电镜下观察动脉粥样硬化血管损伤模型大鼠的血管超微结构

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
动脉粥样硬化血管损伤大鼠模型：选择Wistar大鼠，首先采用大剂量VitD3灌胃基础上饲高脂饲料的方法使大鼠形成血管动脉粥样硬化的病变，在这一基础上，再选用2F动脉取血栓导管损伤左侧颈总动脉，建立大鼠颈总动脉球囊损伤后狭窄模型。之后相应取损伤组大鼠动脉，分别进行血管组织学结构和超微结构的检测，以出现动脉粥样硬化改变及损伤后新生内膜增生为造模成功依据，从而成功模拟了人体血管成形术后再狭窄发生的病理过程。
再狭窄：是以管腔狭窄为特征的闭塞性血管反应，是在经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)术后几个月内发生的，通常指6个月内。其病理过程大致经历5个阶段：血栓形成期、炎症反应期、血管平滑肌细胞增殖期、细胞外基质形成期以及血管重塑期。

摘要
背景：以往的血管损伤再狭窄模型大多在健康动物的正常血管上进行，研究仅仅针对正常动脉损伤后的愈合反应，而非粥样硬化血管壁球囊损伤后的反应，因此不能精确模拟人体血管成形术后的病理过程，不能完全反映人类疾病过程。
目的：建立动脉粥样硬化大鼠颈总动脉球囊损伤模型，了解血管损伤后再狭窄的发生规律及病理机制。
方法：在大鼠动脉粥样硬化病变的基础上，使用2F球囊导管损伤大鼠左侧颈总动脉，观察术后不同时期血管内膜、中膜增生的改变并在透射电镜下观察血管壁超微结构。
结果与结论：损伤后7 d新生内膜开始形成，至3个月时内膜增厚达最大，管腔明显狭窄，损伤动脉壁可见平滑肌细胞大量增殖。电镜下可见平滑肌细胞向“合成表型”转变，后期大部分恢复正常“收缩表型”。提示，应用球囊导管可以成功建立动脉粥样硬化大鼠血管损伤动物模型，损伤后新生内膜增生导致管腔狭窄，平滑肌细胞的表型改变、迁移及增殖是内膜过度增生的病理基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0001-8623-143X(胡萍)

关键词: 实验动物, 心肺损伤与修复动物模型, 再狭窄, 球囊损伤, 新生内膜, 血管平滑肌细胞

Abstract:

BACKGROUND: Animal models of vascular restenosis used to be established in the normal vessels, and study on the healing results limits in the normal artery, not atherosclerosis; thereby, the model cannot accurately simulate the pathological process after percutaneous transluminal coronary angioplasty.
OBJECTIVE: To establish the common carotid catheter injury model in atherosclerosis rats and to study the pathogenesis of restenosis.
METHODS: The balloon catheter injury was performed on the left common carotid artery of atherosclerosis rats with 2F balloon catheter. The dynamic changes of neointimal and media hyperplasia were observed at different time points after surgery. Meanwhile, the ultrastructure of arterial wall was observed using transmission electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: The neointima formed at 7 days, and reached a peak at 3 months, vascular lumen was seriously narrow, and abundant smooth muscle proliferation could be found in the damaged artery wall. The smooth muscle cells switched from contractile type to synthetic type at the beginning after injury, and most of cells returned to contractile type finally. These findings indicate that 2.0 balloon catheter can successfully establish the carotid injury model in atherosclerosis rats; neointima hyperplasia results in lumen stenosis after injury; furthermore, phenotype transformation, proliferation, and migration of smooth muscle cells play an important role in the process of neointima hyperplasia.

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Key words: Models, Animal, Coronal Restenosis, Atherosclerosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

胡萍，陈谊，盛净. 电镜下观察动脉粥样硬化血管损伤模型大鼠的血管超微结构[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(49): 7334-7340.

Hu Ping, Chen Yi, Sheng Jing. Vascular ultrastructure in atherosclerosis rats after carotid injury under an electron microscope[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(49): 7334-7340.

图/表（结果） 1

2.1 造模成功动物数量及过程第一、二周适应期间，所有大鼠均生长情况良好；经大剂量VitD3灌胃加高脂饲料喂养的大鼠食欲明显减退，活动减少，精神较前萎靡，这些现象与喂饲高脂饲料及形成动脉粥样硬化病变有关；进行导管损伤术后各组大鼠至各时间点共有2只死亡，可能与手术中操作，出血，术后感染有关，其余均生长至各处死时间点。

造模动物流程图见图1。

2.2 模型创新性实验采用大剂量VitD3灌胃加高脂饮食的方法来造成大鼠颈动脉粥样硬化病变。大剂量VitD3灌胃，能促进肠道钙的吸收，并能破坏动脉管壁内皮的完整性，造成大鼠动脉的损伤和钙化^[10]。在损伤血管内皮后，及时给予高脂饲料提高大鼠血液中的脂质含量，使得脂质易于在血管壁沉积，加速粥样硬化的形成^[11]。在此基础上选用2F动脉取血栓导管进行损伤术，建立大鼠颈总动脉损伤模型，成功模拟了人体血管成形术后再狭窄发生的病理过程，具有一定的创新性。

2.3 模型更接近人类的特点目前大多球囊损伤动物模型是在正常血管中进行的，研究的只是正常动脉损伤后的愈合反应^[12-13]，而非粥样硬化血管壁损伤后的反应，因此不能完全反映人类疾病过程。

此次实验在建立动脉粥样硬化大鼠上再进行颈总动脉球囊损伤，使疾病模型更接近人类，更适合基础实验的要求。

2.4 血管壁形态学动态变化光镜下，正常对照组大鼠颈总动脉血管壁分为内膜、中膜和外膜，内膜由一层完整的扁平状内皮细胞构成，内膜和中膜以内弹力板为界，内弹力板完整连续；中膜由三四层平滑肌细胞构成，细胞排列层次清晰，每层细胞之间有迂曲的细弹力纤维(图2A)。未损伤对照组大鼠血管以及损伤各组大鼠右颈总动脉(对照)可见内皮下出现淡染的空泡细胞，中膜平滑肌细胞排列紊乱和钙化形成等动脉粥样硬化的改变(图2B)。

损伤后2 d，可见内皮细胞剥脱，内弹力板断裂，中层平滑肌细胞拉长，中膜有撕裂损伤，靠近管腔侧的平滑肌细胞数目增多。损伤后7 d和14 d，内皮细胞层逐渐恢复连续性，血管内表面可见大量迁移并增生的细胞，新生内膜开始形成(图3A，B)。损伤后1个月，可见血管新生内膜明显增生，细胞外基质大量形成，而细胞增殖减弱，管渐狭窄(图3C)。损伤后3个月，新生内膜进一步增厚，内膜中细胞数目相对稳定，而细胞间质大量堆积，管腔严重狭窄，使内膜/中膜面积比达1∶1以上(图3D)。损伤6个月后的标本所见与3个月时基本相似。

损伤后14 d、1个月、3个月、6个月各组血管的新生内膜/中膜面积比值与未损伤对照血管内膜/中膜面积比值相比较，结果差异均有非常显著性意义(P < 0.01)，见图4。

2.5 电镜超微结构的观测电镜下，正常对照组大鼠颈总动脉血管壁内皮细胞及平滑肌细胞形态正常，弹力板清晰，排列规则，无脂滴及钙盐沉积。正常动脉中膜血管平滑肌细胞呈梭形，胞浆中主要为大量肌丝成分，细胞器含量较少，细胞主要执行收缩功能，呈“收缩表型”(图5A)。未损伤对照组大鼠血管在透射电镜下可见血管壁存在吞噬了脂质的平滑肌细胞和巨噬细胞，有些部位也可见到钙盐沉积，这些表现是血管动脉粥样硬化的电镜下变化(图5B)，大部分血管平滑肌细胞呈收缩表型。

动脉损伤后早期(第2天)可见内皮细胞受损、剥离(图5C)，中膜血管平滑肌细胞表型即发生改变，细胞呈椭圆形，胞浆中肌丝明显减少，细胞器如线粒体、溶酶体、粗面内质网等增加，已向“合成表型”(图5D)。损伤2 d内膜出现合成型细胞，可见迁移细胞。

损伤后7-14 d损伤的动脉内膜开始有再生内皮细胞覆盖(图5E)，可见到迁移和增生的血管平滑肌细胞，细胞异型，排列方向与内皮呈垂直关系。损伤后1个月，内膜中见大量与内皮垂直排列的合成型血管平滑肌细胞，内膜明显增厚，细胞排列紊乱(图5F)。到损伤后3，6个月，在增生内膜及中膜中大部分的血管平滑肌细胞都恢复为收缩表型，胞浆内细胞器减少，肌丝含量增多，细胞间有大量的弹性和胶原纤维堆积。

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引言

经皮冠状动脉腔内成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)的应用为冠心病的治疗开辟了崭新的途径，但PTCA术后血管再狭窄仍然是临床上急需解决的难题^[1-2] 。PTCA术后再狭窄的形成是多因素作用的结果，近年来多数研究认为，其发生机制主要是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的表型改变(由收缩型向合成型转化)、过度增生、迁移以及细胞外基质的分泌所构成的新生内膜形成^[3-4]。

多年来，国内外学者建立了多种动物模型来模拟PTCA术后再狭窄的过程，以便从基础实验中来研究再狭窄机制及其防治措施^[5-6]，但没有单独某种动物模型能复制出人体再狭窄的全过程。制造动物模型时应考虑到动物模型的特异性和局限性，在比较和选用再狭窄模型时应充分考虑到各方面因素：包括动脉因素(应与人冠脉口径相当、结构类似)、损伤性质(动物种类对损伤的反应程度不同、受损程度、损伤部位血栓形成及血液流变学因素)以及实用程度(包括血管口径、动物大小、动物来源、喂饲成本、是否易于操作等)。而且以往的血管损伤手术也大多在健康动物的正常血管上进行，研究仅仅针对正常动脉损伤后的愈合反应，而非粥样硬化血管壁球囊损伤后的反应，不能精确模拟人体血管成形术后的病理过程。

大鼠颈总动脉球囊损伤模型是再狭窄研究中最常用的动物模型之一，也是研究内皮剥脱后反应性内膜增生的经典模型^[7]。实验在造成大鼠动脉粥样硬化病变的基础上，使用2F球囊导管建立大鼠颈总动脉球囊损伤的再狭窄模型，进一步研究血管损伤后局部组织学及超微结构变化，为再狭窄发生发展的规律及病理生理机制研究提供新的证据。

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材料方法

1.1 材料实验于2011年7月至2014年7月在交通大学医学院附属第九人民医院动物实验室及组织工程实验室完成。

1.1.1 实验动物及分组选择2月龄清洁级雄性Wistar大鼠32只，体质量160-190 g，大鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，所有实验大鼠购买后于清洁级动物房分组，分笼饲养。

32只Wistar大鼠随机分成8组，每组4只，包括正常对照组、未损伤对照组、损伤后2 d、7 d、14 d、1个月、3个月、6个月组。实验中对大鼠的处置符合动物伦理学标准。

1.1.2 饲料及器材 2F动脉取血栓导管(120602F)由爱德华生命科学有限公司(美国)提供。

标准饲料购自上海海军研究所，高脂饲料为93.45%标准饲料+1%胆固醇+0.35%胆酸+0.2%丙基硫氧嘧啶+5%猪油。

1.2 动脉粥样硬化大鼠颈总动脉球囊损伤模型制备除正常对照组外，其余7组大鼠均采用大剂量VitD3灌胃基础上饲高脂饲料的方法使之形成血管动脉粥样硬化病变^[8]。之后球囊损伤的6组大鼠按文献方法均以2F动脉取血栓导管损伤左侧颈总动脉，建立大鼠颈总动脉球囊损伤后狭窄模型^[9]。

造模成功的标准：取损伤组大鼠动脉，分别进行血管组织学结构和超微结构的检测，以出现动脉粥样硬化改变及损伤后新生内膜增生为造模成功依据。

1.3 标本制备正常对照组大鼠于适应性喂养2周后即处死；未损伤对照组于建立动脉粥样硬化模型后即处死；其余球囊损伤6组大鼠分别于球囊损伤后相应时间点处死。

处死后球囊损伤各组大鼠取出损伤部位左颈总动脉约1 cm，右颈总动脉中段约1 cm为对照，正常对照组和未损伤对照组取出左颈总动脉中段约1 cm，并将动脉平均分为2段。其中一段浸入40 g/L多聚甲醛中固定12-24 h，制备石蜡标本，用于光镜下病理组织观察。另一段浸入4 ℃，2%的戊二醛/磷酸缓冲液中固定2-24 h，制备透射电镜标本，电镜下观察组织超微结构。

1.4 光镜下血管形态学观察石蜡标本切片，分别行苏木精-伊红染色和弹力纤维特殊染色(Verhoeff铁苏木素染色法)。染色完成后光镜下观察血管壁形态学改变。计算机图像分析系统(Image pro Plus 4.5图像分析软件)测定，分别测量血管内膜和中膜横断面的面积，并计算内膜与中膜的面积比值。

1.4.1 苏木精-伊红染色步骤切片经二甲苯脱蜡入水→苏木精染核10 min→盐酸乙醇迅速分化→流水冲洗30 min→伊红染胞浆2 min→梯度乙醇脱水→二甲苯透明→中性树脂封固。

1.4.2 Verhoeff铁苏木素染色步骤切片脱蜡至水→滴Verhoeff铁苏木素液置切片上染10-30 min(颜色呈黑色为止)→自来水洗→2%三氯化铁水溶液分色至弹性纤维清晰，显微镜下控制→自来水洗，中止分色→体积分数95%乙醇洗去碘色，95%及无水乙醇脱水→二甲苯透明→中性树脂封固。

Verhoeff铁苏木素精液的配制：5%纯乙醇苏木素储存液，10%三氯化铁，Verhoeff碘溶液，上述3液分别配置存放，用前按比例配置，混合液限当日使用。

1.5 电镜下超微结构观察电镜标本送上海交通大学附属医学院电镜室，制作超薄切片，透射电镜下观察血管组织超微结构。

1.6 主要观察指标光镜下大鼠颈动脉血管形态观察；大鼠血管内膜/中膜比测量及数据分析；电镜下超微结构观察。

1.7 统计学分析所有计量资料均以x(_)±s表示，使用SPSS19.0统计软件包进行数据处理，不同时间点组间比较采用t 检验。P < 0.01为差异有非常显著性意义， P < 0.05为差异有显著性意义，P > 0.05为差异无显著性意义。

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讨论

目前认为，PTCA术后再狭窄是冠状动脉局部损伤后的一种修复过程，其发生机制主要是血管平滑肌细胞的表型改变、增生、迁移以及细胞外基质的分泌所构成的新生内膜形成^[14-15]。多年来，国内外学者建立了多种动物模型来模拟PTCA术后再狭窄的过程，以便从基础实验中来研究再狭窄机制及其防治措施。大鼠颈总动脉球囊损伤模型是再狭窄研究中最常用的动物模型之一，也是研究内皮剥脱后反应性内膜增生的经典模型，该模型具有以下特点：①选取大鼠颈总动脉作为实验的靶血管，避免开腹，可减少干扰因素, 并且降低死亡率；②颈动脉虽然是弹性血管，但大鼠颈总动脉属于平滑肌细胞比例较高的血管类型，而且其管腔大小适中，可较好地模拟人的冠状动脉；③大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的过程与目前较公认的人类血管成形术后再狭窄的发生过程很相似，包括平滑肌细胞增殖、内膜下迁移和细胞外基质增生等；④不足之处是病变中脂质沉积较多，纤维组织增生不如人冠状动脉再狭窄明显。但此模型易于复制、能稳定形成再狭窄，故仍是PTCA术后再狭窄研究中较理想的动物模型^[7^，^16]。

虽然已有各种动物模型模拟再狭窄的各个过程，但不同动物的血管有着各不相同的生理、病理特性。而且以往的血管损伤手术大多在健康动物的正常血管上进行，研究仅仅针对正常动脉损伤后的愈合反应，而非粥样硬化血管壁球囊损伤后的反应，因此不能精确模拟人体血管成形术后的病理过程，不能完全反映人类疾病过程。此次研究首先造成大鼠颈动脉粥样硬化病变，在此基础上选用2F动脉取血栓导管进行损伤术，建立大鼠颈总动脉损伤模型，成功模拟了人体血管成形术后再狭窄发生的病理过程，为进一步研究提供理想的基础模型，并使疾病模型更接近人类，具有一定的先进性、创新性。

临床患者PTCA术后再狭窄发生时间主要在3-6个月^[17]，实验选用2，7，14 d及1，3和6个月这6个时间点，对动脉损伤后血管的病理变化作了系统观察，基本反映了再狭窄发生的全过程。但由于实验条件及时间有限，观察的时间点没有进一步延长至动脉损伤后1年及更长时间，并且小动物模型与人类动脉仍有较大差别，所以实验仍存在一定的局限性。

实验结果显示，正常大鼠颈总动脉内膜由一层完整的内皮细胞构成，内膜和中膜以连续的内弹力板为界，中膜的三四层平滑肌细胞排列层次清晰，呈同心圆状环绕管腔。损伤后2 d，可见内皮细胞剥脱，内弹力板断裂不完整，靠近管腔侧的细胞数目较正常增多，提示开始增殖，同时一些中膜血管平滑肌细胞有向内膜下迁移的趋势，可见内皮细胞损伤是再狭窄的始动因素^[18-19]，由于血管内皮细胞被损伤，破坏了血管的天然保护屏障，使各种生物活性物质如细胞因子、生长因子和趋化因子等之间的平衡被打破，同时促使血管平滑肌细胞增殖和迁移，引起内膜中细胞外基质的大量生成和沉积^[20-21]。

生理状态下, 血管壁平滑肌细胞处于细胞周期的静止期，呈收缩表型。收缩型平滑肌细胞呈长梭形，胞浆内含丰富的肌纤维，细胞器含量较少，其主要功能是通过收缩和舒张，调节血管的张力和组织的血流供应。当血管壁受到损伤，平滑肌细胞的表型会发生改变, 表现为细胞肌丝成分减少，细胞器含量明显增多，细胞转变为蛋白质合成功能活跃的合成表型，并进入分裂周期^[22-23]。平滑肌细胞可从血管中膜迁移至内膜，在内膜处进一步分裂增殖，并合成和分泌大量细胞外基质，形成新生内膜^[24]。至损伤晚期，血管壁内稳态恢复，平滑肌细胞功能也逐渐转为静止，细胞再转变为收缩表型，此时内膜增生亦随之趋于停止。

本实验还显示，损伤后7-14 d内皮细胞开始再生，电镜下见新生内皮细胞结构改变，此时平滑肌细胞仍大量增殖并迁移，提示再生内皮细胞功能紊乱，对血管平滑肌细胞增殖和迁移的抑制性减弱。研究资料显示，中膜平滑肌细胞在球囊损伤术后24 h即开始增殖，仅几天后在内膜中可发现迁移的平滑肌细胞，平滑肌细胞增殖7-14 d达高峰，可持续一两个月^[25]。实验中也观察到血管平滑肌细胞在损伤后2-14 d大量增生并迁移至内膜，细胞形态和排列都发生了改变，新生内膜逐渐形成并增厚。之后细胞增生趋向稳定，但由于细胞体积的增加和细胞外基质的分泌，致使内膜继续增厚。至损伤后个3个月，内膜增厚达最大，管腔明显狭窄，而内膜中细胞数目相对稳定。以上结果表明大鼠动脉球囊损伤后平滑肌细胞增生在术后早期(2-14 d)就已达到高峰，提示若在冠心病患者PTCA术后早期积极给予抑制内膜增生的防治措施，可能对控制再狭窄有较大帮助。

总之，利用球囊导管可以成功建立大鼠血管损伤动物模型，损伤后新生内膜增生导致管腔狭窄，平滑肌细胞的表型改变、迁移、增殖以及细胞外基质分泌是内膜过度增生的病理基础。通过研究血管损伤后局部组织学及超微结构变化为今后采用干预措施来抑制新生内膜增生对再狭窄的治疗具有重要意义。

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