CXCL5通过诱导血管钙化参与颈动脉斑块的形成

doi:10.12307/2024.204

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)：作为动脉中膜的主要细胞，维持着抗钙化的微环境，其转骨分化是血管钙化的决定性因素。血管平滑肌细胞通过产生局部促钙化环境，为钙和磷酸盐沉淀以及磷酸钙晶体生长提供成核位点，进而启动并促进钙化。
CXC基序趋化因子5(CXC-motif chemokine 5，CXCL5)：为上皮细胞衍生的中性粒细胞激活肽，是一种CXC趋化因子，可与G蛋白偶联受体CXCR2结合，并激活下游转化生长因子β受体1。研究表明，CXCL5与多种临床疾病有关，包括肥胖、糖尿病、亚临床动脉粥样硬化和急性冠状动脉综合征。

背景：CXC基序趋化因子5(CXC-motif chemokine 5，CXCL5)为上皮细胞衍生的中性粒细胞激活肽，研究发现其可能参与动脉病变。然而，CXCL5在血管钙化中的作用未见报道。

目的：探讨CXCL5在颈动脉粥样硬化的血管钙化中的作用。
方法：①细胞实验：将小鼠血管平滑肌细胞分成以下各组：成骨培养基组，Vector组(空白质粒转染到细胞中)，CXCL5组(CXCL5质粒转染到细胞中)，si-NC组(CXCL5阴性对照siRNA转染到细胞中)，si-CXCL5组(CXCL5 siRNA转染到细胞中)，Vector+LY2157299组和CXCL5+LY2157299组(细胞转染24 h后，将转化生长因子β受体1激酶抑制剂LY2157299加入细胞中)。进行茜素红染色、碱性磷酸酶染色和钙含量测定以评估血管平滑肌细胞成骨分化水平。②动物实验：48只ApoE-/-小鼠随机分成4组：Con+si-NC组、Con+si-CXCL5组、CAS+si-NC组和CAS+si-CXCL5组，前2组不造模，尾静脉注射si-NC或si-CXCL5慢病毒；后2组制备颈动脉粥样硬化模型，尾静脉注射si-NC或si-CXCL5慢病毒。采用Von Kossa染色和免疫组织化学染色评估小鼠颈动脉血管钙化以及CXCL5、转化生长因子β受体1表达情况。

结果与结论：①CXCL5组细胞Runt相关转录因子2蛋白水平上调、α-平滑肌肌动蛋白水平下调，si-CXCL5组中的发现与其相反；CXCL5过表达上调了转化生长因子β受体1水平，而CXCL5敲低抑制了转化生长因子β受体1水平。②与Vector组相比，CXCL5组细胞茜素红染色的强度、碱性磷酸酶活性和钙含量显著增加(P < 0.05)；与si-NC组相比，si-CXCL5组上述2项指标显著降低(P < 0.05)；当用LY2157299抑制转化生长因子β受体1表达时，CXCL5对平滑肌细胞的成骨转化作用减弱。③与Con+si-NC组相比，CAS+si-NC组大鼠颈动脉中CXCL5蛋白表达和血管钙化面积显著增加(P < 0.05)；与CAS+si-NC组相比，CAS+si-CXCL5组颈动脉中上述2项指标显著降低(P < 0.05)。④与Con+si-NC组相比，CAS+si-NC组大鼠颈动脉中Runt相关转录因子2蛋白表达显著增加(P < 0.05)和α-平滑肌肌动蛋白表达显著降低(P < 0.05)；与CAS+si-NC组相比，CAS+si-CXCL5组颈动脉中上述2项指标呈相反变化(P < 0.05)。⑤结果说明，CXCL5通过激活转化生长因子β受体1通路诱导血管平滑肌细胞成骨样转化，抑制CXCL5表达对于改善颈动脉粥样硬化小鼠颈动脉血管钙化是有效的。

https://orcid.org/0009-0006-2063-9057(亓明)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: CXC基序趋化因子5, 颈动脉粥样硬化, 血管钙化, 血管平滑肌细胞, 转化生长因子β受体1

Abstract: BACKGROUND: CXC motif chemokine 5 (CXCL5) is a neutrophil activating peptide derived from epithelial cells, which may be involved in arterial diseases. However, there is yet no report on the effect of CXCL5 in vascular calcification.
OBJECTIVE: To explore the role of CXCL5 in the vascular calcification of carotid atherosclerosis (CAS).
METHODS: (1) Cytological experiment: Mouse vascular smooth muscle cells (VSMCs) were divided into five groups: osteogenic medium group, Vector group (vector, blank plasmid transfected into VSMCs), CXCL5 group (CXCL5 plasmid transfected into VSMCs), si-NC group (CXCL5 negative control siRNA transfected into VSMCs), si-CXCL5 group (CXCL5 siRNA transfected into VSMCs), Vector+LY2157299 group and CXCL5+LY2157299 group (LY2157299 transferred into the cells 24 hours after cell transfection). Alizarin red staining, alkaline phosphatase staining, and calcium content determination were performed to evaluate the osteogenic differentiation level of VSMCs. (2) Animal experiment: Forty-eight ApoE-/- mice were randomly divided into four groups (n=12 per group): Con+si-NC group, Con+si-CXCL5 group, CAS+si-NC group and CAS+si-CXCL5 group. Animal models were not prepared in the first two groups, in which si-NC or si-CXCL5 lentivirus was injected into the tail vein; carotid atherosclerosis models were made in the latter two groups, in which si-NC or si-CXCL5 lentivirus was injected into the tail vein. Von Kossa staining and immunohistochemical staining were used to evaluate carotid vascular calcification and the expression of CXCL5 and transforming growth factor-β receptor 1 (TGFBR1) in mice.
RESULTS AND CONCLUSION: In the CXCL5 group, the protein level of runt-related transcription factor 2 (RUNX2) was up-regulated and the level of α-smooth muscle actin was down-regulated, in contrary to the findings in the si-CXCL5 group. In addition, CXCL5 overexpression upregulated the level of TGFBR1, while CXCL5 knockdown inhibited the level of TGFBR1. Compared with the Vector group, the intensity of alizarin red staining, alkaline phosphatase activity and calcium content in the CXCL5 group increased significantly (P < 0.05). Compared with the si-NC group, the intensity of alizarin red staining, alkaline phosphatase activity and calcium content in the si-CXCL5 group decreased significantly (P < 0.05). When LY2157299 inhibited TGFBR1 expression, the osteogenic differentiation of VSMCs induced by CXCL5 was reduced. Compared with the Con+si-NC group, the expression of CXCL5 protein in the carotid artery and calcification area in the CAS+si-NC group increased significantly (P < 0.05). Compared with the CAS+si-NC group, the expression of CXCL5 protein in the carotid artery and vascular calcification area in the CAS+si-CXCL5 group decreased significantly (P < 0.05). In addition, compared with the Con+si-NC group, the expression of RUNX2 protein in the carotid artery in the CAS+si-NC group increased significantly (P < 0.05), while the expression of α-smooth muscle actin protein decreased significantly (P < 0.05). Compared with the CAS+si-NC group, the expression of RUNX2 protein in the carotid artery in CAS+si-CXCL5 group decreased significantly (P < 0.05), while the expression of α-smooth muscle actin protein increased significantly (P < 0.05). In conclusion, CXCL5 can induce osteogenic transformation of VSMCs by activating the TGFBR1 pathway, and inhibition of CXCL5 expression is effective in improving carotid arterial calcification in CAS mice.

Key words: CXC motif chemokine 5, carotid atherosclerosis, vascular calcification, vascular smooth muscle cell, transforming growth factor-β receptor 1

中图分类号:

亓明, 王磊, 张振. CXCL5通过诱导血管钙化参与颈动脉斑块的形成[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 186-192.

Qi Ming, Wang Lei, Zhang Zhen. CXCL5 participates in carotid plaque formation by inducing vascular calcification[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(2): 186-192.

图/表（结果） 5

2.1 细胞学实验结果
2.1.1 血管平滑肌细胞成骨分化过程中RUNX2和CXCL5的表达在成骨培养基中培养的不同时间段(0，1，3，5，7和14 d)收集血管平滑肌细胞用于qRT-PCR分析。结果表明，成骨标记RUNX2的mRNA水平以时间依赖性方式逐渐增强，见图1A。此外，CXCL5 mRNA水平以时间依赖性方式逐渐增强，在第7天达到峰值，然后在第14天有所下降，见图1B。因此，选择0，7和14 d作为以下实验的时间点。
蛋白质印迹分析显示，与第0天相比，第7，14天的血管平滑肌细胞收缩标记α-SMA显著降低(P < 0.05)，RUNX2、CXCL5、转化生长因子β受体1水平显著上调(P < 0.05)，见图1C，D。结果表明，血管平滑肌细胞在成骨培养基中培养后转变为成骨样细胞表型。

2.1.2 CXCL5促进血管平滑肌细胞的成骨转化将CXCL5过表达质粒和特异性siRNA转染到细胞中，分别过表达或敲低CXCL5的表达，然后在成骨培养基中维持7 d，以证实CXCL5和血管平滑肌细胞成骨分化之间的关系。
通过蛋白质印迹测定转染效率，结果表明过表达质粒转染显著上调CXCL5的蛋白表达，而通过siRNA转染显著下调CXCL5的蛋白表达。在CXCL5组中，RUNX2的蛋白水平上调，α-SMA的水平下调，这与在si-CXCL5组中发现相反。此外，CXCL5过表达上调了转化生长因子β受体1水平，而CXCL5敲低抑制了转化生长因子β受体1水平，见图2A，B。
茜素红染色、碱性磷酸酶染色和钙含量测定评估血管平滑肌细胞成骨分化水平。数据表明，与Vector组相比，CXCL5组中茜素红染色的强度、碱性磷酸酶活性和钙含量显著增加(P < 0.05)；与si-NC组相比，si-CXCL5组中茜素红染色的强度、碱性磷酸酶活性和钙含量显著降低(P < 0.05)，见图2C-F。总之，CXCL5在早期对血管平滑肌细胞的成骨分化具有促进作用。

2.1.3 CXCL5通过转化生长因子β受体1通路调节血管平滑肌细胞的成骨分化研究使用LY2157299来阐明CXCL5对血管平滑肌细胞成骨分化作用的潜在机制。与Vector组相比，LY2157299处理显著下调转化生长因子β受体1表达，CXCL5过表达显著上调转化生长因子β受体1表达，而LY2157299处理消除了CXCL5过表达的诱导作用。与CXCL5组相比，CXCL5+LY2157299组RUNX2的蛋白水平下调和α-SMA的水平上调(P < 0.05)，而CXCL5表达不受影响，见图3A和B。此外，碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测定和钙含量测定表明，与CXCL5组相比，CXCL5+LY2157299组碱性磷酸酶活性和钙含量显著减少(P < 0.05)，见图3C-E。

2.2 动物实验结果
2.2.1 实验动物数量分析随机分成的4组ApoE-/-小鼠，每组12只，全部进入结果分析。
2.2.2 CXCL5抑制对CAS小鼠颈动脉血管钙化的保护作用使用体内模型研究CXCL5对CAS颈动脉血管钙化的影响。Con+si-NC组和Con+si-CXCL5组在RUNX2、α-SMA的蛋白表达和颈动脉壁钙化面积方面没有明显差异，表明CXCL5抑制在正常情况下不会对研究指标产生影响；与Con+si-NC组相比，CAS+si-NC组颈动脉中CXCL5蛋白表达和血管钙化面积显著增加(P < 0.05)；与CAS+si-NC组相比，CAS+si-CXCL5组颈动脉中CXCL5蛋白表达和血管钙化面积显著降低(P < 0.05)，见图4A-E。此外，与Con+si-NC组相比，CAS+si-NC组颈动脉中RUNX2蛋白表达显著增加(P < 0.05)和α-SMA的蛋白表达显著降低(P < 0.05)；与CAS+si-NC组相比，CAS+si-CXCL5组颈动脉中RUNX2蛋白表达显著降低(P < 0.05)和α-SMA的蛋白表达显著增加(P < 0.05)，见图4A，B。通过免疫荧光证实了CAS+si-CXCL5组颈动脉中RUNX2表达较CAS+si-NC组降低和α-SMA表达较CAS+si-NC组增加，见图4F。

2.2.3 CXCL5抑制对CAS小鼠颈动脉转化生长因子β受体1通路的影响与Con+si-NC组相比，CAS+si-NC组颈动脉中转化生长因子β受体1蛋白表达显著增加(P < 0.05)；与CAS+si-NC组相比，CAS+si-CXCL5组颈动脉中转化生长因子β受体1蛋白表达显著降低(P < 0.05)，见图5。结果表明抑制CXCL5表达可抑制CAS小鼠颈动脉转化生长因子β受体1通路。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察，随机对照动物实验；单向方差分析(ANOVA)和LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2021年11月至2022年10月在大连医科大学完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞、试剂、药品及仪器小鼠血管平滑肌细胞(美国ATCC)；1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，美国Gibco公司)；体积分数10% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；上海ExCell Bio公司)；β-甘油磷酸(β-GP，上海阿拉丁公司)；地塞米松(美国Sigma Aldrich公司)；Vector、CXCL5质粒、siRNA、CXCL5 siRNA、ribo FECTTM CP转染试剂(广州RiboBio公司)；LY2157299(美国MCE公司)；Lipofectamine 3000、TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)；茜素红S溶液(广州Oricell公司)；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒、碱性磷酸酶测定试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒(上海Beyotime Biotechnology公司)；钙比色测定试剂盒(上海Beyotime公司)；iScript cDNA合成试剂盒(美国BIO-RAD公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体、Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)抗体(英国Abcam公司)；CXCL5(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；转化生长因子β受体1、GAPDH、山羊抗兔IgG(美国Proteintech公司)；山羊抗小鼠IgG、DAPI的propension Gold Anti fade试剂(美国Invitrogen Molecular Probes公司)；高脂饮食(南通特洛菲饲料科技有限公司)；ECL-Plus蛋白质印迹检测系统、图像分析系统(美国GE Healthcare公司)；iTaqTM universal SYBR green supermix、CFX96实时PCR检测系统(美国BIO-RAD公司)；CKX41显微镜(日本Olympus公司)；M200酶标仪(奥地利Tecan Infinite公司)；TCS-SP5共聚焦显微镜(德国Leica公司)。
1.3.2 实验动物从北京华阜康生物科技股份有限公司获得的10-12周龄雄性ApoE-/-小鼠48只，体质量(22±2) g，许可证号：SCXK(京) 2020-0008，饲养在(22±1) ℃、湿度45%-55%的12 h光/暗循环环境中。小鼠可以自由获得食物和水，并适应1周。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞实验
(1)细胞培养：小鼠血管平滑肌细胞在含体积分数10%FBS和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养，每2 d更换1次培养基。研究中使用了第3-8代之间的细胞。成骨培养基用于诱导血管平滑肌细胞的成骨转化，并在指定的时间(0，1，3，5，7 d)内，在DMEM培养基中补充体积分数10% FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸、10-8 mmol/L地塞米松和50 μg/mL L-抗坏血酸诱导的血管平滑肌细胞钙化，培养基每2 d更换1次。
(2)细胞转染：将血管平滑肌细胞接种到6孔板中，接种密度为5×104/孔。当细胞生长为单层时，将它们分成5组：①成骨培养基组；②Vector组：空白质粒转染到血管平滑肌细胞中，80 μL/孔；③CXCL5组：CXCL5质粒转染到血管平滑肌细胞中，80 μL/孔；④si-NC组：CXCL5阴性对照siRNA转染到血管平滑肌细胞中，50 μL/孔；⑤si-CXCL5组：CXCL5 siRNA转染到血管平滑肌细胞中，50 μL/孔。
通过Lipofectamine 3000用空白质粒或CXCL5过表达质粒转染血管平滑肌细胞。当细胞达到80%-90%汇合时进行转染。将空白质粒或CXCL5过表达质粒加入到含有P3000试剂和Opti-MEM培养基的溶液中，然后与使用Opti-MEM培养基稀释的lipofectamine 3000试剂混合。在室温下孵育15 min后，将溶液加入到在成骨培养基培养的细胞中，并保持7 d。使用ribo fect CP试剂转染siRNA。将50 nmol/L的siRNA(阴性对照siRNA)或CXCL5 siRNA与riboFECTTM CP试剂和riboFECTTM CP缓冲液混合，在室温下孵育15 min，然后加入细胞中，并保持7 d。
为了考察CXCL5是否通过转化生长因子β受体1通路调节血管平滑肌细胞的成骨分化，研究使用了选择性转化生长因子β受体1激酶抑制剂LY2157299进行实验。将血管平滑肌细胞接种到6孔板中，接种密度为5×104/孔。当细胞生长为单层时，将它们分成4组：Vector组、Vector+LY2157299组、CXCL5组、CXCL5+LY2157299组。Vector+LY2157299组和CXCL5+LY2157299组血管平滑肌细胞在转染24 h后，将100 μL LY2157299(25 nmol/L)加入细胞中，Vector组和CXCL5组加入等体积溶媒，共孵育7 d。
(3)茜素红染色：使用茜素红S溶液检查了血管平滑肌细胞的钙结节[8]。用PBS洗涤血管平滑肌细胞 3次，在室温下40 g/L多聚甲醛中固定30 min。之后，用PBS洗涤血管平滑肌细胞 3次，茜素红溶液染色10 min，在CKX41显微镜下观察钙沉积。钙结节显示为红色区域。使用10%乙酸提取钙结节以量化茜素红，经M200酶标仪测量405 nm处的吸光度。
(4)碱性磷酸酶染色及活性检测：使用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒进行碱性磷酸酶染色。用蒸馏水(ddH2O)洗涤血管平滑肌细胞15 min，室温下用40 g/L多聚甲醛固定30 min。除去多聚甲醛，用ddH2O冲洗细胞15 min，BCIP/NBT溶液染色30 min。用ddH2O冲洗细胞3次，在CKX41显微镜下拍照。
碱性磷酸酶测定试剂盒用于研究细胞的碱性磷酸酶活性。用细胞裂解缓冲液裂解血管平滑肌细胞，并使用BCA蛋白试剂盒评估总蛋白含量。然后，将细胞裂解物与对硝基苯酚溶液在37 ℃共孵育10 min。在405 nm处测定吸光度值，并将结果标准化为蛋白质水平。
(5)钙含量的测定：使用钙比色测定试剂盒测定钙含量。使用裂解缓冲液裂解血管平滑肌细胞，收集上清液，并计算总蛋白质含量。然后，将钙测定缓冲液加入细胞裂解物中。然后将溶液充分混合，并在室温下共孵育10 min。在575 nm处测定吸光度值。钙含量被标准化为总蛋白质浓度。
(6)RNA提取和实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)：使用qRT-PCR评估RUNX2和CXCL5的mRNA表达。用TRIzol试剂提取细胞总RNA，并使用iScript cDNA合成试剂盒反转录成cDNA。通过iTaqTM universal SYBR green supermix在CFX96实时PCR检测系统中进行qRT-PCR分析。热循环方案为：95 ℃(30 s)、95 ℃(5 s)和60 ℃(30 s)40个循环。GAPDH用作mRNA的内部参照，使用2-ΔΔCt方法计算mRNA的表达水平。引物如下：RUNX2 Forward：5′-TGG TTA CTG TCA TGG CGG GTA-3′，Reverse：5′-TCT CAG ATC GTT GAA CCT TGC TA-3′；CXCL5 Forward：5′-GCC ACA GCA GCT TCC TCT TC-3′，Reverse：5′-TGA ATT CCA GCG GAC TCC AT-3′；GAPDH Forward：5′-GTC GCC AGC CGA GCC ACA TC-3′，Reverse：5′-CCA GGC GCC CAA TAC GAC CA-3′。
1.4.2 动物实验

(1)动物分组及建立模型：将48只ApoE-/-小鼠随机分成4组，每组12只：Con+si-NC组、Con+si-CXCL5组、CAS+si-NC组和CAS+si-CXCL5组。CAS+si-NC组和CAS+si-CXCL5组ApoE-/-小鼠用含0.25%胆固醇和15%可可脂的高脂饮食喂养14周。参照文献方法建立CAS模型[9]，在2周高脂饮食喂养后，将ApoE-/-小鼠颈动脉套上橡胶管并结扎。此外，在第6-10周每周通过尾静脉注射1.0×107 TU携带si-CXCL5或si-NC的慢病毒，一共注射5次。Con+si-NC组、Con+si-CXCL5组小鼠以正常饮食喂养，并进行相同的手术，但不放置血管周围颈动脉橡胶管。

(2)Von kossa染色和免疫组织化学：实验第10周结束时，以过量戊巴比妥钠麻醉处死小鼠，并剥离出颈动脉，经多聚甲醛固定后，在将颈动脉包埋在石蜡中并切成5 μm切片。在二甲苯中脱蜡并通过分级醇系列再水合，将载玻片浸泡在蒸馏水中。Von kossa染色：切片在紫外灯下用1%硝酸银溶液孵育15 min，然后用5%硫代硫酸钠孵育5 min，并用蒸馏水彻底清洗。将切片与核固红在室温下孵育5 min，并用分级乙醇脱水。
使用免疫组织化学染色方法测定CXCL5和转化生长因子β受体1的免疫反应性。切片与一抗(CXCL5，1∶10；转化生长因子β受体1，1∶50)在4 ℃孵育过夜，然后与生物素化连接的第二抗体在37 ℃孵育1 h。最后，切片在显微镜下用3，3′-二氨基联苯胺显影，用苏木精复染并固定。阴性对照用PBS代替一抗。
(3)免疫荧光分析：小鼠颈动脉经40 g/L多聚甲醛固定后，经20%蔗糖脱水过夜，用OCT包埋并切成7 μm切片，然后与抗Runx2抗体(1∶200)或抗α-SMA抗体(1∶200稀释)在4 ℃孵育过夜，随后与Cy3标记的山羊抗兔IgG(1∶500)和Alexa Fluor 647-标记的山羊抗小鼠IgG(1∶500)反应1 h。在PBS中充分洗涤后，将组织固定在含有DAPI的propension Gold Anti fade试剂中，并在TCS-SP5共聚焦显微镜下观察。
(4)免疫印迹分析：从血管平滑肌细胞或颈动脉组织中提取总蛋白，并使用BCA蛋白检测试剂盒进行定量。将等体积的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，并转移到PVDF膜上。在50 g/L牛血清白蛋白中封闭1 h后，将膜与下列一抗在4 ℃孵育过夜：α-SMA(1∶1 000)，RUNX2(1∶2 000)，CXCL5(1∶500)，转化生长因子β受体1(1∶500)和GAPDH(1∶2 000)。然后，将膜与山羊抗兔IgG (H + L)二抗(1∶10 000)在室温下孵育1 h。使用ECL-Plus蛋白质印迹检测系统检测信号和图像分析系统进行密度测定分析。
1.5 主要观察指标 ①血管平滑肌细胞成骨分化过程中RUNX2和CXCL5的表达；②CXCL5促进血管平滑肌细胞的成骨转化；③CXCL5通过转化生长因子β受体1通路调节血管平滑肌细胞的成骨分化；④CXCL5抑制对CAS小鼠颈动脉血管钙化的保护作用；⑤CXCL5抑制对CAS小鼠颈动脉转化生长因子β受体1通路的影响。
1.6 统计学分析数据表示为x±s，并使用GraphPad Prism 8.0进行数据分析。使用单向方差分析(ANOVA)和LSD检验评估不同组之间的统计显著性。P < 0.05认为差异有显著性意义。该文章的统计学方法已经过大连医科大学统计学专家审核。

讨论

血管钙化与心血管疾病发病率和死亡率之间有很强的相关性[10]。然而，目前还没有针对血管钙化的最佳治疗策略。因此，寻找有效的生物标志物和靶向治疗来解决这一问题势在必行。研究表明，血管平滑肌细胞是血管内膜增生和动脉粥样硬化斑块形成的主要细胞类型之一，其向成骨细胞样细胞表型的转化是血管钙化的主要来源[11]。在此次实验中，血管平滑肌细胞的成骨分化被用作体外血管钙化模型，在延长的成骨培养基培养中，血管平滑肌细胞逐渐转化为成骨表型，成骨标记RUNX2、碱性磷酸酶活性和钙含量的水平增加，而血管平滑肌细胞收缩标记α-SMA的水平降低，此次研究的结果与先前的研究一致[12]。据报道，活化的血管平滑肌细胞在响应损伤时从收缩状态转变为合成状态，导致α-SMA表达减少，同时RUNX2、波形蛋白和血小板反应蛋白表达增加[13]。因此，血管平滑肌细胞是颈动脉粥样硬化斑块进展中的重要参与者。
已经确定了许多因素刺激血管钙化的发展，例如炎症、氧化应激和钙磷失衡[14]。最近研究指出，趋化因子参与调节心血管钙化[15-16]。例如，YAN等[17]发现C-X-C基序趋化因子配体12/C-X-C基序趋化因子受体4信号传导途径与在高脂饮食喂养的载脂蛋白E缺乏小鼠的血管钙化和动脉粥样硬化斑块形成有关。研究发现，CXCL5可以吸引和激活中性粒细胞，促进了主动脉组织中基质金属蛋白酶9的表达和中层中性粒细胞浸润，并有助于主动脉钙化分布和夹层的发展[18-19]。CXCL5是一种由112个氨基酸组成的12 kD蛋白质，其基因位于染色体4q13-q21上，与其他几个炎症细胞因子基因位于同一基因座[20]。CXCL5可以与白细胞介素8、中性粒细胞激活肽2和GROα等相同类型的受体相互作用，并在炎症部位募集和激活CXCR2阳性细胞，如中性粒细胞[18]。然而，CXCL5和血管钙化之间的关系还有待确定。因此，作者在此次研究中设计了相关实验来验证这一假设。结果显示，CXCL5 mRNA在血管平滑肌细胞的成骨转化过程中逐渐增加，但随着成骨培养基培养时间的延长，细胞活性降低；因此，与第7天相比，CXCL5的表达在第14天下调；此后，通过用CXCL5过表达质粒和特异性siRNA转染血管平滑肌细胞来实施获得和丧失功能策略，数据表明，由于CXCL5过表达，血管平滑肌细胞钙沉积和RUNX2表达显著增加，而α-SMA的表达减少；相反，敲低CXCL5显著抑制血管平滑肌细胞的成骨转化，并且由于α-SMA表达的上调，血管平滑肌细胞的收缩表型得以恢复。上述结果支持了CXCL5在早期加速血管平滑肌细胞成骨转化中发挥重要作用。
转化生长因子β受体1通过调节血管平滑肌细胞的增殖、分化和迁移以及调节细胞外基质的形成，在心血管疾病进展中起着至关重要的作用[21]。ZHANG等[22]证明转化生长因子β受体1的特异性抑制剂(SB431542)减轻了颈动脉球囊诱导间歇低氧大鼠模型的损伤。因此，靶向转化生长因子β受体1可能为动脉粥样硬化和再狭窄提供潜在的治疗策略。最近研究证实了CXCL5/CXCR2轴可以直接与转化生长因子β受体1相互作用，并激活转化生长因子β受体1[23-24]。与上述研究一致，此次研究表明在用CXCL5过表达质粒转染后，血管平滑肌细胞中转化生长因子β受体1表达水平显著上调；然而，CXCL5敲除显著抑制了转化生长因子β受体1的表达。当用LY2157299抑制转化生长因子β受体1表达时，CXCL5过表达对血管平滑肌细胞成骨转化的促进作用减弱。此外，在CAS小鼠中观察到颈动脉中CXCL5、转化生长因子β受体1蛋白表达和血管钙化面积显著增加，而抑制CXCL5表达可抑制CAS小鼠颈动脉转化生长因子β受体1通路，并减少血管钙化面积。因此，这些结果表明CXCL5通过激活转化生长因子β受体1通路诱导血管平滑肌细胞成骨样转化，抑制CXCL5表达对于改善CAS小鼠颈动脉血管钙化是有效的。但是，此次研究的局限在于未建立敲除CXCL5基因的动物模型进行反向验证CXCL5在颈动脉血管钙化中的作用。
总之，此次研究证明CXCL5是血管平滑肌细胞成骨分化的一种新的正调控因子，这种有害作用是通过转化生长因子β受体1通路的激活来介导的。这项研究为阐明CAS的分子机制提供了新的视角，并强调了CXCL5可能在血管钙化诊断和治疗中作为新的生物标志物的事实，有助于开发抑制CAS形成的重要候选药物。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程