重组腺病毒介导MRTF-A基因干预缺血再灌注损伤模型大鼠心肌细胞的凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0824

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
心肌缺血再灌注损伤：是各种因素(多为冠状动脉粥样硬化)引起的心肌血流灌注减少、供氧及能量代谢失常一定时间后，解除梗阻因素恢复血液灌流后，心肌功能不仅没有恢复，反而损伤更为严重的现象。是目前临床上介入治疗、冠状动脉溶栓治疗、冠脉搭桥术等常见并发症，严重影响患者预后。
myocardin相关转录因子A(MRTF-A)：作为SAP蛋白家族重要成员，是一种转录共激活剂，可辅助性调控血清反应因子(SRF)激活而促使多种效应基因表达。

摘要
背景：有研究表明上调myocardin相关转录因子A(myocardin-related transcription factor-A，MRTF-A)基因表达可抑制脑缺血再灌注诱导的神经细胞凋亡而发挥脑保护作用，但其对心肌缺血-再灌注损伤中心肌细胞的作用鲜有报道。
目的：探讨重组腺病毒介导MRTF-A基因对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响。
方法：SD大鼠随机分为假手术组、模型组、空白载体组和Adv-MRTF-A组，制备MRTF-A cDNA重组腺病毒载体，除假手术组外构建大鼠缺血再灌注损伤模型。Adv-MRTF-A组取大鼠左心室游离壁上、下、左、右4点各注射病毒滴度1.2×1010 TU/mL的Adv-MRTF-A；空白载体组以同样的方法注射同量的空白对照病毒，假手术组、模型组不注射。14 d后取材，TTC染色法检测各组大鼠心肌梗死面积，TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞凋亡，Western blot法检测各组大鼠心肌组织中MRTF-A、Bcl-2、Mcl-1和Bax蛋白表达。
结果与结论：①假手术组大鼠心肌梗死面积0%，与模型组和空白载体组比较，Adv-MRTF-A组大鼠心肌梗死面积明显减少(P < 0.001)；心肌细胞凋亡率显著降低(P < 0.001)；心肌组织中MRTF-A、Bcl-2、Mc-1蛋白相对表达量均升高，而Bax蛋白相对表达量降低(P < 0.05)。②结果说明，重组腺病毒介导MRTF-A基因表达可有效减少心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积，其机制可能与促进Bcl-2、Mcl-1蛋白表达、抑制Bax蛋白表达从而抗心肌细胞凋亡有关。

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ORCID: 0000-0003-3539-7629(杨辉)

关键词: 缺血再灌注损伤, MRTF-A, 实验动物, 大鼠, 腺病毒载体, 细胞凋亡, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Up-regulation of mRNA expression of myocardin-related transcription factor-A (MRTF-A) has been shown to be inhibit neuronal apoptosis after cerebral ischemia/reperfusion, and play a protective role in the brain. However, its effect on the apoptosis of cardiomyocytes after ischemia/reperfusion injury remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of recombinant adenovirus encoding murine MRTF-A on the cardiomyocyte apoptosis induced by ischemia/reperfusion injury in rats.
METHODS: Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation, model, blank vector and Adv-MRTF-A groups. Recombinant adenovirus encoding MRTF-A was prepared, and the models of ischemia/reperfusion injury were constructed in the rats except the sham operation group. The virus titer 1.2×1010 TU/mL of Adv-MRTF-A vector was injected into the infracted part on the left ventricular free wall in the Adv-MRTF-A group, while the rats in the blank vector group was given the injection of the same amount of blank virus. The myocardial infarct area was detected by TTC staining. The apoptosis of cardiomyocytes was detected by TUNEL method. The expression levels of MRTF-A, Bcl-2, Mcl-1 and Bax proteins in the myocardium were detected using western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The myocardial infarct area in the sham operation group was 0%. Compared with the model and blank vector groups, the myocardial infarct area in the Adv-MRTF-A group was significantly decreased (P < 0.001), the apoptotic rate of cardiomyocytes was significantly decreased (P < 0.001); the relative expression levels of MRTF-A, Bcl-2 and Mcl-1 proteins in the in the myocardium were significantly up-regulated, while the relative expression level of Bax protein was significantly down-regulated (P < 0.05). In summary, recombinant adenovirus encoding MRTF-A effectively reduces myocardial infarct ares in rats with myocardial ischemia/reperfusion injury, probably by promoting the expression levels of Bcl-2 and Mcl-1 proteins, and inhibiting the expression level of Bax protein, thereby exhibiting anti-cardiomyocyte apoptosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Myocardial Ischemia, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

杨辉，牛美芝，郭晓丽，刘福垒. 重组腺病毒介导MRTF-A基因干预缺血再灌注损伤模型大鼠心肌细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(24): 3843-3848.

Yang Hui1, Niu Mei-zhi1, Guo Xiao-li1, Liu Fu-lei2. Recombinant adenovirus encoding myocardin-related transcription factor-A prevents cardiomyocyte apoptosis induced by ischemia/reperfusion injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(24): 3843-3848.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析实验选用SD大鼠40只，分为4组，实验过程脱失2只，进入结果分析38只。

2.2 各组大鼠心肌梗死面积比较 TTC染色结果显示，假手术组大鼠心肌梗死面积0%，模型组、空白载体组和Adv-MRTF-A组大鼠心肌梗死面积分别为(35.7±3.5)%、(33.8±2.8)%和(23.4±2.4)%，与模型组和空白载体组比较，Adv-MRTF-A组大鼠心肌梗死面积明显减少，差异有显著性意义(F=25.948，P=0.000)，详见图1。

2.3 各组大鼠心肌组织超微结构变化电镜下，对照组大鼠心肌肌丝规则排列，可见清晰的闰盘结构，线粒体形态正常，膜完整，嵴清晰可见，未见肿胀，内质网镶嵌于肌丝和基质中，呈圆形或椭圆形；模型组和空白载体组大鼠心肌肌丝混乱排列，出现断裂、消失或融合，闰盘结构不清晰，线粒体形态异常、肿胀，出现膜溶解，嵴结构消失，出现空泡，可见大量内质网空泡；相比于模型组和空白载体组，Adv-MRTF-A组大鼠心肌损伤程度减轻，见图2。

2.4 各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较 TUNEL检测结果显示，假手术组大鼠心肌细胞形态规则、正常，界限清楚，细胞凋亡率为(7.3±2.5)%，与假手术组相比，模型组和空白载体组大鼠心肌细胞凋亡率显著增加，分别为(71.2± 4.5)%和(68.5±3.7)%，差异有显著性意义(F =971.438， P=0.000)，与模型组和空白载体组比较，Adv-MRTF-A组大鼠心肌细胞凋亡率为(16.9±2.8)%，显著降低，差异有显著性意义(F =731.183，P =0.000)，详见图3。

2.5 各组大鼠心肌组织中MRTF-A、Bcl-2、Mcl-1和Bax蛋白表达比较与假手术组相比，模型组和空白载体组大鼠心肌组织中MRTF-A、Bcl-2、Mcl-1蛋白相对表达量均降低，而Bax蛋白相对表达量升高，差异均有显著性意义 (P < 0.05)；与模型组和空白载体组相比，Adv-MRTF-A组大鼠心肌组织中MRTF-A、Bcl-2、Mcl-1蛋白相对表达量均升高，而Bax蛋白相对表达量降低，差异均有显著性意义

(P < 0.05)，详见表1和图4，5。

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引言

在中国，随着老龄化加剧以及生活方式改变，心血管疾病发病率逐年升高，已成为中国重大公共卫生问题，成为威胁人群生命的“头号杀手”^[1]。急性心肌梗死作为心脑血管疾病常见的危重症，具有较高的致死、致残率^[2]。随着经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术、静脉溶栓等技术的推广应用，在很大程度上挽救了患者生命^[3]，但研究发现，心肌阻断供血后再次灌注时，可能会出现更为严重的损伤及功能障碍，甚至导致心肌组织出现不可逆性损伤，即发生缺血再灌注损伤，而加速心肌细胞凋亡，扩大心肌梗死面积^[4-7]。因此，如何有效减轻心肌缺血再灌注损伤已成为临床研究重点。

目前的研究发现，心肌缺血再灌注损伤过程中最大的危害是引起心肌细胞大量凋亡，心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤过程早期主要损伤形式，且其与缺血再灌注损伤严重程度密切相关，心肌凋亡数量在一定程度上可反映缺血再灌注损伤的轻重^[8-11]，所以，有效减少心肌细胞凋亡对防治心肌缺血再灌注损伤意义重大。

myocardin相关转录因子A(myocardin-related transcription factor-A，MRTF-A)作为SAP蛋白家族重要成员，是一种转录共激活剂，可辅助性调控血清反应因子(SRF)激活而促使多种效应基因表达，可特异性表达于机体生长发育阶段的心肌和平滑肌细胞内^[12]，与细胞增殖、分化、凋亡、信号转导密切相关^[13]。有研究指出，MRTF-A可影响心血管疾病的发生^[14]，MRTF-A过表达可通过Rho信号通路，增强SRF的活力，促使相关靶基因高表达而诱导心肌肥厚、心肌纤维化、病理性重塑等，有望成为心血管疾病治疗的潜在靶点。

研究表明，骨髓间质干细胞移植可通过促进心肌细胞中MRTF-A表达而发挥抗凋亡作用^[15]。有研究指出，上调脑组织中MRTF-A基因表达可抑制脑缺血再灌注诱导的神经细胞凋亡^[16]，减少脑梗死体积。但MRTF-A基因在心肌缺血-再灌注损伤中的作用及对心肌细胞凋亡的影响鲜有报道。实验建立大鼠缺血再灌注模型，利用重组腺病毒介导MRTF-A基因传导大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型，观察其对心肌细胞凋亡的影响，并探讨可能的机制。

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材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2016年4月至2017年2月在山东省肥城矿业中心医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物及分组雄性SPF级SD大鼠40只购自河南省实验动物中心[许可证号：SCXK(豫)2010-0002]，8周龄，体质量(200±20) g，分笼饲养于标准环境中，自由饮水、进食。利用随机数字表将40只大鼠随机分为4组：假手术组、模型组、空白载体组和Adv-MRTF-A组，每组10只。

1.3.2 实验用主要试剂和设备 pDC316-T载体、加A尾试剂盒、限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ均购自大连宝生物公司，pDC316-mCMV-EGFP质粒购自美国Stratagene公司，Trizol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen 公司，反转录、PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司，MRTF-A引物序列由上海生工生物公司设计合成，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TCC)试剂购自南京建成生物工程研究所，Imagemaster VDS图像分析软件购自美国Pharmacia Biotech公司，TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购自上海乔羽生物科技公司，兔抗MRTF-A多克隆抗体、兔抗大鼠髓细胞血友病因子1(Mcl-1)多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，兔抗大鼠B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)多克隆抗体、兔抗大鼠Bcl-2相关X蛋白(Bax)多克隆抗体均购自美国CST公司，凝胶电泳成像系统购自美国Bio-rad公司。

1.4 实验方法

1.4.1 MRTF-A cDNA重组腺病毒载体制备参照文献[17]中的方法制备MRTF-A cDNA重组腺病毒载体。利用总RNA提取试剂盒获得大鼠新鲜肾脏组织中总RNA，根据MRTF-A基因信息，由上海生工生物公司设计合成MRTF-A特异性引物：上游：5’-AAG GAA CCA CCT GGC TAT GA-3’，下游：5’-CTC CGC TCT GAA TGA GAA TGT-3’。按照反转录试剂盒说明，以MRTF-A下游引物为模板反转录为单链cDNA，利用PCR试剂盒对MRTF-A基因进行扩增。用加A尾试剂盒对PCR扩增产物加A尾后，连接到pDC316-T载体上，利用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，对基因序列进行鉴定。留取测序正确的质粒，用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，将MRTF-A cDNA克隆到pDC316-mCMV-EGFP质粒上，在与慢病毒混合、同源重组、双酶切后，获得腺病毒携带MRTF-A重组质粒(Adv-MRTF-A)。

本研究所需Adv-MRTF-A大量包装、纯化、滴度测定均由上海闪晶分子生物公司完成，以腺病毒载体介导的增强荧光蛋白(Adv-EGFP)作为空白对照病毒，经测定病毒滴度均接近1.2×10¹⁰TU/mL。

1.4.2 构建大鼠缺血再灌注损伤模型参照文献[18]的方法制备大鼠缺血再灌注损伤模型。腹腔注射35 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，固定，进行心电监测、气管插管、行机械通气。于胸骨左旁3，4肋间行开胸术，撑开肋骨，使心脏完全暴露，用4-0号单股手术线对冠状动脉左前支结扎，在左心左心耳下缘3.0-4.0 mm处进针，在左室心肌穿线，深约1.5 mm，再斜向右上方肺动脉方向进针，针距为 3.0-4.0 mm，稳定1 min后，收紧手术线进行结扎30 min，以Ⅱ导联心电图示ST段显著抬高、T波高耸或左心室苍白作为心肌缺血成功标志，实验过程中无血栓形成。之后去除结扎线，使冠脉恢复再灌注120 min，以心电图示ST段下降大于50%、T波下降或左心室出现暗红色作为心肌再灌注成功的标志。将结扎前心电图异常、实验过程中死亡者剔除。

假手术组仅开胸后将结扎线从冠脉左心室前降支下穿过而不结扎；Adv-MRTF-A组分别取大鼠左心室游离壁上、下、左、右4点各注射50 μL的Adv-MRTF-A(病毒滴度 1.2×10¹⁰ TU/mL)；空白载体组以同样的方法注射50 μL的空白对照病毒；假手术组和模型组不做特殊处理。处理后关闭胸腔，断开呼吸机，缝合皮肤，待大鼠苏醒后，拔除气管插管，同组大鼠饲养于同一笼中，给予肌内注射青霉素 5 d以防感染，14 d后进行实验。整个实验过程中假手术组和空白载体组各死亡1只大鼠。

1.4.3 TTC染色法检测各组大鼠心肌梗死面积 14 d后将各组大鼠处死，去除心脏，去除表面组织，用冰生理盐水进行反复冲洗，于-20 ℃冰箱中冷冻15 min，从心尖部沿垂直于心脏长轴方向连续切片，厚度约2 mm，置于含1% TTC的磷酸盐缓冲液中，于35 ℃恒温孵育20 min，甲醛固定。利用Imagemaster VDS图像分析软件检测心肌梗死面积，分析心肌梗死面积占心肌总面积的比例，心肌梗死区被染成灰白色，未梗死区被染成深红色。

1.4.4 心肌组织超微结构观察取各组大鼠心肌缺血梗死组织，用PBS漂洗3次，1%饿酸固定，利用梯度浓度乙醇脱水，环氧树脂包埋，修块、超薄切片，利用透射电镜观察并采集图像。

1.4.5 TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞凋亡取各组大鼠心肌缺血梗死组织，经甲醛固定、石蜡包埋、切片、脱蜡水化、通透后，用PBS漂洗3次，血清封闭25 min，PBS漂洗3次，加入TUNEL反应工作液，置于湿盒中，30 ℃避光孵育60 min，荧光显微镜下凋亡细胞核被染成棕色，利用Image Pro Plus图像分析软件对凋亡细胞数进行分析，每张片子随机取5个视野计数细胞，计算凋亡指数。

凋亡指数=(凋亡细胞数/同一视野中细胞总数)×100%

1.4.6 Western blot法检测各组大鼠心肌组织中MRTF-A、Bcl-2、Mcl-1和Bax蛋白表达取各组大鼠心肌组织，研磨后加入细胞裂解液，用总蛋白提取试剂盒提取细胞中总蛋白，用BCA总蛋白检测试剂盒检测蛋白纯度。取50 μg总蛋白，煮沸变性后，进行SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉于室温下封闭1 h，分别将一抗兔抗MRTF-A多克隆抗体、兔抗大鼠Mcl-1多克隆抗体、兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体、兔抗大鼠Bax多克隆抗体(稀释比例1∶1 200、1∶800、1∶1 000、1∶500)加入，过夜孵育，用TBST冲洗3次，将二抗加入，于37 ℃条件下孵育6 h，用TBST冲洗3次，利用ECL化学发光超敏显色试剂盒避光反应25 min，获得各蛋白反应条带，利用Image J图像分析软件分析各组大鼠心肌组织中MRTF-A、Bcl-2、Mcl-1和Bax蛋白相对表达量。

1.5 主要观察指标各组大鼠心肌梗死面积、心肌组织超微结构及心肌细胞凋亡情况，心肌组织中MRTF-A、Bcl-2、Mcl-1和Bax蛋白表达。

1.6 统计学分析利用SPSS 21.0统计分析软件对数据进行统计学分析，计量资料采用x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

急性心肌梗死治疗的关键在于尽早解除梗阻，恢复心肌灌流，以尽可能的挽救心肌细胞，改善患者预后^[19]，然而，缺血心肌在恢复血供时易发生再灌注损伤，进一步加重心肌损伤，其危害性更大，患者致死率更高^[20-22]，已成为临床研究热点和难点。MRTF-A是广泛存在于胚胎及机体组织内的含有SAP结构域的一种基因，在与SRF结合后可激活SRF依赖的多种基因转录，在心功能发育及一些心血管相关疾病发生中发挥重要作用^[23]。有研究指出，发生心肌梗死时，Rho信号通路被激活^[24-26]，可促使G-肌动蛋白与MRTF-A解离，加速MRTF-A转移至细胞核，促使其与SRF结合而激活SRF依赖的基因转录，参与心肌细胞增殖、生长、凋亡等过程。钟泽等^[27]指出，骨髓间质干细胞移植可有效抑制大鼠心肌细胞凋亡，可能与增加心肌细胞MRTF-A表达有关。

该研究为进一步探讨MRTF-A基因在心肌缺血再灌注损伤中的作用，利用重组腺病毒载体的方法上调心肌中MRTF-A基因基因表达，该方法具有宿主范围广、感染效率高、制备滴度高、存活时间长，且对宿主治病低等特点，可稳定高效的转导目的基因，并且不会整合至宿主细胞基因组中^[28]。研究利用Adv-MRTF-A转导缺血再灌注损伤大鼠2周后，大鼠心肌组织中MRTF-A蛋白表达显著上调，提示利用重组腺病毒载体转染可有效上调心肌中MRTF-A表达。

研究TTC染色结果显示，相比于假手术组，模型组和空白载体组大鼠均出现了心肌梗死，提示缺血心肌在恢复血液灌流后，仍然发生了心肌梗死，同时，相比与模型组和空白载体组，Adv-MRTF-A组大鼠心肌梗死面积明显减少，说明重组腺病毒介导MRTF-A基因表达可有效减少大鼠心肌梗死面积，提示MRTF-A基因在心肌缺血再灌注损伤过程中可能发挥心肌保护作用。电镜下，Adv-MRTF-A组大鼠心肌损伤程度减轻；TUNEL实验结果进一步显示，与假手术组相比，模型组和空白载体组大鼠心肌细胞凋亡率显著增加，说明缺血再灌注过程可加速心肌细胞凋亡发生，而与模型组和空白载体组比较，Adv-MRTF-A组大鼠心肌细胞凋亡率为显著降低，进一步说明上调MRTF-A基因表达可显著减少心肌细胞凋亡发生。

Bcl-2家族是细胞凋亡过程中发挥关键性作用的蛋白，包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白两大类，其中，Bcl-2、Mcl-1是重要的抗凋亡蛋白，而Bax是主要的促凋亡蛋白^[29]。研究结果显示，相比于假手术组，模型组和空白载体组大鼠心肌组织中Bcl-2、Mcl-1蛋白相对表达量均降低，而Bax蛋白相对表达量升高，说明发生心肌缺血再灌注损伤时可能通过促凋亡蛋白表达上调而抗凋亡蛋白表达抑制实现的，而转导MRTF-A基因后，心肌组织中Bcl-2、Mcl-1蛋白相对表达量均升高，而Bax蛋白相对表达量降低，说明MRTF-A可能通过促进Bcl-2、Mcl-1蛋白表达，抑制Bax蛋白表达，从而发挥心肌保护作用。

综上所述，重组腺病毒介导MRTF-A基因表达可有效减少心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积，抑制心肌细胞凋亡，具有心肌保护功能，其机制可能与促进Bcl-2、Mcl-1蛋白表达，抑制Bax蛋白表达有关。研究利用动物实验表明，MRTF-A在心肌缺血再灌注损伤中发挥重要作用，是影响心肌缺血再灌注损伤的一个关键点，上调MRTF-A基因表达可减少通过抑制心肌细胞凋亡而发挥心肌保护作用，有望为未来心肌缺血再灌注损伤防治提供新的治疗靶点和手段。然而，该研究作为一项动物实验研究，在上调MRTF-A基因表达采用病毒转染的方法，该方法是否在人体适用？以及是否有其他更好的方法上调该基因表达？均需进一步研究明确，同时，MRTF-A基因参与心肌缺血再灌注损伤是否还涉及其他基因转录、信号通路激活等具体机制，均有待进一步研究明确。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程