四氯化碳加乙醇复合法诱导肝硬化大鼠模型的建立及验证

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0813

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (20): 3224-3229.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0813

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四氯化碳加乙醇复合法诱导肝硬化大鼠模型的建立及验证

宾文婷1，常加松1，吴剑平2

南京中医药大学，1人体解剖与组织胚胎学系，2实验动物中心，江苏省南京市 210023

收稿日期:2017-07-19 出版日期:2018-07-18 发布日期:2018-07-18
通讯作者: 常加松，硕士，副教授，南京中医药大学，江苏省南京市 210023
作者简介:宾文婷，女，1981年生，广西壮族自治区人，汉族，博士，讲师，主要从事肝病基础研究。
基金资助:
江苏省高校自然科学研究计划资助项目(13KJD310001)

A rat model of liver cirrhosis induced by the combination of carbon terachloride and ethanol: establishment and verification

Bin Wen-ting1, Chang Jia-song1, Wu Jian-ping2

1Department of Human Anatomy and Histoembryology, 2Laboratory Animal Center, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China

Received:2017-07-19 Online:2018-07-18 Published:2018-07-18
Contact: Chang Jia-song, Master, Associate professor, Department of Human Anatomy and Histoembryology, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China
About author:Bin Wen-ting, M.D., Lecturer, Department of Human Anatomy and Histoembryology, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Universities in Jiangsu Province, No. 13KJD310001

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肝硬化：是由于一种或多种病因长期或反复作用于肝脏，通过炎症途径诱导肝细胞大量坏死、再生，细胞外基质过度沉积，最终导致纤维间隔形成和假小叶形成，门静脉高压和肝功能降低的终末期肝病，其中一部分会进展成为肝癌。
四氯化碳加乙醇复合法：是实验诱导慢性肝损伤乃至肝硬化的较为常见的一种复合因素方法。四氯化碳是诱导肝硬化的使用最为广泛的毒素之一，而乙醇又是人类酒精性肝硬化的重要致病因素，这两种因素联合在一起的复合方法既可以加速四氯化碳致肝硬化的进程，又可以模拟人类酒精性肝硬化模型，是一种制备肝硬化动物模型的有效方法。

摘要
背景：建立稳定、可靠、易操作又高效的肝硬化动物模型是进行肝硬化防治研究的前提条件。
目的：探寻一种理想的CCl4诱导大鼠肝硬化模型的造模方法。
方法：将Wistar大鼠随机分为正常对照组(n=8)、模型A组(n=21)及模型B组(n=21)，正常对照组左右腹部皮下交替注射橄榄油，每4 d一次；模型A组用传统型方法，左右腹部皮下交替注射3 mL/kg 50%CCl4橄榄油溶液，每4 d一次，以10%乙醇溶液(以二锅头白酒、蒸馏水配制)为其惟一饮用水；模型B组用改良的CCl4加乙醇复合法诱导大鼠肝硬化模型，左右腹部皮下交替注射50% CCl4橄榄油溶液，最初4次及最末3次剂量为5 mL/kg，其余为3 mL/kg，每4 d一次，以乙醇溶液(以二锅头白酒、蒸馏水配制)为其惟一饮用水，乙醇浓度从5%逐渐过渡为10%。造模时间9周。
结果与结论：与正常对照组相比，模型A、B组大鼠体质量增加缓慢，与模型A组相比，模型B组体质量波动较小。模型A、B两组丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶均明显高于正常对照组，模型B组丙氨酸氨基转移酶水平高于模型A组，而模型A、B两组天门冬氨酸氨基转移酶水平差异无显著性意义。模型B组与正常对照组存活率差异无显著性意义，且模型B组比模型A组假小叶形成率高。提示用改良的CCl4加乙醇复合法造模的大鼠肝硬化模型死亡率低且成模率高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-7979-6683(宾文婷)

关键词: 肝硬化, 四氯化碳, 乙醇, 模型, 实验动物, 大鼠, 肝脏

Abstract:

BACKGROUND: Establishing a stable, reliable, easily handling and highly efficient animal model of liver cirrhosis is the prerequisite for the study on the prevention and treatment of the disease.
OBJECTIVE: To establish and evaluate an ideal means to induce liver cirrhosis in rats by carbon tetrachloride (CCl4).
METHODS: Wistar rats were randomly allotted into control group (n=8), group A (n=21) and group B (n=21). Olive oil was injected subcutaneously into both sides of the abdomen of control rats every 4 days; in the group A, 50% CCl4 in olive oil was injected subcutaneously into the abdomen with a dosage of 3 mL/kg every 4 days, and a 10% ethanol solution (Erguotou liquor and distilled water) constituted the only liquid drank; in the group B, 50% CCl4 in olive oil was injected subcutaneously into the abdomen every four days, the first four and final three doses were 5 mL/kg, and the other doses were 3 mL/kg, and a gradually transition from 5% to 10% ethanol solution (Erguotou liquor and distilled water), constituted the only liquid drank. The modeling time was 9 weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: There was a slower increase in the rat body mass in the groups A and B compared with the control group, especially in the group B. The serum levels of alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase in the groups A and B were significantly higher than those in the control group. The level of alanine aminotransferase in the group B was significantly higher than that in the group A, but there was no significant difference in the aspartate aminotransferase level between the groups A and B. The cirrhosis with pseudolobules rate and success rate in the group B were higher than those in the group A. There was no significant difference in survival rate between group B and control group. That is to say, the improved method of inducing cirrhotic model in rats by CCl4 combined with ethanol shows a high rate of success and a low rate of mortality.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Liver, Liver Cirrhosis, Carbon Tetrachloride, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

宾文婷，常加松，吴剑平. 四氯化碳加乙醇复合法诱导肝硬化大鼠模型的建立及验证[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(20): 3224-3229.

Bin Wen-ting1, Chang Jia-song1, Wu Jian-ping2. A rat model of liver cirrhosis induced by the combination of carbon terachloride and ethanol: establishment and verification[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(20): 3224-3229.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析整个实验过程中，正常对照组大鼠无死亡，模型A组大鼠死亡8只，模型B组死亡4只，见表1。实验过程中如有大鼠死亡，不加以补充。
2.2 大体情况 ①正常对照组大鼠毛色白而有光泽，触之手感顺滑，饮食、活动皆正常；②模型A组大鼠厌酒，饮用少，部分大鼠拒饮(8只)，3 d后2只大鼠死亡。遂用10%乙醇的白酒对拒饮大鼠进行灌胃，每次3 mL，5次/d。造模 2周部分大鼠体质量下降极为明显。整个造模期间大鼠毛色晦暗，粗糙，不顺滑，毛发脱落，眼睛无神，活动少。造模过程中大鼠陆续死亡，前4周已有5只大鼠死亡。造模结束后，仅存活13只大鼠；③模型B组大鼠无拒饮少饮，造模1周后，开始出现精神不振，活动减少；造模2周后，大鼠精神萎糜，活动少，易抓取，被毛蓬松，抓咬腹部，腹部毛脱落；造模4周死亡1只，以后陆续有死亡。整个造模过程中，大鼠毛色暗淡，倦卧少动、消瘦、体质量增长慢，少数大鼠腹部毛大片脱落。造模结束后的21只大鼠中死亡4只。

2.3 体质量各组0 d初始体质量接近(P > 0.05)，正常对照组大鼠体质量持续稳定增长，前期增重较快，后期增重较前期变缓。模型A组造模初期大鼠体质量下降极为明显，12 d平均体质量降至最低，跟造模第0天相比下降了约20 g，其中甚至有单个大鼠降低至109 g，之后体质量呈上升趋势，期间偶有下降，直到造模60 d平均体质量为(254.54± 14.56)g。模型B组造模初期大鼠体质量也有所下降，相对于模型A组下降较少，8 d平均体质量为(191.48±11.19)g，跟造模第0天相比仅下降了约7.7 g，之后体质量上升比较平稳，造模56 d平均体质量为最高值。模型A、B组体质量从4 d开始一直到60 d与正常对照组相比，差异均有显著性意义(P < 0.01；图1)。

2.4 存活率正常对照组大鼠整个实验期间无死亡，存活率为100%。模型A组整个造模过程中死亡8只，存活率为62%，其中前4周死亡5只。模型B组整个造模过程中死亡4只，存活率为81%，其中前4周死亡1只(表1)。正常对照组与模型A组存活情况构成比差异有显著性意义(P=0.033， P。 < 0.05)

2.5 组织病理学变化苏木精-伊红染色结果显示，正常对照组，肝细胞条索状围绕中央静脉呈放射状排列，肝小叶结构正常，小叶间未见纤维组织增生，无炎性细胞浸润(图2A)。模型B组，肝细胞肿胀，部分肝细胞脂肪样变呈空泡状，少数肝细胞坏死，核固缩或溶解；肝索排列紊乱，失去正常肝小叶结构，间质明显灶性淋巴细胞浸润，大量纤维组织增生包绕肝细胞团形成假小叶结构(图2 B)，为典型的肝硬化镜下病理学改变，表明肝硬化造模成功。模型A组大部分有假小叶形成(图2C)。

模型A、B两组假小叶形成情况，假小叶形成率以及成模率见表2。模型A组及模型B组的存活大鼠假小叶形成情况、总假小叶形成情况(х²=7.467)及成模情况(х²=6.462)差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01；表2)。

2.6 血清生化学指标模型A、B组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶及天门冬氨酸氨基转移酶水平均远高于正常对照组，且模型B组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶水平高于模型A组(P < 0.01；表3)。

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引言

肝硬化是临床上一种难以治疗的慢性进行性肝病，严重影响患者的生存质量，死亡率也高，全球范围内因肝硬化而死亡的人数已呈上升趋势^[1]，因此，攻克肝硬化这道难关势在必行。而建立稳定、快速、高效、易操作又经济的肝硬化动物模型是进行肝硬化基础研究及药物实验防治研究的前提条件。

肝硬化模型一般分为两大类：一类是单因素模型，另一类是多因素模型。单因素模型包括四氯化碳(CCl₄)诱导肝硬化模型、酒精诱导肝硬化模型、血吸虫性肝硬化模型、同种或异种血清诱导肝硬化模型、致癌物二甲基亚硝胺诱导肝硬化模型、硫代乙酰胺诱导肝硬化模型及胆汁性肝硬化模型等^[2-13]，其优点是容易操作，方法简便，针对性强，对制造出特定病因模型的肝硬化病因学研究，探寻某个因素导致肝硬化的机制研究适用于此方法，其缺点多为耗时长，死亡率高^[14]。其中CCl₄所致大鼠肝硬化，因其可操作性强，可重复性高，病理特征明显，又经济实用，目前在科学研究中是使用最为普遍的经典造模方法^[15-19]，但其造模周期长、动物死亡率高，造模成功率低。

多因素模型多以CCl₄为主要因素辅以苯巴比妥或乙醇或高脂低蛋白食物(玉米面为饲料，加胆固醇，猪油)等造模^[20-25]。其中CCl₄加乙醇复合法可以加速CCl₄致肝硬化的进程^[26]，既弥补了单因素法的缺憾，又可以模拟人类酒精性肝硬化，且费用低廉。目前，在此法诱导肝硬化模型的研究中，尚缺乏对实验动物较详尽的体质量等基本指标的报道，且在药物剂量、给药途径、给药间隔时间、乙醇来源(医用或食用)等方面也不尽统一，这些因素都有可能影响造模效果，而对比各种造模方法和评价造模效果的研究也较少。因此实验参考既往研究^[26-29]，在传统的CCl₄加乙醇诱导大鼠肝硬化方法的基础上进行适当改进，并对此改良的方法进行评价和对比分析，从中探寻一种理想的CCl₄诱导肝硬化模型的方法，以期为肝硬化的深入研究提供实验基础。

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材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2014年3至12月在南京中医药大学基础医学院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：性成熟雌性清洁级Wistar大鼠50只，鼠龄6至7周，体质量183-210 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物许可证号SCXK(沪)2012-0002。

实验用主要试剂及仪器：CCl₄(分析纯)购自南京南试化学试剂有限公司，阿格利司特级初榨纯橄榄油购自法克拉利司兄弟公司，牛栏山二锅头白酒(纯度56%)购自北京顺鑫农业股份有限公司，丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶试剂盒购自北京华英生物技术研究所；光镜购自德国Leica公司。

1.4 方法

1.4.1 实验动物分组及处理将大鼠随机分为模型A组(n=21)、模型B组(n=21)及正常对照组(n=8)。正常对照组给予正常饮食，左右腹部皮下交替注射3 mL/kg橄榄油，每4 d一次，共16次。模型A组：左右腹部皮下交替注射3 mL/kg 50%CCl₄橄榄油溶液(首剂5 mL/kg)，每4 d一次，共16次，以10%乙醇溶液(以二锅头白酒、蒸馏水配制)为其惟一饮用水，连续9周。模型B组：左右腹部皮下交替注射50% CCl₄橄榄油溶液，最初4次及最末3次剂量为5 mL/kg，其余8次为3 mL/kg，每4 d一次，共15次，于头4次注射CCl4后隔1周注射第5次；以乙醇溶液(以二锅头白酒、蒸馏水配制)为其惟一饮用水，第1，2周乙醇浓度为5%，第3，4周乙醇浓度为7.5%，第5-9周乙醇浓度为10%。各组均于造模9周结束后，5 mL/kg水合氯醛麻醉处死。

1.4.2 组织病理学检测各组肝脏常规石蜡包埋，制成4 μm厚的切片，行苏木精-伊红染色。光镜下观察，见到假小叶形成即可视为肝硬化造模成功^[25^，^30]。

1.4.3 血清学检测大鼠腹主动脉取血，比色法检测血清生化丙氨酸氨基转移酶及天门冬氨酸氨基转移酶^[31]。|
1.5 主要观察指标大鼠体质量、存活情况及肝硬化造模效果。1.6 统计学分析所有数据均采用SPSS 13.0(SPSS公司)分析。计量资料各组整体、组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用F 检验，方差不齐时采用Dunnett’s T3法。计数资料采用х²检验，如果有理论数T < 5，则用Fisher’s检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

肝硬化是由于一种或多种病因长期或反复作用于肝脏，通过炎症途径诱导肝细胞大量坏死、再生，细胞外基质过度沉积，最终导致纤维间隔形成和假小叶形成，门静脉高压和肝功能降低的终末期肝病^[30^，^32]。因此，使用某种毒素反复侵犯肝脏可以诱导实验动物肝硬化的形成。CCl₄是实验诱导肝损伤的使用最广泛的毒素之一。CCl₄通过改变血浆、溶酶体和线粒体膜的通透性直接损害肝细胞，经肝细胞微粒体细胞色素P450 2E1(CYP2E1)激活后，其代谢物即有毒的三氯甲基(CCl₃^-)基团，诱导脂质过氧化和细胞膜损伤，损害线粒体，使ATP在肝内生成减少，从而引起严重的肝小叶中心肝细胞坏死^[33]，随后触发肝脏修复愈合过程。肝脏损害-修复-损害，肝纤维化的发展逐步从中心周围的区域开始，接着发生严重的桥接纤维化，最终导致肝硬化或肝癌^[34]。其诱导的病变程度根据剂量，途径和给药间隔时间而变化。乙醇是人类酒精性肝硬化的重要致病因素^[35-36]。氧化应激在乙醇诱导的肝损伤中起着重要的作用^[37-38]。因此，CCl₄加乙醇可产生协同作用，联合应用可减少两者剂量以降低单一药物应用的不良反应，缩短造模时间，提高造模效率^[39-41]。传统的CCl₄复合法诱导大鼠肝硬化方法多采用40%-50%CCl₄，剂量3 mL/kg(首剂加量)联合10%乙醇诱导^[25-26^，^42-45]。有文献报道食用白酒比医用乙醇溶液更适于大鼠饮用^[46]，而且人的酒精性肝硬化也是因为长期饮用白酒导致，为了更接近于模拟人的酒精性肝硬化模型，实验以商品白酒代替医用乙醇。CCl₄给药途径比较常见的为腹腔注射和皮下注射^[47-50]，也有用灌胃法以及CCl₄蒸汽吸入法^[51-54]。蒸汽吸入法动物不耐受，中枢毒性大，易造成环境污染，危害实验人员健康；灌胃法动物肠道反应较大，不耐受，死亡率较高，肝纤维化程度不一致；腹腔注射的吸收速度较皮下注射快，CCl₄进入血液循环浓度高，易导致肝细胞严重损伤，发生急性肝衰竭而死亡，且会引起腹膜粘连、炎症，若注射部位把握不准会引起肠道或膀胱损伤，徒增动物的死亡率^[55-56]。而作者采用皮下注射的方法，吸收比较缓慢，不容易造成急性肝坏死，虽说易引起局部皮肤溃疡，但在整个实验过程中，左右腹部皮下交替注射，非同一部位反复注射，50只大鼠中仅有4只大鼠出现局部皮肤溃疡，溃疡率仅8%，亦未在造模过程中因为皮肤溃疡导致并发症而死亡。

实验在CCl₄剂量上有所改良，头4次末3次注射CCl₄剂量5 mL/kg，较3 mL/kg增加(造模初期跟后期均较传统方法多了3次高剂量)，亦不是一直使用5 mL/kg，目的是在尽量降低死亡率的基础上增加成模率，之所以选择末3次，也是一次积极的尝试，到了造模晚期，大鼠肝脏功能受损较初期严重，连续注射偏高剂量CCl₄的次数过多会增加死亡率；作者在CCl₄给药的间隔时间上也略有改动，于头4次注射CCl₄后隔1周注射第5次，而不是隔3 d注射，是考虑到第3，4周是急性肝坏死期^[29]，而头4次使用的CCl₄剂量也高，考虑到CCl₄的肝毒性，间隔时间略长，目的是减少大鼠死亡；实验在酒精浓度上亦有所改良，目的是为了让大鼠适应白酒。供大鼠饮用的白酒从5%的乙醇浓度开始逐渐适应。

实验结果也验证了改良的方法大鼠不易死亡。首先，模型A组实验开始阶段，大鼠抵触10%的乙醇白酒，饮用少，8只大鼠拒饮，拒饮率38.1%。又通过死亡情况比较，模型A组死亡多发生在前4周跟后3周，第1周死亡的2只因为拒饮脱水死亡，而后用10%乙醇的白酒对拒饮大鼠灌胃，每次3 mL，每日5次，虽避免了脱水死亡，但明显增加了工作量，且频繁灌胃操作也容易导致大鼠意外死亡；模型B组酒精浓度从5%(这个浓度无一大鼠有拒饮或饮用量减少现象)开始增加，大鼠对此浓度适应2周之后逐步增加2.5%的浓度(无拒饮现象)，直至跟传统方法一样的10%浓度，大鼠饮水情况在整个实验过程中保持正常，避免了因脱水而导致的无谓死亡。其次，从假小叶形成率上，模型B组不论是从存活大鼠假小叶形成率、总假小叶形成率以及成模率上，都高于模型A组，且差异有显著性意义。而且模型B组存活大鼠假小叶形成率是100%，造模达到典型肝硬化(有假小叶形成)与否是评价模型成败的关键，因此，实验结果提示改良的方法造模成功率高。再次，实验对各组大鼠体质量进行分析发现，与正常对照组相比，模型组大鼠体质量增加缓慢，且在整个造模初期均出现体质量下降的现象。其中模型A组早期体质量降低非常明显，12 d平均体质量跟造模第0天相比下降了约20 g，其中部分大鼠体质量急剧下降，最轻者降到109 g，比造模前体质量降低了44.10%。与模型A组相比，模型B组体质量波动较小，且造模初期下降及后期体质量上升幅度均较模型A组少。通过A、B两组对比，作者认为模型A组早期体质量的明显降低可能跟对10%乙醇白酒的不耐受导致的脱水以及CCl₄的毒性共同作用相关，而模型B组体质量在造模后期低于模型A组，可能跟CCl₄的用量有关，因为模型B组CCl₄的用量比模型A组多，CCl₄的用量与体质量呈负相关的关系。虽然模型B组体质量上升较缓，但是无明显大的波动，整个造模过程中体质量平稳，因此可以认为改良的方法CCl₄的剂量是合理适当的，没有造成急性肝损伤而体质量急剧减轻的现象发生。最后，从肝功能的检测结果可以发现，模型A、B组丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶均远高于对照组，说明了模型组均出现明显的肝细胞损害，模型B组虽然天门冬氨酸氨基转移酶与A组无明显差异，但丙氨酸氨基转移酶高于模型A组，因此模型B组在死亡率低的基础上表现出较模型A组更为明显的肝功能损害。

综上，作者改进后的CCl₄加乙醇复合法，在一定程度上克服了传统的CCl₄加乙醇复合法存在的一些弊端，成功、高效地建立了肝硬化模型，降低了大鼠死亡率，提高了成模率，且组织病理学形态结构与人类肝硬化病理特征相似，又具有造模周期短，实用经济，操作方便等优点，因此该方法是一种较为理想的肝硬化造模法，其对于人类肝硬化尤其是酒精性肝硬化的防治研究具有一定的实际价值。

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四氯化碳加乙醇复合法诱导肝硬化大鼠模型的建立及验证

A rat model of liver cirrhosis induced by the combination of carbon terachloride and ethanol: establishment and verification

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