平滑肌细胞成骨分化致血管钙化中MAPK信号通路基因的表达谱变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.20.002

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (20): 3618-3625.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.20.002

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平滑肌细胞成骨分化致血管钙化中MAPK信号通路基因的表达谱变化

金波¹，尹恒冲²，汪凌清¹，包丽雯¹，李延林¹，朱军¹，施海明¹

1 复旦大学附属华山医院心内科，上海市 200040
2 河南省汝阳县人民医院心内科，河南省洛阳市 471200

收稿日期:2012-10-18 修回日期:2012-11-20 出版日期:2013-05-14 发布日期:2013-05-14
通讯作者: 施海明，医学博士，主任医师，教授，博士生导师，复旦大学附属华山医院心内科，上海 200040 shihmhs@yahoo.com.cn
作者简介:金波☆，男，1977年生，安徽省淮南市人，汉族，2007年复旦大学附属华山医院毕业，医学博士，主治医师，主要从事冠心病的基础和临床研究。 jinbo7711@yahoo.com.cn
基金资助:
国家自然科学基金项目(81100157)。

Expression prolife of mitogen-activated protein kinase pathway genes in vascular calcification associated with osteogenic differentiation of smooth muscle cells

Jin Bo¹, Yin Heng-chong², Wang Ling-qing¹, Bao Li-wen¹, Li Yan-lin¹, Zhu Jun¹, Shi Hai-ming¹

1 Department of Cardiology, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China
2 Department of Cardiology, Ruyang People’s Hospital, Luoyang 471200, Henan Province, China

Received:2012-10-18 Revised:2012-11-20 Online:2013-05-14 Published:2013-05-14
Contact: Shi Hai-ming, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Cardiology, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China shihmhs@yahoo.com.cn
About author:Jin Bo☆, M.D., Attending physician, Department of Cardiology, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China jinbo7711@yahoo.com.cn
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81100157

摘要/Abstract

摘要：

背景：血管钙化是一种细胞介导的主动的、可调控的复杂生物学过程，血管平滑肌细胞转分化为成骨样细胞发挥着重要作用，其确切机制尚不清楚。
目的：探讨尿毒症背景下动脉粥样硬化血管钙化的病理生理机制。
方法：采用5/6肾切除法建立尿毒症背景下ApoE-/-小鼠动脉血管钙化模型，苏木精-伊红染色和Von Kossa染色观察主动脉组织形态学特点，明确造模成功。应用小鼠全基因组Agilent芯片筛查MAPK 信号通路的差异表达基因，实时定量PCR分析验证部分与MAPK信号通路相关的差异表达基因，并结合通路分析来探索MAPK信号通路与血管钙化的内在联系。
结果与结论：造模12周后，尿毒症ApoE-/-小鼠主动脉组织形态学特点证实动脉粥样硬化钙化斑块形成。Agilent基因芯片检测结果显示，MAPK信号通路中存在14个差异表达基因，RT-PCR验证结果与芯片检测结果相符合。经KEGG通路分析，ERK1/2信号通路可能在血管钙化的病理生理过程中扮演着重要的角色。说明5/6肾切除ApoE-/-小鼠主动脉钙化斑块形成与MAPK 信号通路激活密切相关，该信号通路可能在平滑肌细胞转分化过程中起着至关重要作用。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 动脉粥样硬化, 血管钙化, 尿毒症, 平滑肌细胞, 丝裂原活化蛋白激酶, 基因芯片, 表达谱, MAPK信号通路, 形态学变化, 差异表达基因, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Vascular calcification is recognized as an active and regulated biological process involving osteoblast-like cell transdifferentiation of vascular smooth muscle cells. However, the precise mechanism of vascular calcification is still unclear.
OBJECTIVE: To explore the pathophysiological mechanism of atherosclerotic calcification in uremic mice.
METHODS: The animal model of atherosclerotic calcification in Apolipoprotein E knock-out mice was established with 5/6 nephrectomy. Histomorphological changes of aorta sections of mice were evaluted by hematoxylin-eosin staining and Von Kossa staining to confirm atherosclerotic calcification. The differentially expressed genes in mitogen-activated protein kinase pathway were evaluated using mouse whole-genome Agilent chip. Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction was used to verify gene expression changes related to mitogen-activated protein kinase pathway, and combined with pathway analysis to explore the relationship between mitogen-activated protein kinase pathway and vascular calcification.
RESULTS AND CONCLUSION: The histomorphological changes of aorta sections of uremic Apolipoprotein E knock-out mice indicated atherosclerotic calcification after 12 weeks of modeling. Microarray hybridization identified fourteen differentially expressed genes in the mitogen-activated protein kinase pathway, which have significantly altered their expression levels during atherosclerotic calcification. Reverse transcriptase-polymerase chain reaction results were consistent with the chip validation. The extracellular signal-regulated kinase 1/2 signal transduction pathway played an important role in vascular calcification, identified by KEGG pathway analysis. Experimental findings indicate that, atherosclerotic calcification in Apolipoprotein E knock-out mice with 5/6 nephrectomy is closely associated with mitogen-activated protein kinase signaling pathway, which plays an important role in smooth muscle phenotypic transition.

Key words: tissue construction, bone tissue construction, atherosclerosis, vascular calcification, uremia, smooth muscle cells, mitogen activated protein kinase, gene chip, expression profile, mitogen-activated protein kinase signaling pathway, morphology, differentially expressed gene, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

金波，尹恒冲，汪凌清，包丽雯，李延林，朱军，施海明. 平滑肌细胞成骨分化致血管钙化中MAPK信号通路基因的表达谱变化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(20): 3618-3625.

Jin Bo, Yin Heng-chong, Wang Ling-qing, Bao Li-wen, Li Yan-lin, Zhu Jun, Shi Hai-ming. Expression prolife of mitogen-activated protein kinase pathway genes in vascular calcification associated with osteogenic differentiation of smooth muscle cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(20): 3618-3625.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 动脉粥样硬化钙化组共20只SPF级ApoE-/-小鼠接受二步外科手术5/6肾脏切除法建立尿毒症模型，造模手术操作直接导致6只小鼠死亡，主要与创面出血密切相关，高脂饲料喂养过程中3只小鼠死亡；动脉粥样硬化组行假手术操作无小鼠死亡；对照组假手术过程中1只小鼠死亡，与麻醉药过量有关。

2.2 血脂和肾功能测定 对照组野生型C57BL/6J小鼠的血脂和肾功能指标均在正常范围内；动脉粥样硬化组ApoE-/-小鼠血清三酰甘油、胆固醇和低密度脂蛋白值均显著高于对照组；动脉粥样硬化钙化组和动脉粥样硬化组ApoE-/-小鼠的血脂水平差异无显著性意义；动脉粥样硬化钙化组小鼠血清尿素氮和肌酐值显著高于动脉粥样硬化组(P < 0.05)，见表1。

2.3 主动脉组织形态学特点

苏木精-伊红染色：对照组C57BL/6J小鼠主动脉内膜、中膜和外膜结构清晰，内膜面光滑，内皮细胞结构完整，见图1A；动脉粥样硬化组ApoE-/-小鼠主动脉内膜面脂质斑块形成，斑块中央可见泡沫细胞，细胞间少量胆固醇结晶沉积，见图1B；动脉粥样硬化钙化组尿毒症加速ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块形成，巨噬细胞浸润，胆固醇结晶沉积，血管平滑肌细胞增生显著，见图1C。

von Kossa染色：对照组C57BL/6J小鼠主动脉结构完整，未发现蓝黑色颗粒沉积，见图2A；动脉粥样硬化组ApoE-/-小鼠主动脉内膜仅偶见蓝黑色颗粒沉积,钙化程度较轻，见图2B；动脉粥样硬化钙化组尿毒症ApoE-/-小鼠主动脉管壁平滑肌细胞排列紊乱，内膜和中膜弥漫的蓝黑色颗粒沉积，血管钙化显著，见图2C。

2.4 基因芯片样品的质量鉴定 用Trizol试剂一步法抽提3组小鼠主动脉平滑肌组织总RNA，QIAGEN RNAeasy mini kit 纯化RNA，应用Agilent 2100 Bioanalyzer测定RNA浓度和纯度，对样品进行变性琼脂糖凝胶电泳，18S和28S条带清晰可见，见图3，质检指标2100 RIN≥7.0且28S/18S≥0.7，结果表明样品总RNA纯度较高，RNA无明显降解，符合基因芯片检测要求。

2.5 基因芯片检测结果 应用Agilent小鼠全基因组表达谱芯片检测3组小鼠主动脉平滑肌组织mRNA表达，见图4。

通过对基因芯片结果中差异表达的基因进行GO分析找出与丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关的基因，初步结果提示，尿毒症ApoE-/-小鼠p38 丝裂原活化蛋白激酶和ERK1/2途径部分相关基因mRNA表达上调，见表2。

2.6实时荧光定量PCR结果 选择丝裂原活化蛋白激酶通路中3个差异表达的关键基因，应用实时荧光定量PCR法验证Rasgrp1、Map3k1和Rps6ka1基因的相对表达水平，见表3，应用Spearman相关分析，RT-PCR检测结果与基因芯片检测结果相吻合。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年9月至2012年3月在复旦大学上海医学院实验动物中心完成。

材料：

实验动物：健康8周龄SPF级雄性ApoE-/-小鼠(C57BL/6J--KO)30只，健康雄性C57BL/6J小鼠(背景品系)10只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2006-0008。

饲料来源：高脂饲料与普通饲料均购于斯莱康实验动物专用饲料，中科院上海实验动物中心。

方法：

实验动物分组：①动脉粥样硬化钙化组：取20只ApoE-/-小鼠，二步外科手术5/6肾脏切除法建立尿毒症模型^[7]，高脂饲料喂养，自由取食。②动脉粥样硬化组：10只ApoE-/-小鼠行双侧肾脏被膜剥离假手术，高脂饲料喂养，自由取食。③对照组：10只野生型C57BL/6J小鼠行双侧肾脏被膜剥离假手术，普通饲料喂养，每天自由取食。

标本采集：造模12周后采集小鼠主动脉和血标本，每组小鼠空腹过夜，晨起3%戊巴比妥钠麻醉，固定于操作台上，快速剪开胸骨，心腔内采血0.8 mL送检，分离血清稀释5倍测定血脂和肾功能指标。采血后直视条件下快速分离主动脉根部至腹主动脉，依据实验需求留取适量主动脉组织标本分别快速冻存于液氮中备基因芯片检测和PCR分析；体积分数10%中性甲醛固定主动脉标本，石蜡包埋，制备4 µm切片，常规方法行主动脉苏木精-伊红染色和von Kossa染色。

RNA抽提和纯化：取液氮冻存的小鼠主动脉组织，利用Trizol Regent抽提总mRNA，经Agilent Bioanalyzer 2100电泳质检合格后，采用RNeasy mini kit和RNase-Free DNase Set纯化总mRNA。纯化样品的 A₂₆₀: A₂₈₀比值应在1.8-2.0，2100 RIN≥7.0，同时琼脂糖电泳结果需显示核酸的28S/18S≥0.7。纯化后，将每组6只小鼠主动脉标本总mRNA等量混合，用于下一步的芯片实验。

芯片实验：采用Agilent表达谱4×44K芯片(ID:014868)配套试剂盒和标准操作流程对样品总mRNA进行放大和标记，并用RNeasy mini kit纯化标记好的cRNA。在滚动杂交炉中65 ℃，10 r/min杂交17 h，杂交cRNA上样量为1.65 µg，并在洗缸中洗片。完成杂交的芯片采用Agilent Microarray Scanner进行扫描，Feature Extraction软件读取数据，Gene Spring软件进行归一化处理。

数据分析：根据杂交信号，将基因分为表达(Present，P)、模糊表达(Marginal，M)和缺失(Absent，A)3种情况。组间基因变化水平进行比较，其比值(Ratio)进行log2 对数处理，FC>2为基因表达明显上调，FC<0.5为基因表达明显下调。采用SAS系统在线分析，上传已筛选的差异基因数据表，直接进行Annotation分析。

实时荧光定量PCR验证基因芯片结果：对差异表达的基因经GO分析找出与丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关的基因，并做RT-PCR对基因芯片结果进行验证。目标基因的引物及探针序列根据GenBank数据库的序列，利用Primer5.0引物设计与分析软件设计。

Rasgrp1引物序列上游：5’ GAG ACA GAA ATT CAC AAC GGT CA 3’，下游：5’CAC GAC TTT AGT TTG GCC AGG 3’；Map3k1引物上游序列：5’GGT TTC CAA ATG AGT GGT TTG 3’，下游：5’CAA TTT AAG ATT CAT TGG GGA G 3’；Rps6ka1引物序列上游：5’CAG TGC AGA CGA ACT CCT CAG AGG C 3’，下游：5’TCT GAG AGG CGA CAC TGG ACC TGC 3’；内参GAPDH引物序列上游：5’ATG CTG GCG CTG AGT ACG T 3’，下游：5’AGC CCC AGC CTI CTC CAT 3’。

引物及探针序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体操作按反转录试剂盒提供的方法进行，实验验结果由荧光定量分析软件Icycler version 3.1.1050荧光定量分析软件读取。

主要观察指标：①尿毒症背景下动脉血管钙化ApoE-/-小鼠的血脂和肾功能指标。②小鼠主动脉组织形态学特点。③基因芯片RNA样品的质量控制。④基因芯片检测丝裂原活化蛋白激酶信号通路基因在血管钙化中的表达谱变化。

统计学方法：由第一作者采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

血管钙化可以分为内膜钙化、中膜钙化和瓣膜钙化。内膜钙化与动脉粥样硬化分布一致，在损伤早期即可观察到羟基磷灰石结晶沉积，主要与动脉粥样硬化斑块的稳定性有关；中膜钙化在慢性肾脏疾病和糖尿病中更为常见，类似于骨和软骨形成，主要表现为血管壁顺应性降低；瓣膜钙化目前认为是一个与动脉粥样硬化类似的过程，高血压、糖尿病、脂代谢紊乱和氧化应激均是其危险因素，软骨骨化生是瓣膜钙化常见的特征^[8-10]。

目前认为多种因素参与了血管钙化的发病过程，提出了骨形成蛋白调节学说、细胞控制学说、凋亡体基质囊泡学说和氧化应激学说等多种假说，但这些学说均难以解释临床常见血管钙化与骨质疏松并存的现象^[11-12]。尿毒症背景下动脉粥样硬化患者血管钙化的原因是什么?目前仅有临床研究表明循环中钙磷乘积水平的增高与血管钙化的发生率增加相关。因此，明确尿毒症患者冠状动脉钙化斑块的发生机制十分重要。

血管平滑肌细胞在特定环境下表达成骨细胞表型是血管钙化过程的中心环节^[13-15]。成骨细胞和平滑肌细胞均起源于间充质细胞，羟磷灰石在成骨细胞内形成，在细胞膜上融缩，从细胞膜上脱落形成基质小泡，结合到I型胶原和非胶原基质蛋白上形成钙化。成骨细胞已完全分化，不能再进入细胞周期，而平滑肌细胞还保留其多能性，具有转分化为成骨样细胞的能力。

丝裂原活化蛋白激酶信号通路是真核细胞中的一个重要信号系统，能将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞增殖、转分化及凋亡^[16-17]。研究表明，丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路采用高度保守的三级激酶级联传递信号，不同的细胞外刺激可以激活不同的丝裂原活化蛋白激酶信号通路，通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应。在哺乳动物细胞中目前已发现4条并行的丝裂原活化蛋白激酶信号通路，其中与ERK1/2相关的细胞内信号转导途径被认为是经典丝裂原活化蛋白激酶信号转导途径，ERK1/2介导的生物学效应十分广泛，作为细胞应答环境刺激的主要信号分子之一，同样涉及细胞的多种理化应激的刺激。在丝裂原刺激后，ERK接受上游的级联反应信号，可以转位进入细胞核，从而参与细胞增殖与分化的调控^[18-19]。p38是丝裂原活化蛋白激酶家族的重要成员,在细胞受到多种刺激的作用下，p38 丝裂原活化蛋白激酶可以被磷酸化激活，进而引发下游效应分子的激活并介导细胞应激、凋亡、增殖、分化以及炎症反应等多种重要的信号通路^[20-21]。

实验应用Agilent小鼠全基因组表达谱芯片检测丝裂原活化蛋白激酶信号通路基因在血管钙化中的表达谱变化，通过对基因芯片结果中差异表达的基因进行GO分析找出与丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关的基因，进一步分析p38 丝裂原活化蛋白激酶信号通路发现，5/6肾切除ApoE-/-小鼠主动脉钙化斑块形成与p38 丝裂原活化蛋白激酶信号通路激活存在一定程度的关联，其内在确切调控机制尚有待深入探讨。ERK1/2信号通路是最具代表性丝裂原活化蛋白激酶信号转导途径，也是迄今研究得最为活跃的信号通路之一，ERK1/2途径短暂激活可以促进血管平滑肌细胞生长，而持续激活则可以诱导血管平滑肌细胞转分化为成骨样细胞^[22-23]。在血管钙化的过程中，血管平滑肌细胞向成骨样细胞的表型转化是细胞事件的主要环节，是细胞介导的可以主动调节的过程^[24-26]。血管平滑肌细胞在转分化过程中受到多种来自胞外的信号及其相关通路的调控^[27-30]，ERK1/2信号通路是真核细胞调控机制中介导细胞内信号传导的重要系统，令人感兴趣的是实验研究发现，5/6肾切除ApoE-/-小鼠主动脉钙化斑块形成与丝裂原活化蛋白激酶信号通路激活密切相关，其中ERK1/2信号通路可能在平滑肌细胞转分化过程中起着至关重要作用，但确切机制尚未明了，目前尚未见系统的研究报道^[30-36]。

该实验通过应用基因芯片技术，从mRNA水平探讨尿毒症背景下动脉粥样硬化钙化过程中丝裂原活化蛋白激酶信号通路基因的表达变化，初步证实丝裂原活化蛋白激酶信号通路可能参与调控血管钙化的病理生理进程, 为进一步研究丝裂原活化蛋白激酶信号通路对血管钙化的作用提供理论基础。本课题相关结果有助于进一步阐明平滑肌细胞成骨分化致血管钙化的病理生理机制，为今后临床治疗提供有意义的靶点。

平滑肌细胞成骨分化致血管钙化中MAPK信号通路基因的表达谱变化

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