的标志物，以评价细胞自噬水平[34]。Bcl-2被认为是抑凋亡基因，主要通过控制线粒体外膜通透性，抑制促凋亡蛋白释放，从而抑制细胞凋亡[35-36]。并且Beclin-1含有Bcl-2相似的BH3结构域，两者可通过相互作用，从而调节自噬和凋亡之间的平衡[37]。因而，此次研究以Bcl-2、Beclin-1、LC3为切入点，探讨中药热敷对颈椎病兔椎间盘自噬及凋亡相关因子的表达。
既往研究已表明，自噬在轻度椎间盘退变中被激活，而重度椎间盘退变中自噬反而减少[38]。从中医气血互存的角度来看，当正气不足时，自噬被激活；而当正气亏损时，自噬能力反而下降[39]。自噬功能降低导致机体内代谢及自我降解能力减弱，是中医气血运行无力，导致病理产物生成的微观体现[40]。此次研究结果显示，模型组LC3 mRNA的表达水平降低，而中药热敷干预后LC3 mRNA的表达水平升高，表明中药热敷以扶正祛邪，促进气血运行，从而提高了细胞自噬能力。近年来研究发现许多中药成分(如阿魏酸[41]、桦木酸等[42])通过调控自噬信号通路，提高自噬水平。蔡慧倩等[43]的研究显示，温和灸可上调 Beclin-1、Bcl-2表达。ZHAO等[44]也证实通过靶向 Beclin-1调节髓核细胞自噬，可减少细胞凋亡，延缓椎间盘退变。课题组前期研究及此次研究结果显示，中药热敷能够增加颈椎病兔椎间盘Beclin-1和Bcl-2 mRNA的表达水平，降低细胞凋亡率，表明中药热敷可提高细胞自噬水平，减少细胞凋亡，进而保护椎间盘[45-46]。
综上所述，中药热敷可能通过上调Beclin-1、LC3、Bcl-2 mRNA的表达，促进椎间盘细胞自噬能力，减少细胞凋亡，从而减缓椎间盘退变，改善颈椎不适等症状，对颈椎病的防治具有潜在研究价值。然而，自噬和凋亡两者间的调控机制涉及多条信号通路参与，此文仅探讨中药热敷对椎间盘细胞自噬及凋亡相关因子Beclin-1、LC3、Bcl-2表达的影响，今后将基于信号通路进一步探究中药热敷对颈椎病的作用机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

中药热敷颈椎病模型兔椎间盘自噬及凋亡相关因子的表达

Effect of traditional Chinese medicine hot compress on autophagy and expression of apoptosis related factors in the intervertebral disc of rabbits with cervical spondylosis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 7

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	曹胜, 孔令伟, 徐昆, 孙志杰. 颈椎矢状力线参数与颈椎间盘退变患者退变节段及Pfirrmann分级的关联性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1319-1324.
[2]	刘广伟, 冯敏山, 朱立国, 尹逊路, 陈焯贤. 基于虚拟现实技术的旋提手法下颈椎间孔结构变化动态分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1346-1351.
[3]	刘金玉, 张晗硕, 崔洪鹏, 潘灵之, 赵博然, 李菲, 丁宇. 脊柱微创治疗脊髓型颈椎病的有限元生物力学分析及精准化运动康复方案[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1359-1364.
[4]	王彦金, 周英杰, 柴旭斌, 禚汉杰. 3D打印多孔钛合金椎间融合器在颈椎前路椎间盘切除植骨融合中应用效果与安全性的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1434-1440.
[5]	聂晨晨, 苏凯奇, 高静, 凡勇福, 阮晓迪, 袁洁, 段昭远, 冯晓东. 环状RNA调控脑缺血发病的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1286-1291.
[6]	练诗林, 张燕, 蒋强, 张晗硕, 李土胜, 丁宇. 全血及不同方式制备富血小板血浆对髓核细胞的干预效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1199-1204.
[7]	张晴, 高春兰, 于飞飞, 张正皓, 马芳, 高源, 李桂忠, 姜怡邓, 马胜超. 同型半胱氨酸致胰岛β细胞凋亡中肝配蛋白A型受体2 DNA甲基化升高[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 714-719.
[8]	李志超, 谭国庆, 苏辉, 徐展望, 薛海鹏. 非编码RNAs作为潜在治疗靶点在脊髓损伤中的调控效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 758-764.
[9]	赵思琦, 杜鹃, 屈海峰, 李建民, 张宇新, 刘俊杰. 丰富环境联合褪黑素对SAMP8小鼠学习记忆功能及脑神经细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 701-706.
[10]	叶林强, 陈超, 刘源辉, 李真, 卢国樑. 体位对颈椎旋转手法整复神经根型颈椎病关节突关节骨错缝的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4607-4611.
[11]	陈财, 曾平, 刘金富. 介导软骨细胞相关机制调控骨性关节炎的长链非编码RNA[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4729-4735.
[12]	许光明, 梁梓扬, 王宏波, 张震, 肖庆华, 杨吉勇, 林晓生. 斜扳手法对人体腰椎间盘退变后三关节复合体的力学效应[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(27): 4277-4282.
[13]	冉宇, 白春晓, 刘楚吟, 赵学千, 龙水文, 覃昌龙, 李忠泽, 张超, 贾育松, 陈江. 单节段Mobi-C人工间盘置换与ROI-C颈椎前路融合后颈椎矢状位参数的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(27): 4297-4303.
[14]	张君宇, 张利达, 胡滟琦, 金子开, 罗佛赐, 吴晓晴, 童婷婷, 宋小鸽, 韩为. “通督调神”电针预处理大鼠缺血半暗带区miR-124和皮质区蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4139-4146.
[15]	郭超, 李启义, 崔敬虹, 王辉, 倘艳锋. 益气活血通络汤干预膝骨关节炎大鼠关节滑膜细胞凋亡及ADAMTS-5蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4193-4199.