急性脊髓损伤动物模型的建立与评估

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.007

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (49): 7341-7348.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.49.007

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急性脊髓损伤动物模型的建立与评估

吴杨鹏，范筱，张俐

福建中医药大学骨伤学院省部共建教育部重点实验室，福建省福州市 350122

收稿日期:2016-09-06 出版日期:2016-11-30 发布日期:2016-11-30
通讯作者: 张俐，博士，教授，博士生导师，福建中医药大学骨伤学院省部共建教育部重点实验室，福建省福州市 350122
作者简介:吴杨鹏，男，1990年生，福建省漳州市人，汉族，福建中医药大学在读硕士，主要从事脊髓损伤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81273775)；福建省百千万工程领军人才项目(闽委人才2014[4]号)

Establishment and evaluation of the animal model of acute spinal cord injury

Wu Yang-peng, Fan Xiao, Zhang Li

Key Laboratory of Ministry of Education of the People’s Republic of China, School of Orthopaedics and Traumatology of TCM, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China

Received:2016-09-06 Online:2016-11-30 Published:2016-11-30
Contact: Zhang Li, M.D., Professor, Doctoral supervisor, Key Laboratory of Ministry of Education of the People’s Republic of China, School of Orthopaedics and Traumatology of TCM, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
About author:Wu Yang-peng, Studying for master’s degree, Key Laboratory of Ministry of Education of the People’s Republic of China, School of Orthopaedics and Traumatology of TCM, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81273775; the Millions Talents Engineering of Fujian Province, No. 2014[4]

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脊髓损伤：是是指外力直接或间接作用于脊髓，引起脊髓功能性或器质性损害，以及继发一系列病理改变进一步加重脊髓损伤，从而出现不可逆性的损伤平面以下感觉、运动、括约肌功能障碍、肌张力异常及病理反射。
脊髓损伤模型：建立与人类发病相近的动物模型，探其发病机制，寻找有效的治疗药物逐渐引起重视。文章选用成年雌性SD大鼠，用撞击损伤模型方法进行造模，方法容易重复，通过自制打击器改良Allen’s法成功建立脊髓撞击损伤模型。

摘要
背景：目前国内外脊髓损伤模型的设计种类繁多，各有其优缺点，但尚未有一种客观化、标准化的模型以满足临床研究。
目的：设计一种简易打击器并建立脊髓损伤模型，通过与NYU(New York University)打击器建立的脊髓损伤模型进行对比，评估自制改良Allen’s 脊髓损伤模型的参数及稳定性。
方法：雌性SD大鼠随机分为5组，即假手术组(A组6只)，自制打击器5，10 cm组(B1，B2组)，NYU打击器1.25，2.5 cm组(C1，C2组)，A组不打击，其余各组根据分组的不同高度进行打击，每组6只；各组分别与造模术后1，3，5，7 d进行行为学评分，冰冻切片后用尼氏染色法观察病理学改变，并进行半定量分析。
结果与结论：①在行为学评分、脊髓损伤面积比和脊髓前、后角神经元半定量分析中，同一时间点，其他4组与A组比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，B1组和C1组、B2组和C2组差异无显著性意义 (P > 0.05)，B1组和B2组、C1组和C2组差异均有显著性意义(P < 0.05)；②病理学改变：A组见脊髓灰、白质分界清晰，呈蝴蝶状，神经元细胞核大、核仁明显、数量较多，胞质内斑块状或虎斑样尼氏体清晰；余各组出现不同程度的淤血灶，神经元数目减少，损伤处可见细胞肿胀，轴突脱髓鞘改变，部分细胞呈空泡样改变，尼氏体模糊或消失；③结果证实，自制打击器能制备出不同损伤程度的脊髓损伤模型，与NYU脊髓损伤模型效果相近，可靠性高，稳定性好，且操作简单，易于推广，可为大鼠脊髓损伤的研究提供基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0002-6554-0329(张俐)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 脊髓损伤, 动物模型, 改良Allen’s法, 感觉评分, BBB评分, 尼氏染色, 冰冻切片, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There are a variety of methods for modeling spinal cord injury at home and abroad, showing their own advantages and disadvantages, but not yet a kind of objective and standardized model meeting the clinical research.
OBJECTIVE: To design a simple impactor used for establishing the spinal cord injury model, then to evaluate the parameters and stability of the Allen’s spinal cord injury model through comparing with the New York University (NYU) impactor established model.
METHODS: Female rats were equivalently allotted into five groups: sham-operation group (group A), self-made impactor 5 and 10 cm groups (group B1 and B2) and NYU 1.25 and 2.5 cm groups (group C1 and C2). All groups except group A were subjected to striking at different heights. Behavioral scores were detected at 1, 3, 5 and 7 days after modeling. Nissl staining was used to observe the morphological changes after freezing section and semiquantitative analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) At the same time point, the behavioral scores, damaged area ratio of spinal cord and semiquantitative analysis of dorsal horn neurons showed significant differences in the group A compared with the other groups, also between groups B1 and B2, and groups C1 and C2 (P < 0.05), but no significant differences were found between groups B1 and C1, as well as groups B2 and C2 (P > 0.05). (2) In the group A, there was a clear boundary between the grey and white matter in a butterfly shape, numerous neurons with large nucleus and obvious nucleolus, and plaques or tabby of Nissl body appeared in the cytoplasm. In contrast, in the other four groups, there were few neurons, different degrees of Gore focal, swelling, demyelinating, and vacuole of cellula could be found, and Nissl body was fuzzy or disappeared. These results administrate that the self-made impactor can establish different damage degrees of spinal cord inury models, which are close to the NYU-made models. Moreover, it can be helpful for study on spinal cord injury for reasons of good stability, low cost, and operated easily.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Spinal Cord Injury, Animal Models, Neurobehavioral Manifestations, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

吴杨鹏，范筱，张俐. 急性脊髓损伤动物模型的建立与评估[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(49): 7341-7348.

Wu Yang-peng, Fan Xiao, Zhang Li. Establishment and evaluation of the animal model of acute spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(49): 7341-7348.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析选用30只雌性SD大鼠，随机分为5组，在实验过程中，由于麻醉剂量过大和术后感染导致2只大鼠死亡，死亡后立即选2只体质量接近的大鼠按原来造模方法造模后补上。

2.2 模型稳定性脊髓损伤模型研究众多，包括脊髓撞击损伤模型、脊髓缺血损伤模型、脊髓压迫损伤模型等等，然而临床中由于车祸撞击或地震等重物撞击脊柱造成的脊髓损伤更为多见，故经典的Allen’s重物坠落法建立的脊髓损伤模型，其临床相似性高。而本实验基于经典Allen’s法的基本原理进行改良，模型更接近临床，并与稳定性高的NYU打击模型进行比较，来证实本实验模型的稳定性，结果可靠，可控制好，操作简便，易于复制。

2.3 两种打击器制备的脊髓损伤模型脊髓外观形态造模时，正常脊髓节段呈乳白色透亮条索状，后正中沟明显，且伴有血管走行，打击后，硬脊膜完整，硬脊膜下出现不同程度水肿、淤血(见图2a)；脊髓损伤术后1周，损伤局部组织间有不同程度的粘连，不同打击器及不同打击高度损伤后，受损脊髓段出现不同程度的淤血，但硬脊膜均保持完整，B2、C2组淤血明显(见图2b)。

2.4 急性脊髓损伤动物模型的评估

2.4.1 术后常见症状 ①死亡：A组1只，因麻醉剂量过大，麻醉后死亡，又随机抽取1只体质量相近的正常雌鼠补上；B2组1只，术后见双下肢浮肿、血尿明显，并有自噬足指、眼睛红色变淡、体质量明显减轻等表现，于术后5 d出现死亡，可能与术后泌尿系统感染、贫血有关；②无尿便：B2、C2组损伤较重，大部分术后3 d均无尿便，需行人工按摩促排便；③血尿：A组及大部分B1、C1轻度损伤的大鼠均无血尿，而B2、C2组损伤较重者，部分出现不同程度的血尿，经抗生素治疗及加强术后护理后，基本恢复；④伤口渗血：C2组出现一只伤口少量渗血，经碘伏消毒纱布包扎后，第2天未见渗血。

2.4.2 行为学评分

BBB评分：A组术后1 d，部分大鼠运动功能未完全恢复，术后3 d全部恢复到21分；余各组均出现不同程度的运动功能障碍，其中B2、C2组术后1 d，大鼠后肢几乎全瘫，术后3-7 d均出现不同程度的功能恢复(见图3a)，B1和C1、B2和C2同一时间点BBB评分比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，余各组组间BBB评分比较，差异有显著性意义(P < 0.05)(见表1)，说明同一打击器，随着打击高度的增加，相应BBB评分则降低。

感觉评分：A组术后1 d，全部感觉功能正常；余各组均出现不同程度的感觉功能障碍，其中B2、C2组术后1 d肌力、肌张力、牵张发射消失，部分大鼠可见背部感觉部分存在，疼痛回收迟钝，而B1、C1组术后1d肌力消失，肌张力、牵张反射、疼痛回缩反射、背部感觉存在，术后3-7 d均出现不同程度的功能恢复(见图3b)，B1和C1、B2和C2同一时间点感觉评分比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，余各组组间感觉评分比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.4.3 组织学观察尼氏染色后，A组见脊髓灰、白质分界清晰，呈蝴蝶状，神经元细胞核大、核仁明显、数量较多，神经细胞质内有明显的斑块状或虎斑样尼氏体；余各组在灰质中央或两侧均有不同程度的淤血灶，组织破坏明显(见图4a)。损伤处可见灰质神经元肿胀，细胞间质水肿，轴突有脱髓鞘改变，部分细胞呈空泡样改变，神经元数目明显减少，尼氏体模糊或消失(见图4b)。

2.4.4 不同方法打击后脊髓受损面积比用Motic Med 6.0显微图像分析系统，选则手动分析法测得损伤处像素数与脊髓横截面总像素数，从而计算出受损面积比。A组未见明显受损区，比值为0；B1和B2、C1和C2组随打击的高度的增加而升高，组间差异有显著性意义(P < 0.05)，B1和C1、B2和C2损伤面积比差异无显著性意义(P > 0.05)，见表3。CV-B1=0.141，CV-B2=0.113， CV-C1=0.184，CV-C2=0.093，证明两种打击器每次打击的结果差异较小，稳定性较好。

2.4.5 不同方法打击后脊髓前、后角神经元计数用Motic Med 6.0显微图像分析系统，运用免疫组化图像分析法对前、后角神经元阳性目标进行半定量分析；A组前、后角神经元数目最多，尼氏体明显；B1和B2、C1和C2组随打击的高度的增加而减少，组间差异有显著性意义 (P < 0.05)，B1和C1、B2和C2损伤后前、后角神经元及尼氏体半定量分析差异无显著性意义(P > 0.05)，见表4。

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引言

材料方法

1.1 实验材料随机对照动物实验，于2015年10月至2016年1月在福建中医药大学实验室完成。

自制打击器：该打击器主要适用于制备大鼠脊髓撞击损伤模型，参考国内外学者自制打击模型的设计原理，并进行简化、改良，设备由底座、支架、持管夹、小垫片、1 mL针筒套管、撞针、切口撑开器组成。

NYU打击器：型号：Impactor M-Ⅲ(Spinal Cord Contusion System)，Serial No.Cs099。

实验试剂：尼氏染色液(焦油紫法)：试剂A：Cresyl violet Stain，试剂B：Nissl Differentiation，由上海源叶生物科技有限公司提供。

1.2 实验动物随机选取成年雌性SD大鼠30只，体质量200-220 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。

1.3 造模方法

1.3.1 简易打击器的设计撞针为直径约2.5 mm、质量7 g的钢制克氏针，1 mm针筒套管内径为约3.2 mm，用于导引撞针精确打击脊髓，套管外粘贴医用胶布并标记刻度，垫片为1 mm厚的塑料片，用于贴附在暴露的脊髓表面，使撞针打击处受力均匀，防止撞击或移动套管时使硬脊膜破裂。使用前在重物垂直参照下，调整装置，使套管垂直地面，并移到贴附有小垫片的目标脊髓上方约2 mm处，通过调控撞击针的打击高度，从而制备出不同程度的脊髓损伤模型，撞击后，钢针停留5 s(见图1a)。对照NYU打击器(见图1b)。

1.3.2 动物分组取SD雌性大鼠30只，根据不同打击高度，按随机数字表法分为5组，首先对30只雌鼠进行称重，编号1-30，再通过SPSS随机数生成法对1-30号随机分为5组，然后将对应编号的老鼠放到相应组别中，即假手术组(A组)，实验组B1(5 cm)组、B2(10 cm)组，NYU组C1(1.25 cm)组、C2(2.5 cm)组，每组6只。

1.3.3 脊髓撞击损伤模型建立先用7%水合氯醛 (500 mg/kg)腹腔麻醉后，用硫化钠脱毛，并在T₁₃肋骨与脊柱中线做一“倒置T”标记，常规消毒后，于标记处做一2.0-3.0 cm纵行切口，依次切开皮肤、皮下筋膜,暴露手术区肌肉，肉眼观察，可见椎旁肌表面银白色腱膜，两侧腱膜在后正中线最接近处，约平对T₁₃棘突，用血管钳钝性剥离肌肉暴露棘突、椎板和横突。一侧用眼科剪紧贴棘突剪断与其相连的肌肉、肌腱，制造一切口，长度以T₉-T₁₁，深度达关节突为止。为减少出血，采用以小幅度撕扯为主，剪离为辅的方法进行操作。将附于椎管侧壁以及关节突关节的肌、肌键等软组织清理干净，清晰暴露关节突关节、椎间孔以及椎管侧壁，同时显露T₉-T₁₁ 3个棘突及其椎板，其中可见T₉棘突倾向尾侧，T₁₀棘突中立位，T₁₁棘突倾向头侧，3个胸椎的棘突簇在一起，这一特征作为解剖定位的标志。依次切断棘上韧带，棘间韧带，小咬骨钳咬除T₁₀棘突，用齿镊轻提起T₉横突，在T₁₁两侧横突处剪开两个小口，并往下剪断T₁₀椎弓根，再用小咬骨钳剪开缺口处的椎板，由下往上时扩窗时，可用神经剥离子拨开脊髓，再用小咬骨钳咬除双侧T₁₀椎板，充分暴露目标脊髓段T₁₀，将1 mm后的小垫片贴附在硬脊膜上。A组不打击，B1、B2组用自制打击器、C1、C2组用NYU打击器打击T₁₀段脊髓，根据分组的不同高度进行打击，打击后钢针停留5 s。造模成功后分层缝合，关闭创口，术后将大鼠放在SPF环境中单笼饲养，人工按摩帮助大鼠尿便，3次/d，直到排尿反射恢复，术后运用青霉素4×10⁴ U/(只•d)，红霉素软膏0.2 g涂擦伤口，连用3 d，抗感染，术后必要时于腹腔注射生理盐水5 mL以补充体液丢失，最大限度避免大鼠术后死亡。

1.3.4 造模成功的检测标准脊髓撞击模型成功表现为大鼠全身迅速回缩样抖动，局部脊髓表面迅速水肿、淤血，硬脊膜保持完整。

1.4 行为学观察采用BBB评分法^[27]、感觉功能Reuter评分法^[28]，评分时采用双人、双盲法，分别于术后1，3，5，7 d同一时间点进行，评分者为熟悉评分标准的非实验人员，双人独立观察记录，取均值^[29]。

BBB评分满分为21分，可分为3个部分：①评价大鼠下肢各关节活动(0-7分)；②评价大鼠下肢步态及协调功能(8-13分)；③评价大鼠下肢运动中爪的精细动作(14-21分)。

感觉功能Reuter评分法包括牵张反射、疼痛回缩反射、沿背部感觉、肌张力、肌力5个方面进行评分。

1.5 组织学观察每组于术后7 d行为学评分后处死，立即进行心脏灌注取材：用7%水合氯醛5 mL/kg腹腔麻醉后，用60 mL带有针头的针筒经左心室插入主动脉，切开右心耳后快速注入生理盐水约240 mL，待右心耳流出澄清亮的液体，四肢及头面部变白后，换用4 ℃的 40 g/L多聚甲醛缓冲液，快速灌注约60 mL后，见四肢剧烈抽搐，再继续缓慢注入180 mL后见头部、躯干及四肢坚硬则表示成功。灌注结束后自背部原切口进入，钝性分离，显露脊髓后切取损伤处为中心长约2 cm损伤段脊髓，放入4 ℃的40 g/L多聚甲醛缓冲液24 h后，经浓

度为20%，30%蔗糖各脱水24 h后，常规冰冻切片厚度10 μm后，行尼氏焦油紫染色，观察脊髓受损情况。

1.6 图像处理和大鼠脊髓最大受损面积比、受损脊髓前后角神经元计数每组于术后7 d行为学评分后处死，立即进行心脏灌注取材，切片、染色后用Leica Motic Med 6.0光镜图像采集分析系统拍照后存盘，分析对比图片，用Motic Med 6.0 显微图像分析系统，采用手动分析法测得损伤处象素数与脊髓横截面总象素数，从而计算出受损面积比^[30-31]；运用免疫组化图像分析法对前后角尼氏体着色呈蓝色斑点状的神经元(即阳性目标)进行半定量分析^[32-33]。

1.7 主要观察指标各组术后1，3，5，7 d应用BBB评分法和感觉功能Reuter评分法进行行为学评分；术后7 d取材后，用尼氏染色法观察脊髓及神经元组织学改变，并进行半定量分析(不同方法打击后脊髓受损面积比及神经元计数)。

1.8 统计学分析应用SPSS 20.0软件进行数据分析，术后行为学评分、脊髓最大受损面积比和脊髓前后角神经元计数，根据数据资料的特征，采用完全随机设计的单因素方差分析，组间进行两两比较。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

脊髓损伤模型的建立是脊髓损伤临床和基础研究的前提，目前，国内外脊髓损伤动物模型种类繁多，各有其优缺点，但尚未有一种标准化、可靠性高、重复性好、操作简单的脊髓损伤模型，而且动物个体间存在差异性，以至于无法实行某种客观化、标准化损伤模型。理想的脊髓损伤模型应当满足以下几个条件，即临床相似性高、可调控性好、实际操作简单、重复性好，易于复制和推广。Allen’s重物坠落法所建立的脊髓损伤模型，因其临床相似性高，可控性好，易于复制而被国内外学者认可及广泛运用，但其打击瞬间脊髓容易偏移导致脊髓受力不均，硬脊膜容易破损，未能较好定量分析，同时椎板摘除时，容易损伤脊髓血管、神经；而NYU打击模型是目前基于经典Allen’s原理进行改良最好的相对标准化的脊髓损伤模型，但因价格昂贵，未能广泛普及，且该系统相对复杂，在实际操作中，对不熟练的操作者，亦颇有难度。

本实验亦基于经典Allen’s原理，撞击损伤模型更接近于临床，并改良了Allen’s法打击不准及硬脊膜破裂等不足，并通过与相对标准化的NYU打击模型造模效果进行对比，验证其稳定性及可靠性，显然这种方法是规范的；在模型建立过程中，本实验对Allen’s法进行以下几点改良：①麻醉：术前麻醉过量容易使大鼠死亡，故按体质量换算的麻醉剂量应先给2/3，必要时再适当补注，安全性较高；②椎板摘除术：摘除椎板时，可用小神经剥离子挡开暴露的脊髓，再用小咬骨钳进行充分暴露，防止因操作造成的损伤脊髓；③小垫片：打击前先用一小垫片贴附于暴露的脊髓表面，使撞针打击处受力均匀，防止撞击或移动套管时使硬脊膜破裂；④精确打击：撞击针与引导的针筒套内径相近，能够实现精确打击，同时针管外标有刻度，可制备出不同损伤程度的脊髓损伤模型；⑤时间控制：打击后停留5 s中，可模拟临床脊柱骨折存在的持续性挤压作用，而且5 s损伤程度适中，病理改变与临床相似^[34]，又能保证造模打击时间的一致性；⑥暴露与固定：基于NYU固定装置及对暴露脊髓周围软组织的挡开装置原理，本实验改良的Allen’s法，采用切口撑开器使目标脊髓暴露更加清楚，避免周围组织的遮挡作用，同时在打击前让助手双手固定住脊髓损伤节段，可保证脊髓不会因动物呼吸运动及打击瞬间抖动而导致打击偏移，进一步提高模型的稳定性。

为进一步提高实验的稳定性，本实验建立脊髓损伤模型选用体质量相近的雌性大鼠，原因有二，一方面雌性大鼠脊椎骨硬度相对较小，容易行椎板摘除术，可防止因操作使脊髓受到额外损伤；另一方面体质量相近的雌鼠能保证脊髓横截面及灰质前后角大小的一致性，可减少半定量分析所导致的误差；此外，国内自制脊髓损伤模型的打击冲量多在20-100之间^[30^，^35]，且本课题组前期预实验发现，自制打击器在5 cm和10 cm打击高度时，术后1 d大鼠出现轻度和重度运动功能障碍，用NYU打击器在1.25 cm和2.50 cm打击高度时，术后1 d大鼠亦出现轻度和重度运动功能障碍，故本实验进行对照试验进一步研究其相关性，并通过与相对标准化的NYU打击模型造模效果进行比较，从而来证实本实验造模方法的稳定性和可靠性。

结果显示，脊髓损伤后各组均出现不同程度的感觉、运动功能障碍，B1、C1组损伤较轻，且其评分结果较为接近，B2、C2组损伤较重，二者评分结果亦比较接近，损伤越重，感觉及运动功能障碍越明显；在形态学上，尼氏体是神经细胞特征性结构^[36]，当神经元受到损伤时，神经胞体内的尼氏体就会明显减少。尼氏焦油紫法染色，能够很好地显示尼氏体的变化，染色稳定，操作简便，能较好地反映神经元变化特点，并可对神经元进行半定量分析^[31-32]，故尼氏染色结果显示，A组前、后角神经元数目最多，尼氏体明显；B1和B2、C1和C2组随打击的高度的增加而减少，尼氏体模糊或消失；B1和C1、B2和C2损伤后前、后角神经元计数差异无显著性意义，脊髓损伤后神经元数目的减少，可能是原发性和继发性损伤后，细胞坏死和凋亡的结果^[37-41]；在脊髓损伤面积比计算中发现，损伤程度与该比值呈正比。行为学评分、尼氏染色形态学观察、神经元半定量计数分析以及脊髓损伤面积比4个方面的结果均显示该模型的稳定性较好，有利于模拟临床脊髓撞击损伤模型的研究或基础研究。

目前，国内外脊髓损伤动物模型种类繁多，然而脊髓撞击损伤模型更接近人类疾病的模式。因此，本实验设计的改良Allen’s打击模型可制备出不同损伤程度的脊髓损伤模型，临床相似性高，稳定性较好，操作简单，易于复制，且价格低廉，可为脊髓损伤机制研究及药物治疗提供稳定的动物模型。

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急性脊髓损伤动物模型的建立与评估

Establishment and evaluation of the animal model of acute spinal cord injury

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