骨形态发生蛋白2介导同型半胱氨酸促进血管钙化

doi:10.12307/2024.183

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (25): 4027-4033.doi: 10.12307/2024.183

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

骨形态发生蛋白2介导同型半胱氨酸促进血管钙化

裴建升1，杨文娟2，何静1，燕茹2，黄晖2，贾绍斌2

1宁夏医科大学临床医学院，宁夏回族自治区银川市 750004；2宁夏医科大学总医院心脏中心，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2023-06-12 接受日期:2023-07-17 出版日期:2024-09-08 发布日期:2023-11-24
通讯作者: 贾绍斌，博士生导师，教授，主任医师，宁夏医科大学总医院心脏中心，宁夏回族自治区银川市 750004 黄晖，在读博士，副教授，主任医师，宁夏医科大学总医院心脏中心，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:裴建升，男，1997年生，内蒙古自治区阿拉善人，汉族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事血管钙化方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(8206020164)，项目负责人：黄晖

Bone morphogenetic protein-2 mediated homocysteine promotes vascular calcification

Pei Jiansheng1, Yang Wenjuan2, He Jing1, Yan Ru2, Huang Hui2, Jia Shaobin2

1School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2Heart Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2023-06-12 Accepted:2023-07-17 Online:2024-09-08 Published:2023-11-24
Contact: Jia Shaobin, Doctoral supervisor, Professor, Chief physician, Heart Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China Huang Hui, Doctoral candidate, Associate professor, Chief physician, Heart Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Pei Jiansheng, Master candidate, School of Clinical Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 8206020164 (to HH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

表型转化：正常情况下，随着机体不断发育，血管平滑肌细胞会从合成型逐渐分化成收缩型，但当机体受到钙化和动脉粥样硬化等外界危险因素刺激时，血管平滑肌细胞又会从收缩型转为合成型，将这个过程称为血管平滑肌细胞的表型转化。
高同型半胱氨酸血症：血浆同型半胱氨酸水平上调会导致一种疾病即高同型半胱氨酸血症，临床上血液中同型半胱氨酸浓度大于15 μmol/L称为高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸血症与主动脉、颈动脉和周围血管疾病的发病率增加密切相关，是动脉粥样硬化的独立危险因素。

背景：高同型半胱氨酸血症与血管钙化之间存在一定的内部联系。但是，目前有关高同型半胱氨酸血症促进血管钙化的发病机制还不清楚。

目的：探讨骨形态发生蛋白2在高同型半胱氨酸血症诱导血管钙化中的作用。
方法：人颈动脉蜡块标本根据有无钙化斑块分为钙化组(n=29)与非钙化组(n=13)。16只ApoE-/-小鼠随机分为对照组和高同型半胱氨酸血症组，每组8只。骨形态发生蛋白2转染大鼠胸大动脉平滑肌A7r5细胞，然后应用梯度浓度同型半胱氨酸(50，100，200，400 μmol/L)干预A7r5细胞。茜素红染色和苏木精-伊红染色法检测钙化反应，免疫荧光法检测骨形态发生蛋白2与Runt相关转录因子2相互作用关系，免疫组化法和Western blot检测骨形态发生蛋白2、Runt相关转录因子2、α-平滑肌肌动蛋白的表达。

结果与结论：①人体颈动脉组织染色显示，与非钙化组比较，钙化组炎性细胞增多，钙化阳性率增加(P < 0.05)；与非钙化组比较，钙化组骨形态发生蛋白2和Runt相关转录因子2表达量均上调，α-平滑肌肌动蛋白表达量下降(P均 < 0.05)；②小鼠动脉标本染色显示，高同型半胱氨酸血症组钙化面积阳性率高于对照组(P < 0.05)；高同型半胱氨酸血症组血清同型半胱氨酸水平明显高于对照组(P < 0.05)；与对照组比较，高同型半胱氨酸血症组骨形态发生蛋白2和Runt相关转录因子2表达量均上调，α-平滑肌肌动蛋白表达量下降(P均 < 0.05)；③A7r5细胞培养分析，随着同型半胱氨酸浓度梯度增加，A7r5细胞钙化程度、骨形态发生蛋白2和Runt相关转录因子2的蛋白表达增加(P < 0.05)，α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达降低(P < 0.05)；④过表达骨形态发生蛋白2的A7r5细胞培养分析，骨形态发生蛋白2过表达组较相对应的对照组、β-甘油磷酸钠组和同型半胱氨酸组钙化程度增加；Runt相关转录因子2表达上调(P < 0.05)，α-平滑肌肌动蛋白表达下调(P < 0.05)；⑤同型半胱氨酸钙化培养基培养的骨形态发生蛋白2过表达A7r5细胞中骨形态发生蛋白2表达量增加，且Runt相关转录因子2表达量随骨形态发生蛋白2表达量增加而增加；⑥结果表明，骨形态发生蛋白2是高同型半胱氨酸血症调控平滑肌细胞表型转化导致血管钙化的关键靶基因。靶向调控骨形态发生蛋白2可降低高同型半胱氨酸诱导的血管钙化。

https://orcid.org/0000-0003-0046-6890 (裴建升)；https://orcid.org/0000-0002-2517-0028 (贾绍斌)；
https://orcid.org/0000-0002-4706-4584 (黄晖)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 血管钙化, 同型半胱氨酸, 骨形态发生蛋白2, Runt相关转录因子2, 平滑肌肌动蛋白

Abstract: BACKGROUND: There is an internal relationship between hyperhomocysteinemia and vascular calcification. However, the pathogenesis of hyperhomocysteinemia promoting vascular calcification is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the role of bone morphogenetic protein-2 in hyperhomocysteinemia-induced vascular calcification.
METHODS: Human carotid wax samples were divided into a calcified group (n=29) and a non-calcified group (n=13) according to the presence or absence of calcified plaque. Sixteen ApoE-/- mice were randomly divided into a control group and a hyperhomocysteinemia group, with 8 mice in each group. Bone morphogenetic protein-2 vector was used to transfect rat thoracic artery smooth muscle A7r5 cells, and gradient concentration of homocysteine (50, 100, 200, and 400 μmol/L) was utilized to treat A7r5 cells. Calcification was detected by alizarin red staining and hematoxylin-eosin staining. The interaction of bone morphogenetic protein 2 with Runt-related transcription factor 2 was detected by immunofluorescence, and the expressions of bone morphogenetic protein 2, Runt-related transcription factor 2, and α-smooth muscle actin were detected by immunohistochemistry and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Human carotid artery tissue staining revealed that compared with the non-calcification group, inflammatory cells increased and calcification positive rate increased in the calcification group (P < 0.05). Compared with the non-calcification group, the expressions of bone morphogenetic protein-2 and Runt-related transcription factor 2 were up-regulated, and the expression of α-smooth muscle actin was decreased in the calcification group (all P < 0.05). (2) The staining of mouse arterial specimens exhibited that, the positive rate of calcified area in the hyperhomocysteinemia group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05); serum homocysteine level in the hyperhomocysteinemia group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). Compared with the control group, the expressions of bone morphogenetic protein-2 and Runt-related transcription factor 2 were up-regulated, and the expression of α-smooth muscle actin was decreased in the hyperhomocysteinemia group (all P < 0.05). (3) A7r5 cell culture analysis demonstrated that with the increase of homocysteine concentration gradient, the degree of calcification, the content of bone morphogenetic protein-2 and Runt-related transcription factor 2 protein in A7r5 cells increased (P < 0.05), and the content of α-smooth muscle actin protein decreased (P < 0.05). (4) The A7r5 cell culture analysis of overexpressed bone morphogenetic protein 2 showed that the calcification degree of the overexpressed bone morphogenetic protein 2 group was increased compared with the corresponding control group, the β-sodium glycerophosphate group, and the homocysteine group. RUNt-related transcription factor 2 expression up-regulated (P < 0.05) and α-smooth muscle actin expression down-regulated (P < 0.05). (5) The expression of bone morphogenetic protein 2 increased in A7r5 cells cultured with homocysteine in calcified medium, and the expression of Runt-related transcription factor 2 increased with the increase of bone morphogenetic protein 2 expression. (6) The results confirm that bone morphogenetic protein-2 is a key target gene in the regulation of smooth muscle cell phenotypic transformation resulting in vascular calcification by hyperhomocysteinemia. Targeted regulation of bone morphogenetic protein-2 reduces hyperhomocysteinemia-induced vascular calcification.

Key words: vascular calcification, homocysteine, bone morphogenetic protein 2, Runt-related transcription factor 2, smooth muscle actin

中图分类号:

裴建升, 杨文娟, 何静, 燕茹, 黄晖, 贾绍斌. 骨形态发生蛋白2介导同型半胱氨酸促进血管钙化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 4027-4033.

Pei Jiansheng, Yang Wenjuan, He Jing, Yan Ru, Huang Hui, Jia Shaobin. Bone morphogenetic protein-2 mediated homocysteine promotes vascular calcification[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(25): 4027-4033.

图/表（结果） 7

2.1 人体颈动脉蜡块标本病理学分组对收集的蜡块标本进行苏木精-伊红染色和茜素红染色，发现钙化组茜素红染色阳性面积多于非钙化组(P < 0.05)，与宁夏医科大学总医院病理科所调取的患者资料相符合，见图2。

2.2 BMP2参与人体颈动脉钙化表型转化免疫组化结果显示，钙化组BMP2和Runx2表达量高于非钙化组(P < 0.05)，钙化区域BMP2和Runx2高表达；钙化组α-SMA表达量低于非钙化组(P < 0.05)，钙化区域α-SMA低表达，钙化区域发生表型转化，见图3。

2.3 小鼠钙化模型建立高同型半胱氨酸血症组血清Hcy水平高于对照组(P < 0.05)，高蛋氨酸饮食使体内Hcy水平增加，小鼠体内形成高同型半胱氨酸血症；苏木精-伊红染色和茜素红染色结果显示，高同型半胱氨酸血症组头臂干组织钙化面积高于对照组(P < 0.05)，小鼠钙化模型造模成功，见图4。

2.4 小鼠头臂干组织BMP2、Runx2和α-SMA表达免疫组化结果显示，高同型半胱氨酸血症组头臂干组织BMP2和Runx2表达量高于对照组(P < 0.05)，钙化区域BMP2和Runx2高表达；高同型半胱氨酸血症组α-SMA表达量低于对照组(P < 0.05)，钙化区域α-SMA低表达，钙化区域发生表型转化，见图5。

2.5 Hcy促进平滑肌细胞钙化表型转化 CCK-8细胞活力检测显示，Hcy浓度> 800 μmol/L时细胞存活率不足50%，所以后续实验去除了800 μmol/L这个浓度；茜素红染色结果显示，A7r5细胞钙化程度随着Hcy浓度梯度增加；BMP2和Runx2蛋白含量随Hcy浓度梯度增加(P < 0.05)，α-SMA蛋白含量随Hcy浓度梯度降低(P < 0.05)，平滑肌细胞发生表型转化，见图6。

2.6 BMP2促进Hcy致平滑肌细胞钙化表型转化茜素红染色结果显示，对照+BMP2过表达组、β-甘油磷酸钠+ BMP2过表达组、Hcy+ BMP2过表达组较相对应的对照组、β-甘油磷酸钠组和Hcy组钙化程度增加，Hcy+ BMP2过表达组最明显；蛋白印迹实验显示Runx2蛋白表达随BMP2表达增加而增加(P < 0.05)，α-SMA蛋白表达随BMP2表达增加而降低(P < 0.05)，平滑肌细胞发生表型转化，见图7。

2.7 BMP2/Runx2通路介导Hcy促进平滑肌细胞钙化表型转化免疫荧光染色显示，Hcy钙化培养基培养的BMP2过表达A7r5细胞组较普通A7r5细胞组BMP2表达量增加，且Runx2表达量随BMP2表达量增加而增加(P < 0.05)，见图8。

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引言

血管钙化是由血管系统中病理性矿物质沉积引起的，被认为是引起心脑血管事件发生发展的独立预测因子[1]，是晚期动脉粥样硬化的主要特征[2]。越来越多的研究证据表明，血管钙化不是被动的、退化的、不可避免的终末过程，而是一个活跃的以血管细胞成骨分化为特征的细胞驱动过程[3]。同型半胱氨酸(homocysteinemia，Hcy)是蛋氨酸和半胱氨酸代谢的中间产物，其本身不参与蛋白质合成[4]，血浆中Hcy主要来自于饮食中的蛋氨酸[4]。血浆Hcy水平上调会导致一种疾病即高同型半胱氨酸血症。近年来，国内外学者发现Hcy水平与心血管事件发生密不可分[5]，Hcy遂成为基础和临床医学研究的新热点。课题组和其他研究发现，高同型半胱氨酸血症可引起动脉钙化，但是目前有关高同型半胱氨酸血症促进血管钙化的发病机制还不清楚。因此，探索高同型半胱氨酸血症促进血管钙化的发生机制和干预靶点意义重大。
骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)属于转化生长因子β家族[6]，是促进骨质形成和引起成骨细胞分化的最主要的细胞外信号因子[7]。课题组前期研究发现，高同型半胱氨酸血症可通过激活转录因子Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)诱导小鼠血管钙化[8]。Runx2为BMP2进入细胞核的信号通路靶点[9]，提示BMP2可能是Hcy触发血管钙化的关键基因，但BMP2在Hcy促进血管钙化中的作用机制及调控方式未见报道。因此，该研究通过人体、动物和细胞3个方面探讨了Hcy对血管平滑肌钙化的作用以及BMP2作为关键靶基因介导Hcy促进血管钙化的机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计临床对照试验、随机对照动物实验、体外细胞实验，组间比较采用配对t检验，多个样本之间比较采用Oneway ANOVA检验。
1.2 时间及地点实验于2021年8月至2022年12月在宁夏医科大学总医院心研所实验室完成。
1.3 材料

1.3.1 人体标本与分组 2016-2022年于宁夏医科大学总医院病理科收集42例颈动脉斑块剥脱术后蜡块并切片，将4 μm厚切片进行苏木精-伊红染色、茜素红染色和免疫组化染色。纳入标准：冠心病合并颈动脉狭窄，行颈动脉剥脱术患者。42例患者根据病理报告分为钙化组(n=29)与非钙化组(n=13)。所有诊断均经苏木精-伊红染色和茜素红染色检查和确认，以确保分组适当，见图1，所有人体实验方案均经宁夏医科大学总医院实验伦理委员会批准(2020-279)。所有患者均签署知情同意书。

1.3.2 动物模型与分组 C57BL/6J基因来源的8周龄ApoE-/-小鼠购自上海南方模式生物科技股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2019-0002，共购买了16只雄性ApoE-/-小鼠，体质量22-24 g，根据随机数表法分为2组，对照组给予普通饮食，高同型半胱氨酸血症组给予高蛋氨酸饮食(2%蛋氨酸)，每组8只。
所有小鼠饲养在宁夏医科大学实验动物中心，在SPF级环境内饲养，室内温度25 ℃、60%湿度，12 h/12 h光照循环。实验方案均经宁夏医科大学伦理委员会批准(批准号为2020-279)，动物操作严格按照《动物研究：体内实验报告指南》执行。
1.3.3 实验试剂和仪器 Hcy购自Sigma-Aldrich公司；大鼠胸大动脉平滑肌细胞(A7r5)购自Type Culture Collection公司；茜素红染液购自Sigma-Aldrich公司；苏木精染液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸抗原修复液、TBST洗膜液购自Servicebio公司；Hcy检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；增强酶标山羊抗兔IgG聚合物购自OriGene公司；CCK-8法细胞增殖检测试剂盒、蛋白提取试剂盒和ECL检测试剂盒购自上海吉凯基因生物公司；BMP2 Polyclonal Antibody 购自Invitrogen公司；Anti-Runx2、Anti-SMα-actin(α-SMA)购自Abcam公司；呼吸麻醉机购自VAPOMATICTM公司，型号：CWE13-13000。
1.4 方法
1.4.1 动物标本处理饲养30周后，小鼠采用流量0.8-1.0 L/min呼吸麻醉机吸入性麻醉，内含异氟醚，称质量后取材。取眼球血1 mL，迅速收集到预冷含有肝素1.5 mL EP管中，在4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min，取上清储存在-80 ℃用于检测。脱毛后，打开胸腔，剥离出心脏，生理盐水灌流，灌流针沿着小鼠心尖进入，充分灌注，见心脏变白停止灌注，充分暴露小鼠胸腹部，摘去小鼠气管，分离出血管，用无菌PBS洗涤，放入40 g/L多聚甲醛中固定，制成石蜡切片，备用。
1.4.2 苏木精-伊红染色人体颈动脉、小鼠头臂干组织切片用Histolear试剂脱蜡，蒸馏水洗涤；苏木精染色3 min，自来水漂洗5-10 s；1%盐酸乙醇分化2 s，流水冲洗2 s，显微镜下观察细胞质无色，细胞核呈蓝紫色；伊红染色3 min，不同体积分数的乙醇脱水和二甲苯透明处理，中性树胶封固，显微镜观察钙化程度并拍照，使用Image J软件计算每个切片中阳性染色表面积的百分比。
1.4.3 茜素红染色人体颈动脉、小鼠头臂干组织切片脱蜡后在37 ℃下1%茜素红染液中孵育5 min，PBS摇床洗涤3次，5 min/次，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜观察拍照；大鼠胸大动脉平滑肌细胞用40 g/L多聚甲醛溶液固定15 min，在37 ℃、1%茜素红染液中孵育5 min，甘油凝胶封固，显微镜观察拍照，使用Image J软件计算每个切片中阳性染色表面积的百分比。
1.4.4 血清Hcy检测血清Hcy检测试剂盒检测小鼠血清Hcy水平。根据说明书，将标准品一(空白孔)、标准品二(标准孔)及上述离心后的血清各39 μL加入24孔板，每组设置3个复孔，每孔再加入试剂一720 μL，混匀，37 ℃下孵育5 min后，每孔加入195 μL试剂二，37 ℃再孵育2 min，在波长为340 nm处测吸光度值。
1.4.5 免疫组化染色人体颈动脉和小鼠头臂干组织切片用Histolear试剂脱蜡，蒸馏水洗涤，在体积分数2%过氧化氢溶液中浸泡20 min，去除内源性的过氧化氢酶，用柠檬酸修复液进行抗原修复，高压锅温火蒸煮，使抗原点位暴露，冷却至室温，用体积分数10%正常山羊血清封闭30 min，然后标本滴加相应一抗(BMP2 1∶200，Runx2 1∶200，α-SMA 1∶100)，4 ℃下孵育过夜，PBS洗涤3次，滴加反应增强液20 min，滴加增强酶标山羊抗兔IgG聚合物孵育20 min，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封固，显微镜观察拍照，使用Image J软件计算每个切片中阳性染色表面积的百分比。
1.4.6 CCK-8法测定Hcy对A7r5细胞生存状态的影响在96孔板中配置100 μL细胞悬液(每孔5 000个A7r5细胞)，培养箱孵育24 h，加入不同浓度Hcy(50，100，200，400，800 μmol/L)孵育24 h，然后每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育1-4 h，然后用酶标仪检测610 nm处吸光度值，严格遵循制造商协议，计算得出50%致死率。
1.4.7 平滑肌细胞钙化模型及转染用含体积分数为10%胎牛血清及1%青链霉素混合液的DMEM培养基培养平滑肌细胞(A7r5细胞)，放入体积分数为5%CO2、37 ℃的培养箱。在倒置显微镜下观察细胞数目、密度、生长状况，待细胞生长为密度约90%时按1∶3传代。细胞分组：对照组、β-甘油磷酸钠组及β-甘油磷酸钠+Hcy组(50，100，200，400 μmol/L)。第3代平滑肌细胞接种于10 cm培养皿中，细胞数量为15×105个，对照组细胞在普通DMEM培养基中培养，β-甘油磷酸钠组细胞在普通DMEM培养基中加入10 mmol/L β-甘油磷酸钠培养18 d，在体外诱导为钙化模型，β-甘油磷酸钠+Hcy组(50，100，200，400 μmol/L)在普通DMEM培养基中加入10 mmol/L β-甘油磷酸钠培养18 d，同时加入Hcy刺激平滑肌细胞。
由上海吉凯基因有限公司设计纯化BMP2过表达载体(5’-GCA TGT TTG GCC TGA AGC AGA-3’)和对照载体(5’-TTC TCC GAA CGT GTC ACG T-3’)。细胞分组：对照组(普通培养基+A7r5细胞)、对照+BMP2过表达组(普通培养基+BMP2过表达的A7r5细胞)、β-甘油磷酸钠组(钙化培养基+A7r5细胞)、β-甘油磷酸钠+BMP2过表达组(钙化培养基+BMP2过表达的A7r5细胞)、Hcy组(400 μmol/L Hcy +钙化培养基+
A7r5细胞)、Hcy+BMP2过表达组(400 μmol/L Hcy +钙化培养基+BMP2过表达的A7r5细胞)。将A7r5细胞铺在24孔板中进行细胞抗生物浓度筛选(约8×104/孔)，次日细胞密度达80%加入抗生素作用48 h后，显微镜下观察细胞状态，将全部细胞杀死的最低浓度即为该细胞适用的抗生素工作浓度，嘌呤霉素和芽孢菌素的质量浓度分别为2.5 μg/mL和3 μg/mL。然后，将细胞铺在6孔板上，细胞数约3×105/孔，细胞密度约为30%时进行慢病毒转染，3个干扰病毒，1个干扰对照病毒，1个过表达慢病毒，1个过表达对照慢病毒，感染24 h后更换新鲜培养基，72 h后观察细胞。细胞汇合度为> 100%，按1∶2比例传代。传代细胞贴壁后，用抗生素和嘌呤霉素(2.5 μg/mL)筛选传代细胞。2 d后，停止筛选，继续扩大培养范围。用荧光显微镜观察绿色荧光，扩增后进行q-PCR鉴定。
1.4.8 Western blot检测BMP2、Runx2和α-SMA蛋白表达细胞培养18 d后，用细胞刮刀刮取平滑肌细胞于离心管，用全蛋白提取试剂盒提取蛋白，BCA法检测蛋白浓度。配置10%SDS-PAGE凝胶，每孔上样约40 μg蛋白样品，电泳，上层胶90 V电压跑40 min，下层胶120 V电压跑1.5 h，电流200 mA，1.5 h，将蛋白转移至PVDF膜上，10%脱脂牛奶封闭2 h，一抗(BMP2 1∶1 000，Runx2 1∶1 000，α-SMA 1∶
1 000，GAPDH 1∶5 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤印迹膜，用5%脱脂牛奶配置二抗(1∶5 000)常温下孵育1 h，TBST洗涤印迹膜，加入ECL发光剂显影。使用Image J分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达水平，每个样本至少重复3次。
1.4.9 免疫荧光检测BMP2和Runx2蛋白互作关系细胞24孔板爬片，接种细胞8×103个/孔，在400 μmol/L Hcy诱导钙化培养基中培养普通A7r5细胞、过表达BMP2的A7r5细胞，培养18 d，PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛溶液中固定20 min，0.5%Triton X-100在室温下透膜20 min，在玻片上滴加体积分数10%普通山羊血清，室温下封闭30 min，然后标本滴加一抗Runx2在4 ℃湿润暗盒中孵育过夜，暗处滴加红色荧光二抗山羊抗兔IgG/TRITC，PBS洗涤3次，荧光封片剂(含DAPI)封固，荧光显微镜采集分析图像，用Image J软件计算每个切片中阳性染色表面积的百分比。
1.5 主要观察指标 ①人体颈动脉和小鼠头臂干组织钙化程度；②小鼠血清同型半胱氨酸水平；③人体颈动脉和小鼠头臂干组织以及平滑肌细胞中BMP2、Runx2和α-SMA表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较采用配对t检验，多个样本之间比较采用Oneway ANOVA检验，体外数据来自至少3个独立实验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经由宁夏医科大学统计学专家审核。

讨论

血管钙化是一个主动的多因子协同调控的复杂病理过程，可以累及多个器官和系统，其中冠状动脉钙化最为常见[10-11]，发病率常常随着年龄的增加而增加[12]。早在50年前，WILCKEN等[13]就证实了高同型半胱氨酸血症与心血管疾病发生呈正相关，之后大量研究反复证实Hcy是心血管疾病独立危险因素[14-16]。也有研究提示Hcy与冠状动脉钙化有关[17]，主要表现为冠脉钙盐沉积和碱性磷酸酶增多[18]，但仍然没有明确血管钙化具体机制，多种学说并存且争议不断。该研究以BMP2为靶点，从人体、动物、细胞3个方面阐述Hcy促进血管钙化发生的机制。
该研究对收集的人体颈动脉蜡块进行苏木精-伊红和茜素红染色，显示内膜发生钙化且钙化组较非钙化组茜素红染色阳性面积增加，钙化显著，与钙化常发生内膜相吻合。通过免疫组化染色发现钙化组较非钙化组平滑肌细胞表型分子α-SMA表达下降，骨转录因子Runx2表达增加，说明血管形成钙化时平滑肌细胞发生了表型转化，血管平滑肌细胞转分化学说参与了钙化形成。目前，该学说在血管钙化机制中居中心环节[19-21]。
该研究选择蛋氨酸饮食干预方式构建高同型半胱氨酸血症致小鼠体内主动脉钙化模型。高蛋氨酸饮食组较对照组Hcy水平明显增高，2%蛋氨酸成功激发小鼠体内高同型半胱氨酸血症，造模成功。通过免疫组化染色发现，高蛋氨酸饮食组小鼠钙化更明显，且表型转化更严重，实验结果与临床相符，高同型半胱氨酸血症患者的钙化积分高于无高同型半胱氨酸血症的钙化患者，且随着Hcy浓度升高钙化积分逐渐增加[1，22-23]。
该研究用高磷钙化培养基(普通培养基+10 mmol/L β-甘油磷酸钠)诱导大鼠平滑肌细胞构建细胞钙化模型。目前，体外诱导细胞钙化多以高磷诱导为主[24-25]。相比高血钙，越来越多数据证实长期高血磷是血管钙化的主要危险因素，明显增高心血管疾病发病率和死亡率[26-27]。实验用0，50，100，200，400 μmol/L Hcy刺激平滑肌细胞，发现随着Hcy浓度增加，钙化程度越来越明显，同时梯度Hcy可引起血管钙化表型转化，过表达BMP2之后，Runx2表达量随之增加，α-SMA表达量随之下降，进一步证实BMP2信号通路是促进平滑肌细胞成骨转化的重要调节通路。BMP2作为关键因子，与钙化患者预后相关[28-30]，血管钙化患者体内若BMP2表达增加也许比单纯高同型半胱氨酸血症钙化患者预后更差。BMP2主要通过旁分泌作用于平滑肌细胞与表面的Ⅱ型受体相结合，继而激活Ⅰ型受体，激活R-Smads，结合Co-Smad形成复合物，然后入核与核相关转录因子结合，激活核内靶点骨转录因子Runx2，导致血管钙化[31-34]。研究表明，BMP2参与Decorin诱导平滑肌细胞钙化和通过BMP2/Smad1/Runx2通路促进大鼠肾动脉钙化[35-36]。该实验通过特异性过表达BMP2后，钙化明显加重，Runx2表达量随之增加。免疫荧光分析发现胞浆BMP2高表达处Runx2在细胞核内也高表达，说明Runx2受BMP2调控[37-38]。BMP2通过上调Runx2表达，介导Hcy促进平滑肌细胞转分化，形成钙化。
在该研究中，作者发现了BMP2可介导Hcy促进血管钙化，可能为冠状动脉粥样硬化潜在的发病机制及治疗的关键靶点，但未对BMP2上下游通路作进一步验证，有研究表明表观遗传学参与钙化的形成[39-41]，未来将会开展组蛋白甲基化调控BMP2相关研究。
综上所述，该研究以BMP2为核心，确定了BMP2作为成骨化关键因子介导Hcy促进血管平滑肌细胞钙化表型转化。创新性的从人体、动物、细胞3个方面确定了BMP2在高同型半胱氨酸血症致钙化形成过程中的关键作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨形态发生蛋白2介导同型半胱氨酸促进血管钙化

Bone morphogenetic protein-2 mediated homocysteine promotes vascular calcification

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