慢性脑低灌注致模型大鼠学习记忆受损及海马α-突触核蛋白变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0311

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (20): 3230-3236.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0311

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慢性脑低灌注致模型大鼠学习记忆受损及海马α-突触核蛋白变化

何婧1，黄燕1，杜果2，王志强2，向阳2，王庆松1，2

1西南医科大学临附属医院神经内科，四川省泸州市 646000；2解放军成都军区总医院神经内科，四川省成都市 610000

收稿日期:2018-04-24 出版日期:2018-07-18 发布日期:2018-07-18
通讯作者: 王庆松，西南医科大学附属医院神经内科，四川省泸州市 646000；成都军区总医院神经内科，四川省成都市 610000
作者简介:何婧，女，1991年生，汉族，四川省成都市人，2014年贵州医科大学大学毕业，在读硕士，主要从事脑血管病研究。
基金资助:
国家自然青年科学基金项目(81601112)；四川省卫计委科研课题(150002，16PJ014)

Cognitive impairment and hippocampal alpha-synuclein change in a rat model of chronic cerebral hypoperfusion

He Jing1, Huang Yan1, Du Guo2, Wang Zhi-qiang2, Xiang Yang2, Wang Qing-song1, 2

1Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Department of Neurology, Chengdu Military General Hospital, Chengdu 610000, Sichuan Province, China

Received:2018-04-24 Online:2018-07-18 Published:2018-07-18
Contact: Wang Qing-song, Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Department of Neurology, Chengdu Military General Hospital, Chengdu 610000, Sichuan Province, China
About author:He Jing, Master candidate, Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation for the Youth, No. 81601112; the Scientific Research Project of Health and Family Planning Commission of Sichuan Province, No. 150002 and 16PJ014

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
慢性脑低灌注：作为颅内外血管病变、异常血管形成、关键部位脑梗死、多发性脑梗死，以及腔梗性脑梗死或脑微梗死、脑微出血、脑白质病变和其他脑小血管病等各种脑血管病危险因素、脑血管病变、脑血管功能与血流动力学改变直接影响结果，可通过神经元损伤、突触功能受损、线粒体功能紊乱等机制损伤认知功能。
α-突触核蛋白：在生理状态下可进行突触间信息传递等作用，病理状态时可通过多种机制影响突触功能及介导神经元死亡，在帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性变疾病的发生发展中起重要作用。α-突触核蛋白可存在于线粒体内外膜上，正常情况下维持线粒体功能稳定，异常状态下造成线粒体功能紊乱。

摘要
背景：前期研究发现，慢性脑低灌注模型大鼠认知功能受损与海马区沉默突触增加有关，而α-突触核蛋白可介导线粒体功能紊乱、认知损伤。
目的：探讨慢性脑低灌注模型大鼠学习记忆能力改变及相关海马α-突触核蛋白变化特点。
方法：运用永久性双侧颈总动脉结扎术制备慢性脑低灌注大鼠模型(CCH组)，并设立不结扎颈总动脉的对照组，在造模后1，3个月，通过旷场及水迷宫实验检测模型大鼠认知功能；行为学实验后取材，运用Western blot法检测海马区线粒体α-突触核蛋白表达，使用免疫荧光法检测海马区α-突触核蛋白变化。
结果与结论：CCH组大鼠较对照组有更明显的旷场实验移动距离增加，水迷宫实验潜伏期延长(P < 0.05)；Western blot法发现CCH组大鼠海马线粒体α-突触核蛋白增多较对照组明显(P < 0.05)；免疫荧光法检测CCH组大鼠海马区α-突触核蛋白增多明显(P < 0.05)。结果提示慢性脑低灌注大鼠海马α-突触核蛋白增多，在慢性脑低灌注所致认知受损中可能有重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-7670-5977(何婧)

关键词: 慢性脑低灌注, 工作记忆, 线粒体, 海马, 大鼠, α突触核蛋白, 参考记忆, 旷场实验

Abstract:

BACKGROUND: Preliminary studies have shown that chronic cerebral hypoperfusion (CCH)-induced impairment of cognitive function in rats is associated with increased silent synapses in the hippocampus. Meanwhile, alpha-synuclein can lead to cognitive impairment and mitochondrial dysfunction.
OBJECTIVE: To observe the changes of cognitive function and hippocampal alpha-synuclein in rats with CCH.
METHODS: The rat model of CCH was prepared by permanent bilateral common carotid artery occlusion, and the rats without common carotid artery occlusion were used as controls. The cognitive function was detected by an open field and a Morris water maze at 1 and 3 months after modeling. Afterwards, the expression level of mitochondrial alpha-synuclein in the hippocampal region was detected by western blot assay. Changes of alpha-synuclein in the hippocampus were detected by immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: CCH group had more significantly decreased escape latency in Morris water maze test, and increasing distance traveled in the open filed test, compared with the control group (P< 0.05). Western blot assay results showed that the expression level of alpha-synuclein in the hippocampal mitochondrion of rats with CCH was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). Immunofluorescence results revealed that the level of alpha-synuclein was significantly increased in the CCH group compared with the control group (P < 0.05). Our results suggest that there is an increase in alpha-synuclein in the hippocampus of rats with CCH, which may be involved in the cognitive impairment following CCH.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Brain Ischemia, Hippocampus, alpha-synuclein, Mitochondria, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

何婧1，黄燕1，杜果2，王志强2，向阳2，王庆松1，2. 慢性脑低灌注致模型大鼠学习记忆受损及海马α-突触核蛋白变化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(20): 3230-3236.

He Jing1, Huang Yan1, Du Guo2, Wang Zhi-qiang2, Xiang Yang2, Wang Qing-song1, 2. Cognitive impairment and hippocampal alpha-synuclein change in a rat model of chronic cerebral hypoperfusion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(20): 3230-3236.

图/表（结果） 2

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引言

脑血管病危险因素及相关血管损害机制在血管性痴呆、阿尔茨海默病等认知障碍疾病中的作用越来越引起研究人员的关注。临床研究发现，轻度认知功能障碍患者较健康对照组有明显减低的脑灌注量^[1]；伴有慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)状态或中度/重度颅内动脉狭窄的个体常较健康对照组有不同程度的认知功能减退^[2-3]。动物研究也发现，大脑中动脉闭塞模型中认知功能损伤与tau蛋白磷酸化、淀粉样β蛋白1-42增多增加有关^[4]；TUNEL、BAX、BAXBCL-2细胞凋亡相关物质变化与CCH模型中大鼠认知功能障碍相关^[5]。作者前期对CCH的研究也发现，模型大鼠认知功能受损与海马区沉默突触增加有关^[6]。以上研究均表示血管因素可引起认知功能受损，作为多种脑血管病危险因素、脑血管病变、脑血管功能与血流动力学改变直接影响结果的CCH状态，可能是其重要的病理生理基础^[7-8]，因此，CCH越来越受到研究人员的重视。虽然对CCH致大鼠认知功能障碍具体机制有多种推测，但CCH改变作为一种病理生理状态，导致认知功能受损的影响因素多、机制复杂、涉及面广，病理生理学相关机制仍不确定^[8-10]。

其中，线粒体作为参与机体许多重要功能的关键细胞器，其功能结构受损在缺血相关认知障碍中的作用一直备受关注，许多研究对各种脑缺血模型所致认知受损与神经元线粒体损伤关联展开了较广泛探讨，揭示线粒体呼吸链复合体功能障碍、氧化应激、细胞凋亡与结构损伤是脑血管损伤相关的重要病理生理基础，在缺血性认知障碍中起重要作用^[11-15]。

多项研究揭示α-突触核蛋白增多及聚集与线粒体结构功能受损有明确关联^[16-17]，是许多针对线粒体研究的切入点。另外，研究发现α-突触核蛋白在不同年龄及不同类型脑缺血模型皮质或海马中均明显增多^[18-20]，并与缺血后认知障碍相关^[21]。因此，文章拟从α-突触核蛋白变化角度探讨CCH状态致认知障碍。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 2016年7月至2017年10月在成都军区总医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验用主要试剂和器材线粒体蛋白提取试剂盒(索莱宝)，批号：C3606，Western blot山羊抗兔二抗(Proteintech)，批号：SA00001-2，冰冻组织包埋剂，批号：4583，购于生工生物工程(成都)股份有限公司；α-突触核蛋白一抗(Cell Signaling Technology)，批号：2642、4179，购于上海优宁维生物技术股份有限公司；山羊抗兔Alexa Flour 488(Thermo Fisher)，购于英潍捷基(上海)贸易有限公司。

1.3.2 实验动物健康成年雄性SPF级SD大鼠32只，体质量280-320 g，10周龄，购自四川省成都市达硕动物公司，许可证：SCXK(川)2015-030，于通风良好的动物房内饲养，实验过程中动物自由获取水和食物，12 h明暗交替。实验过程符合动物伦理相关规定，并获得成都军区总医院伦理委员会批准。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及处理将32只大鼠随机分为CCH组(n=16)及对照组(n=16)，在前期研究的基础上制备大鼠永久性双侧颈总动脉结扎术动物模型^[6]。CCH组及对照组组内再随机分为1个月、3个月亚组。

1.4.2 动物模型建立参照文献报道方法构建CCH及手术对照模型^[22]。大鼠术前12 h禁食，4 h禁水。按40 mg/kg剂量对大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥钠溶液，麻醉后固定大鼠四肢于手术台并呈腹面朝上姿势，剪去大鼠颈部毛发后碘伏消毒。轻柔剪开大鼠颈部皮肤暴露皮下组织并用镊子钝性分离，操作中避免伤及甲状腺，沿胸锁乳突肌与气管间隙找到颈总动脉，轻柔操作避免损伤气管及血管，在找到颈总动脉后，使用镊子轻柔分离动脉鞘使颈总动脉暴露，避免伤及迷走神经与血管，以2根1号丝线穿过右侧颈总动脉上、下方并结扎后在中间离断，1周后以同样步骤结扎左侧颈总动脉。

对照组除不进行颈总动脉结扎外，其他处理与CCH组完全相同。

1.4.3 动物取材每个时间点CCH组、对照组各8只，其中4只用于Western blot检测，4只用于免疫荧光检测。1.5%戊巴比妥钠(90 mg/kg)大鼠腹腔注射深度麻醉后，迅速打开胸腔暴露心脏，由右心室迅速注入200 mL左右4 ℃预冷的生理盐水实施心脏灌注，用于Western blot检测的大鼠在完成心脏灌注后断头轻柔取出海马组织于液氮速冻后放于-80 ℃保存。用于免疫荧光的大鼠在肝脏变白后再注入200 mL左右4 ℃预冷的40 g/L多聚甲醛实施灌注固定，先迅速再缓慢灌注，直至尾巴与四肢僵硬后结束灌注。断头后轻柔取出脑组织，避免伤及脑组织表面，去除脑表面软脑膜。将脑组织放于40 g/L多聚甲醛中固定6-8 h后，再进行10%，20%，30%蔗糖梯度脱水，沉底后用OCT包埋，包埋好的组织进行组织切片(莱卡冰冻切片机，片厚30 μm)。

1.4.4 检测指标分别于造模后4，12周开始行为学实验，按旷场实验、水迷宫实验顺序依次进行。在安静环境下进行实验并在每天同一时间段内进行。

(1)旷场实验：参照文献报道方法^[6]，将实验大鼠放入实验箱底部同一位置，同时打开摄像系统并计时。观察 10 min后关闭摄像系统，取出动物。体积分数75%乙醇清洁实验箱底部及四周后，放入下一只动物，按相同步骤继续实验。观察大鼠在实验过程中移动距离，移动距离越大代表大鼠情绪越焦虑，代表缺血对其影响越大。

(2)水迷宫实验：在完成旷场实验后进行水迷宫检测。参照文献报道方法^[6]，水迷宫高100 cm，直径120 cm，池内水深25 cm，逃生平台直径10 cm。逃生平台距离水面约2 cm。水池各方向壁上贴有不同形状、色彩鲜明的图画作为暗示。将水池分为4个象限(SW，SE，NW，NE)。记录每只动物找到平台的时间(s)。如果找到逃生平台的时间超过60 s，则引导大鼠游泳至平台。大鼠在平台上站立10 s后将动物擦干放回笼内。每天训练每只动物4次，2次训练间隔5 min，连续训练4 d。每次记录大鼠游泳速度、逃离潜伏期、到达平台前游泳距离等。

(3)Western blot检测：将海马组织从-80 ℃冰箱中取出，按线粒体蛋白提取试剂盒说明书提取线粒体蛋白后采用二喹啉甲酸(BCA，索莱宝)试剂盒检测蛋白浓度。添加上样缓冲液后煮沸变性。蛋白样品40 g，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。PVDF膜300 mA，30 min转膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，α-突触核蛋白一抗(1∶500，2642)4 ℃孵育过夜。将PVDF膜用加Tween-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBST)漂洗后，PVDF膜与山羊抗兔二抗(1∶2 000，SA00001-2)室温孵育40 min，TBST漂洗后化学发光法进行显影。

(4)免疫荧光检测：冰冻切片清洗3次，每次10 min，100%丙酮于-20 ℃放置10 min。再用PBS清洗3次，每次10 min。经体积分数10%山羊血清加0.5%Triton X-100配制而成的封闭液于室温封闭1.5 h后，加入抗体α-突触核蛋白(1∶200，4 179)于4 ℃冰箱孵育。用PBS清洗3次(每次10 min)后，加入山羊抗兔Alexa Flour 488(1∶1 000)于室温孵育1.5 h。孵育完成后PBS清洗3次，每次10 min，再加入DAPI染色液2 min。

1.5 主要观察指标 ①采用旷场试验、水迷宫实验、参考记忆、工作记忆检测两组动物不同时间点认知功能；②Western blot检测两组动物不同时间点海马区线粒体α-突触核蛋白变化；③免疫荧光检测两组动物不同时间点海马区α-突触核蛋白变化。

1.6 统计学分析所有实验数据采用SPSS 21.0进行统计学分析，连续变量以x(_)±s表示，两组之间的数据比较采用独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

研究发现CCH可通过神经元受损^[23]、激活细胞凋亡^[5]、减少脑源性神经营养因子等机制引起缺血后认知障碍^[24]，作者前期研究也发现，CCH后认知障碍与沉默突触增多有关^[6]，提示CCH在脑缺血相关认知损伤中的重要性，但具体机制仍未完全明确，其中，线粒体功能紊乱是相关研究热点之一^[25]。

线粒体是人体内的关键细胞器，主要通过氧化磷酸化生成ATP提供机体所需能量，并在氧化应激、脂质代谢、钙平衡、细胞凋亡、信号转导等重要生物活动中起重要作用^[26-27]。研究发现慢性缺血可导致线粒体呼吸链复合体功能障碍，引起氧化应激及能量供应障碍，可能在缺血后认知功能减退中起重要作用^[13]。但CCH后线粒体相关变化研究多集中于氧化应激方向，其他相关损伤机制研究较少。

因此，此次研究针对CCH后线粒体相关改变进行研究，进一步探讨了海马区线粒体α-突触核蛋白变化。现有针对α-突触核蛋白与缺血相关研究多采用急性/局部缺血模型，为探讨在长期慢性缺血条件下α-突触核蛋白变化特点，该研究采用CCH模型，并选择与认知功能密切相关的海马区域进行观察。由于从模型构建后1-12周为慢性脑低灌注状态维持阶段，多数学者重点研究该时间点，此阶段与老年人群脑血流下降的特点极为相似^[28]，因此选择对CCH模型建立后4周及12周2个时间点进行观察。结果发现，Western blot检测中4周及12周时CCH组较对照组线粒体α-突触核蛋白有增多，具有统计学意义，12周时增多更明显；免疫荧光检测发现，4周及12周时CCH组较对照组α-突触核蛋白增多，具有统计学意义，12周时增多更明显。Western blot及荧光检测结果均表示随缺血时间延长，α-突触核蛋白增多更明显。

研究揭示α-突触核蛋白大量存在于神经细胞中，占总蛋白量的1%，在突触间信息传递及突触可塑性等神经功能中起到重要作用^[29-30]。研究人员发现，α-突触核蛋白分布于细胞内多个部分，其中线粒体占16.5%^[31]，多于其它细胞器^[32]，主要借助N端存在于线粒体内膜，外膜也有部分存在^[33]。有研究观察到α-突触核蛋白与线粒体有直接相互作用^[31]。正常情况下有调节线粒体动力学^[34]、参与能量代谢^[35]、调节线粒体膜通透性等作用^[36]。α-突触核蛋白作为一种在正常情况下维持线粒体功能稳定的物质，增多或减少均会造成线粒体功能紊乱。研究发现当小鼠脑组织中缺乏α-突触核蛋白，复合体Ⅰ、Ⅲ活性减少、线粒体脂质成分变化、复合体Ⅰ、Ⅲ之间连接性也会受损^[37]；α-突触核蛋白增多时，可直接作用于复合体Ⅰ，使复合体Ⅰ活性减低、自由基产生增加^[31^，^38]。因此，α-突触核蛋白是一种可以强烈影响线粒体功能的物质。

α-突触核蛋白在神经退行性变疾病中起到关键作用，具有重要研究意义，不仅是帕金森病标志性病理物质^[39-40]；还在阿尔茨海默病患者脑组织中增多^[41]，并可通过促进APP的β裂解过程介导β淀粉样蛋白增多^[42]；以及可促进tau蛋白聚集^[43]，被认为与神经退行性变疾病密切相关^[44]。研究表示α-突触核蛋白可通过减少突触蛋白表达^[45]、激活钙调磷酸酶^[46]、激活NMDA受体等机制影响突触功能^[47]，以及可通过炎症、细胞凋亡、线粒体功能紊乱、氧化应激等机制介导神经元死亡^[48]。由此可知，α-突触核蛋白与认知功能密切相关。帕金森病与脑缺血之间有兴奋性中毒、离子紊乱、炎症、线粒体功能紊乱、氧化应激、内皮质应激、水肿等可致神经元死亡及神经功能紊乱的类似病理机制^[49]，以及，缺血相关机制可能为α-突触核蛋白聚集提供一个最佳的环境^[20]。不仅是理论，研究发现大脑中动脉闭塞模型可导致帕金森病样改变^[50]。并且，研究发现α-突触核蛋白可在啮齿类动物脑缺血模型海马区增多^[19^，^51]。还有研究发现帕金森病患者较正常对照组对缺血损伤更敏感^[52]。因此，有研究人员推测α-突触核蛋白在脑缺血后认知障碍中可能起到重要作用^[21]。

鉴于线粒体功能紊乱是脑缺血后认知障碍重要病理机制，而α-突触核蛋白不仅与线粒体密切相关，与认知功能、脑缺血也有重要关联。该研究在CCH模型中观察到海马区α-突触核蛋白具有明显增多，因此推测α-突触核蛋白增多与慢性脑低灌注相关认知障碍可能有重要作用。但研究缺乏干预实验，无法对α-突触核蛋白在慢性脑低灌注致大鼠认知障碍中的作用进行验证，也未对其起作用的具体机制进行探索，并且由于技术原因，未能进行α-突触核蛋白与线粒体荧光双标以达到对在线粒体上分布的α-突触核蛋白更精确的检测，有待于后续实验进行探讨发现。

结论：研究发现，在长期脑低灌注状态下会诱发α-突触核蛋白增多，并随时间增多更明显，与认知损伤趋势相似，提示CCH后α-突触核蛋白增多可能在缺血后认知障碍中有重要作用，为脑缺血相关认知功能受损的防治提供了新思路，相关损伤机制及干预途径有待进一步探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

慢性脑低灌注致模型大鼠学习记忆受损及海马α-突触核蛋白变化

Cognitive impairment and hippocampal alpha-synuclein change in a rat model of chronic cerebral hypoperfusion

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