血管平滑肌细胞增殖与p21基因启动子甲基化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.002

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (38): 6074-6078.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.38.002

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血管平滑肌细胞增殖与p21基因启动子甲基化的影响

侯晓菲1，孙晓健2

青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院，1检验科，2心内科，山东省烟台市 264000

收稿日期:2014-08-25 出版日期:2014-09-10 发布日期:2014-09-10
通讯作者: 孙晓健，博士，主任医师，青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院心内科，山东省烟台市 264000
作者简介:侯晓菲，女，1978年生，山东省文登市人，汉族，2009年东南大学毕业，硕士，主管检验师，主要从事抑癌基因研究。
基金资助:
烟台市科技发展计划项目(2010148-5)：课题题目：p21基因启动子甲基化在动脉粥样硬化发生中的作用

Role of methylation of p21 gene in the proliferation of human vascular smooth muscle cells

Hou Xiao-fei1, Sun Xiao-jian2

1Clinical Laboratory, 2Department of Cardiology, Affiliated Yuhuangding Hospital, Qingdao University Medical School, Yantai 264000, Shandong Province, China

Received:2014-08-25 Online:2014-09-10 Published:2014-09-10
Contact: Sun Xiao-jian, M.D., Chief physician, Department of Cardiology, Affiliated Yuhuangding Hospital, Qingdao University Medical School, Yantai 264000, Shandong Province, China
About author:Hou Xiao-fei, Master, Laboratorian in charge, Clinical Laboratory, Affiliated Yuhuangding Hospital, Qingdao University Medical School, Yantai 264000, Shandong Province, China
Supported by:
the Scientific Development Plan of Yantai City, No. 2010148-5

摘要/Abstract

摘要：

背景：血管平滑肌细胞增殖、迁移及表型改变是动脉粥样硬化发生的中心环节，一系列相关基因的甲基化参与该过程。
目的：观察血管平滑肌细胞p21基因启动子甲基化对其增殖活性的影响。
方法：采用组织贴块法培养人脐血管平滑肌细胞，给予不同质量浓度氧化低密度脂蛋白(0，10，20，40 mg/L)孵育24 h，甲基化特异PCR检测p21基因启动子区CpG岛甲基化程度，反转录PCR检测p21 mRNA表达，MTT比色法测定血管平滑肌细胞增殖活性。
结果与结论：氧化低密度脂蛋白呈浓度依赖性促进p21启动子甲基化和降低p21 mRNA表达，同时平滑细胞增殖活性增高。提示氧化低密度脂蛋白可以通过p21基因甲基化促进血管平滑肌细胞增殖，p21基因甲基化可能在动脉粥样硬化发生中起到一定作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 血管平滑肌细胞, p21基因, 甲基化, 动脉粥样硬化, 细胞周期蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Proliferation, migration and phenotypic changes of vascular smooth muscle cells is the core of the occurrence of atherosclerosis, and a series of related genes via methylation are involved in the process.
OBJECTIVE: To investigate the effects of oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) on DNA methylation in the promoter region of the p21 gene and its potential mechanism in the pathogenesis of atherosclerosis.
METHODS: Cultured human vascular smooth muscle cells were treated with different concentrations of ox-LDL (0, 10, 20, 40 mg/L) for 24 hours. The degree of DNA methylation was assayed by methylation-specific polymerase chain reaction, the expression of p21 mRNA was measured by reverse transcriptional polymerase chain reaction and the proliferative activity of vascular smooth muscle cells was determined by the MTT assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The ox-LDL treatment resulted in a promotion in the methylation in the promoter region of the p21 gene and a decrease in mRNA expression with a concentration-dependent manner; it also induced a dose-dependent promoting effect on vascular smooth muscle cell proliferation. The atherogenic mechanism of ox-LDL might promote vascular smooth muscle cell proliferation by the hypermethylation of the p21 gene that may lead to the occurrence and development of atherosclerosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: genes, methylation, atherosclerosis, cyclins

中图分类号:

R318

侯晓菲，孙晓健. 血管平滑肌细胞增殖与p21基因启动子甲基化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(38): 6074-6078.

Hou Xiao-fei, Sun Xiao-jian. Role of methylation of p21 gene in the proliferation of human vascular smooth muscle cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(38): 6074-6078.

图/表（结果） 1

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引言

动脉粥样硬化是严重危害人类健康的血管疾病，其机制复杂，目前尚未完全阐明。已知动脉粥样硬化形成过程中动脉中膜血管平滑肌细胞发生增殖、表型改变和迁移并转化为泡沫细胞是中心事件^[1-2]。目前已有足够的研究证据表明，细胞周期作为各种因素刺激细胞增殖的最后信号通路，在上述病理改变的血管平滑肌细胞过度增殖中占据中心地位^[3-5]。

细胞周期，尤其是G₁/S期的转换，受细胞周期蛋白(cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物(CDKIs)时空而有序的调控^[6]。细胞周期蛋白与细胞周期蛋白依赖性激酶形成各种cyclin-CDKs复合物，并激活细胞周期蛋白依赖性激酶而促进细胞周期进展，而细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物则通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶活性而负向调控细胞周期进展^[7]。

p21^(CIP1^，^WAF1)是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物中的ClP家族一员，它是位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子^[8]。p21^(CIP1^，^WAF1)基因定位于染色体6p21.2，启动区含有与p53及转化生长因子β等结合的特异序列，可被p53诱导并介导p53的抑癌功能，其mRNA的表达是受p53或其他外源性因子在转录水平调控的，主要功能在于参与p53介导的DNA损伤后细胞周期抑制及损伤修复^[9]；p21还可不依赖p53而广泛地抑制各种cyclin-CDK复合物，其C末端可与PCNA结合，使PCNA不能与DNA聚合酶形成复合物，抑制DNA复制，从而使细胞周期停滞，以量的方式调节细胞周期和细胞分化^[10]。目前认为p21是体内最重要的细胞周期蛋白，可与几乎每一个Cyclin-CDK复合物结合并使其失活，从而阻碍细胞进入S期，在细胞周期调控过程中发挥重要作用^[4-5]。p21既与肿瘤抑制作用密切相关，又能通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶复合物活性，协调细胞周期、DNA复制与修复之间的关系，从而将细胞增殖作用与细胞周期控制过程紧密相连。p21可以和p53共同构成细胞周期G₁检查站，因DNA损伤后不经过修复则无法通过，减少了受损DNA的复制和积累^[9-10]。研究表明p21表达与细胞过度增殖显著负相关^[6]。

p21等增殖抑制因子在促动脉粥样硬化因子作用下表达下调，导致动脉平滑肌细胞增殖和迁移，成为动脉粥样硬化发生的始动因素，在此过程中只有p21 mRNA的表达降低，没有p21基因突变的发生^[4-5]，传统遗传学理论对此无法解释。表观遗传学理论，尤其是DNA甲基化为解决动脉粥样硬化等多基因遗传疾病提供了新的思路^[11-16]，多个相关基因的甲基化参与了动脉粥样硬化的病理过程。DNA甲基化不改变其编码序列，但基因启动子区CpG岛高甲基化将导致基因表达抑制，使该基因沉默和失活^[16]。CpG岛甲基化经常发生在缺乏基因突变的情况下说明二者在导致基因失活的过程中发挥同等重要的作用。

本课题试图通过细胞水平研究明确p21在动脉粥样硬化发生中低表达的表观遗传学机制及其在动脉粥样硬化发生中的作用，为阐明动脉粥样硬化发病机制提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：单一样本观察。

时间及地点：实验于2012年5月至2013年12月在烟台毓璜顶医院中心实验室完成。

材料：

p21基因启动子甲基化对血管平滑肌细胞增殖影响实验用试剂：
试剂	来源
四甲基偶氮唑盐和二甲基亚砜	Sigma公司
细胞培养基、小牛血清	Gibico公司
Gp Genome DNA修饰试剂盒	Chmicon公司
PCR试剂盒	赛百盛公司
RT-PCR试剂盒	Invitrogen公司

实验方法：

人血管平滑肌细胞的培养：无菌取剖宫产胎儿脐动脉(孕妇知情同意并签署知情同意书)，剥取中膜按贴块法培养血管平滑肌细胞，取第3-5代用于实验研究。实验前以无血清培养基培养12 h使细胞处于静止状态。在无血清培养液中加入体积分数0.2%牛血清白蛋白，然后加入不同质量浓度氧化低密度脂蛋白(0，10，20，40 mg/L)刺激24 h，未加刺激同时孵育24 h细胞作为对照。

氧化低密度脂蛋白的制备：采用非连续性密度梯度超速离心法分离提取LDL。新鲜人不抗凝血低速离心分离血清，用溴化钾调节密度至1.3 g/mL，4 ℃ 50 000 r/min离心5 h，收集LDL，PBS透析48 h，超滤除菌后4 ℃保存。Lowry法定氮，根据蛋白质含量稀释成不同浓度备用。采用硫酸铜诱导氧化修饰，无EDTA-LDL(1 g/L)置于含 5 mmol/L铜离子的PBS中37 ℃温育24 h，测定修饰后LDL丙二醛浓度，置于含200 mmol/L EDTA的PBS中透析24 h后4 ℃保存备用。

p21基因甲基化检测^[17]：采用甲基化特异性PCR法。细胞蛋白酶K消化，饱和酚-氯仿法提取样本DNA，冰乙酸和醋酸钠沉淀，TE溶解，紫外分光光度计检测DNA浓度。取溶解的DNA样本1 μg，参照Gp Genome DNA修饰试剂盒应用亚硫酸盐修饰，回收后提纯，溶于TE中行PCR反应。p21甲基化特异引物上游序列为5’-TAC GCG AGG TTT CGG GAT CG-3’，下游序列5’-AAA AAC GAC CCG CGC TCG-3’，扩增产物片段为133 bp；p21非甲基化特异引物上游序列为5’-TAT GTG AGG TTT TGG GAT TGG-3’，下游序列5’-AAA AAC AAC CCA CAC TCA ACC-3’，扩增产物片段为133 bp，同时设甲基化和非甲基化阳性对照。引物由赛百盛生物公司合成。建立50 µL反应体系，内含10×反应缓冲5 µL，dNTP 1 µL，上下游引物各20 pmol，Taq酶0.5 U，模板DNA 5 μL，双蒸水补至50 µL，覆盖石蜡油，94 ℃ 5 min后，进入94 ℃变性1 min，67 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min的循环，共35个循环，最后72 ℃延伸 5 min，产物行琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察p21基因甲基化程度，拍照后扫描条带，以同一样本甲基化条带与非甲基化条带之比进行甲基化程度半定量。

p21 mRNA检测：RT-PCR法。血管平滑肌细胞经不同浓度LDL作用24 h后收获细胞，Trizole试剂提取细胞总RNA，制备cDNA。扩增p21 mRNA引物序列为5’-GTG GAC CTG TCA CTG TCT TGT AC-3’，5’-CTT CCT CTT GGA GAA GAT CAG C-3’；扩增β-actin mRNA引物序列为5’-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GGC-3’， 5’-CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC-3’。PCR反应体系包括 0.05 U/μL Taq Polymerase，250 μmol/L 4种dNTP， 10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl₂，1 μL p21上下游引物，1 μL β-actin引物，3 μL cDNA模板。反应条件为95 ℃预变性10 min，随后95 ℃变性15 s， 60 ℃复性1 min，72 ℃延伸30 s共40个循环。PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍照，图像扫描仪扫描目的条带A值后根据与内标准β-actin的A值之比比较不同样本p21 mRNA表达的差异。

细胞增殖活力检测：MTT比色法。细胞弃去培养液，PBS洗2遍，再加入20 μL MTT工作液及200 μL培养液，4 h后吸去上清，每孔加入二甲基亚砜150 μL，充分振荡使结晶物融解，490 mm波长在酶标仪上测定各孔光吸收值，以试验孔A均值/对照孔A均值作为细胞增殖的相对活性。

主要观察指标：氧化低密度脂蛋白对血管平滑肌细胞 p21甲基化和细胞增殖活性的影响。

统计学分析：计量资料数据采用x(_)±s表示，所有计算资料由第二作者在SPSS 12.0软件上进行。行单因素方差分析及两两比较(LSD和S-N-K法)。P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

本实验结果显示，在细胞水平氧化低密度脂蛋白可以促进p21甲基化。随着氧化低密度脂蛋白质量浓度升高血管平滑肌细胞p21甲基化程度越高，同时血管平滑肌细胞增殖活性随氧化低密度脂蛋白质量浓度升高而逐渐增强。

心脑血管疾病严重威胁人类健康，其病理基础是动脉粥样硬化，在此过程中血管平滑肌细胞的增殖和迁移在动脉粥样硬化形成中起到重要作用。血管平滑肌细胞在促增殖因子作用下表型改变，迁移到动脉内膜下成为富含胆固醇的泡沫细胞，成为动脉粥样硬化的主要成分^[1-2^，^4]。真核细胞从静止期到有丝分裂期被一系列的细胞周期调控因子的激活和失活所调节，其中周期素(细胞周期蛋白)和细胞周期依赖激酶(CDK)是细胞周期正性调节因子，在细胞周期的特定阶段不同的周期素特异结合不同的细胞周期依赖激酶使其激活并调控细胞周期从一个阶段向另一个阶段发展^[7-8]。在细胞周期中除正性调节因子外还存在负性调节因子周期素依赖激酶抑制剂(CDKI)，它们可以与Cyclin-CDK复合物结合并使其失活从而抑制阻碍细胞进入下一个周期^[9]。CDKI包括INK4和KIP/CIP家族，其中INK4主要存在于细胞周期的G₁期，而KIP/CIP家族特异性不强，可与多个Cyclin-CDK复合物结合从而在整个细胞周期中起到抑制作用^[10]。p21是体内最重要的细胞周期蛋白，可与几乎每一个Cyclin-CDK复合物结合并使其失活，从而阻碍细胞进入S期^[4]。目前的证据提示细胞周期作为各种因素刺激细胞增殖的最后信号通路，在血管平滑肌细胞增殖及动脉粥样硬化的发生中占据中心地位。在各种促动脉粥样硬化因子作用下，p21、p53和p27等抑制增殖因子表达降低，导致血管平滑肌细胞增殖和迁移，成为富含脂质的泡沫细胞^[4^，^8-10]。

随着表观遗传学的发展，心血管疾病相关基因的表观遗传学修饰研究受到越来越多的关注。表观遗传是指在不改变DNA一级结构的情况下调控基因的表达模式从而影响细胞基因表达，在哺乳动物体内表观遗传的主要机制是DNA甲基化和蛋白质尾端修饰，尤其是DNA甲基调控研究最为深入^[18-19]。DNA甲基化是指在甲基转移酶介导下以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，使CpG二核苷酸中胞嘧啶第5位碳原子加上一甲基基团变成5-甲基胞嘧啶的过程，DNA甲基化不改变DNA的核苷酸序列，但导致DNA转录活性改变，与基因表达与功能改变相关^[20]。高度保守的管家基因启动子区富含CpG二核苷酸，此类启动子区定义为CpG 岛。正常细胞的CpG岛由于被保护而处于非甲基化状态，启动子区高甲基化导致基因表达抑制，使该基因沉默和失活^[21]。动脉粥样硬化是多基因遗传与环境因素相互作用的结果，研究表明基因组DNA全面低甲基化和相关候选基因的异常高甲基化与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。

基因组低甲基化是衰老的特征，基因组DNA全面低甲基化与动脉粥样硬化发生密切相关，在ApoE敲除动物主动脉组织中DNA甲基化显著减少^[22]，人类动脉粥样硬化晚期斑块胞嘧啶甲基化明显降低^[23]，对冠心病患者外周血细胞DNA检测亦证实其基因组DNA整体甲基化降低^[24]。对同型半胱氨酸的研究拓展了对这一研究的认识^[25-27]，同型半胱氨酸是一种含硫的氨基酸，是蛋氨酸代谢的中间产物，当蛋氨酸含量低时同型半胱氨酸被再甲基化形成蛋氨酸。在此过程中均需要S-腺苷甲硫氨酸协调，它是体内甲基化反应的唯一甲基来源，高同型半胱氨酸导致的高S-腺苷同型半胱氨酸与甲基转移酶亲和力较高，可与S-腺苷蛋氨酸竞争甲基化酶结合位点，是甲基转移酶的强抑制剂^[26]，高同型半胱氨酸升高与体内甲基化反应潜能降低相关。由于S-腺苷同型半胱氨酸是依赖S-腺苷蛋氨酸的甲基化反应潜在的抑制物，所以同型半胱氨酸浓度的升高会影响体内许多物质的甲基化过程，同型半胱氨酸已被认为是独立的致动脉粥样硬化危险因子^[24]。

除了基因组DNA整体甲基化水平降低，在动脉粥样硬化过程中还发现一系列相关基因的高甲基化，目前研究主要集中于雌激素受体^[28-32]、抑癌基因p53以及低密度脂蛋白受体基因等^[33-36]。动脉粥样硬化患者粥样斑块中雌激素受体α(ER2α)基因启动子区CpG岛甲基化水平显著增高^[28]；体外实验结果证实致动脉粥样硬化因子可以促进血管平滑肌细胞向泡沫细胞转化，同时伴有ER2α甲基化增加和ER2α mRNA表达下调，上述结果提示ER2α基因表达沉默与动脉粥样硬化形成间存在相关性^[30]。对动脉粥样硬化患者低密度脂蛋白受体基因启动子区CpG岛甲基化状态检测发现，动脉粥样硬化患者低密度脂蛋白受体基因甲基化率显著高于健康对照组^[36]，这种异常的甲基化修饰可抑制低密度脂蛋白受体的表达，使介导胆固醇进入细胞代谢和降解的效能降低，导致血浆胆固醇水平升高。

高血脂可直接影响基因的甲基化状态，高脂饮食导致兔DNA甲基化水平紊乱及动脉粥样硬化发生，而给予抗氧化维生素可以部分逆转上述现象^[37]。在细胞培养基中加入低密度脂蛋白可导致培养的巨噬细胞基因组呈现整体高甲基化和局部低甲基化改变^[38]。在对具体相关基因研究发现氧化低密度脂蛋白导致人静脉内皮细胞促凋亡基因LOX-1，ANXA5，BAX和CASP3等表达增高，而抑制凋亡基因BCL2和cIAP-1表达降低，进一步分析发现ox-LDL是通过改变上述基因启动子区甲基化状态而影响其表达^[39]。体外实验证实氧化低密度脂蛋白呈剂量依赖性改变急性冠脉综合征患者调节性T细胞叉头样转录因子3(FOXP3)的甲基化程度及mRNA表达^[40]，但低密度脂蛋白对其他动脉粥样硬化相关基因甲基化影响的报道仍少。

研究局限性：动脉粥样硬化是一种多基因遗传性疾病，是饮食、环境和多个微效基因联合作用的结果，单一致动脉粥样硬化因素以及单一基因在动脉粥样硬化发生中的作用较小，本研究只验证了氧化低密度脂蛋白一种危险因子对单一基因p21甲基化的影响，未能模拟多因素多基因在平滑肌增殖中的联合交互作用。此外，p21甲基化与冠心病的关系尚需在人类群体研究中证实。

总之，血管平滑肌细胞的增殖和迁移是动脉粥样硬化的主要病理特征之一，本实验结果表明氧化低密度脂蛋白可以通过影响DNA的甲基化修饰引起p21高甲基化，这可能是其促血管平滑肌细胞增殖进而引起动脉粥样硬化的重要机制之一。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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血管平滑肌细胞增殖与p21基因启动子甲基化的影响

Role of methylation of p21 gene in the proliferation of human vascular smooth muscle cells

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