脂肪间充质干细胞过表达骨形态发生蛋白2促进骨质疏松大鼠牙槽骨缺损修复

doi:10.12307/2024.105

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨质疏松症：是一种慢性系统性骨病，以骨微细结构破坏、骨量下降为特征。骨质疏松症患者骨脆性增加，容易发生骨折，以老年人和绝经后妇女居多。
脂肪间充质干细胞：来源于脂肪组织，具有自我更新和多向分化能力，如分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞及内皮细胞等，同时具有较低的免疫排斥性。脂肪间充质干细胞已被广泛用于骨质疏松症和骨缺损的治疗。

背景：颌骨在骨质疏松症中最容易受累，脂肪间充质干细胞和骨形态发生蛋白2具有促进骨质疏松症骨再生的效果，然而骨形态发生蛋白2修饰的脂肪间充质干细胞对骨质疏松症牙槽骨缺损的修复作用鲜有报道。
目的：探究过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞对骨质疏松大鼠牙槽骨缺损的修复作用。
方法：①将过表达骨形态发生蛋白2基因的慢病毒感染大鼠脂肪间充质干细胞，通过检测绿色荧光蛋白和骨形态发生蛋白2表达进行鉴定；②切除卵巢建立骨质疏松大鼠模型，于上颌两侧第一磨牙位置制备3 mm×3 mm×3 mm的圆柱形缺损；③假手术组和骨质疏松组大鼠植入明胶海绵，脂肪间充质干细胞组植入空载体慢病毒感染的脂肪间充质干细胞与明胶海绵复合体，过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞组植入过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞与明胶海绵复合体，1个月后进行相关指标检测。

结果与结论：①脂肪间充质干细胞组和过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞组转染效率均达到70%以上；与脂肪间充质干细胞组相比，过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞组骨形态发生蛋白2蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)；②假手术组骨缺损区可见大量新骨生成；与假手术组相比，骨质疏松组有少量新骨生成，新骨面积明显减小，碱性磷酸酶、骨钙素及骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白水平明显降低；与骨质疏松组相比，脂肪间充质干细胞组和过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞组有大量新骨生成，新骨面积明显增加，碱性磷酸酶、骨钙素及骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白水平明显升高，且过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞组优于脂肪间充质干细胞组(均P < 0.05)；③结果表明，骨形态发生蛋白2在骨质疏松大鼠牙槽骨表达较少，过表达骨形态发生蛋白2的脂肪间充质干细胞能够促进骨质疏松大鼠牙槽骨缺损的成骨再生。

https://orcid.org/0009-0009-1485-3972 (何莉君)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨形态发生蛋白2, 脂肪间充质干细胞, 骨质疏松, 牙槽骨, 修复

Abstract: BACKGROUND: Jaws are most vulnerable to osteoporosis. Adipose-derived mesenchymal stem cells and bone morphogenetic protein 2 have the effect of promoting bone regeneration in osteoporosis. However, the repair effect of bone morphogenetic protein 2 modified adipose-derived mesenchymal stem cells on alveolar bone defects in osteoporosis is rarely reported.
OBJECTIVE: To explore the repair effect of adipose-derived mesenchymal stem cells overexpressing bone morphogenetic protein 2 on alveolar bone defects in osteoporosis rats.
METHODS: (1) The rat adipose-derived mesenchymal stem cells were infected with lentivirus overexpressing bone morphogenetic protein 2 gene, and identified by detecting the expression of green fluorescent protein and bone morphogenetic protein 2. (2) Osteoporosis rat model was established by ovariectomy. A 3 mm × 3 mm × 3 mm cylindrical defect was prepared at the first molar position on both sides of the upper jaw. (3) Gelatin sponge was implanted in rats of the sham operation group and osteoporosis group. In the adipose-derived stem cell group, the adipose-derived mesenchymal stem cells infected with empty vector lentivirus and gelatin sponge complex were implanted. In the adipose-derived mesenchymal mesenchymal stem cell group overexpressing bone morphogenetic protein 2, a complex of adipose-derived mesenchymal stem cells overexpressing bone morphogenetic protein 2 and gelatin sponge was implanted. Relevant indexes were tested one month later.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The transfection efficiency of the adipose-derived mesenchymal stem cell group and adipose-derived mesenchymal stem cell group overexpressing bone morphogenetic protein 2 reached more than 70%. Compared with the adipose-derived mesenchymal stem cell group, the level of bone morphogenetic protein-2 protein in the adipose-derived mesenchymal stem cell group overexpressing bone morphogenetic protein-2 was significantly higher (P < 0.05). (2) A large amount of new bone could be seen in the bone defect area of the sham operation group. Compared with the sham operation group, the osteoporotic group had a small amount of new bone formation; the new bone area was significantly reduced, and alkaline phosphatase, osteocalcin, and bone morphogenetic protein 2 mRNA and protein levels were significantly reduced. Compared with the osteoporosis group, the adipose-derived mesenchymal stem cell group and the adipose-derived mesenchymal stem cell group overexpressing bone morphogenetic protein 2 had a large number of new bone formation; the area of new bone was significantly increased, and the levels of alkaline phosphatase, osteocalcin, and bone morphogenetic protein 2 mRNA and protein were significantly increased. Moreover, the adipose-derived mesenchymal stem cell group overexpressing bone morphogenetic protein 2 was superior to the adipose-derived mesenchymal stem cell group (all P < 0.05). (3) The results showed that bone morphogenetic protein 2 was less expressed in the alveolar bone of osteoporosis rats, and adipose-derived mesenchymal stem cells overexpressing bone morphogenetic protein 2 could promote osteogenesis and regeneration of alveolar bone defects in osteoporosis rats.

Key words: bone morphogenetic protein-2, adipose-derived mesenchymal stem cell, osteoporosis, alveolar bone, repair

中图分类号:

何莉君, 漆小娟. 脂肪间充质干细胞过表达骨形态发生蛋白2促进骨质疏松大鼠牙槽骨缺损修复[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 32-37.

He Lijun, Qi Xiaojuan. Adipose-derived mesenchymal stem cells overexpressing bone morphogenetic protein 2 promote alveolar bone defect repair in osteoporosis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(1): 32-37.

图/表（结果） 6

2.1 骨质疏松症大鼠模型的鉴定结果 micro-CT结果显示，与假手术组相比，骨质疏松症组大鼠骨小梁明显减少，骨密度明显降低；横断面可见明显骨髓空腔。骨形态学指标显示，与假手术组相比，骨质疏松症组骨小梁厚度、骨小梁数目、骨体积分数明显减小，骨小梁间距明显增大(均P < 0.05)。苏木精-伊红染色结果显示，假手术组骨小梁完整，骨髓腔较小，骨量较多；而骨质疏松症组骨小梁较稀疏，骨髓腔较大，骨量较少，说明骨质疏松症组大鼠骨质疏松严重，见图1。

2.2 ADSCs的形态观察和鉴定结果第3代ADSCs呈漩涡状排列，细胞呈长梭形，形态趋于一致。碱性磷酸酶染色可见蓝紫色染色结节，茜素红染色可见橙红色钙化结节，油红O染色可见红色融合变大的脂滴；ADSCs表面标志物CD90(99.1%)和CD105(99.9%)呈阳性表达，造血干细胞标记物CD34(1.0%)和CD45(1.1%)呈阴性表达，见图2。

2.3 ADSCs转染鉴定结果 BMP2/ADSCs组转染效率达到70%以上。Western blot结果显示，与ADSCs组相比，BMP2/ADSCs组BMP2蛋白水平明显升高(P < 0.05)，说明转染成功，见图3。

2.4 过表达BMP2的ADSCs对骨质疏松症大鼠颌骨缺损的修复作用 micro-CT结果显示，各组大鼠上颌骨缺损体积随时间推移均变小；骨缺损体积由小到大排列为假手术组、BMP2/ADSCs组、ADSCs组和骨质疏松症组。骨形态学指标显示，与假手术组相比，骨质疏松症组、ADSCs组和BMP2/ADSCs组骨小梁间距明显增加，骨体积分数明显减小；与骨质疏松症组相比，ADSCs组和BMP2/ADSCs组骨小梁间距明显减小，骨体积分数明显增加；与ADSCs组相比，BMP2/ADSCs组骨小梁间距明显减小，骨体积分数明显增加(均P < 0.05)。苏木精-伊红染色结果显示，假手术组骨缺损区可见大量新骨及血管生成，成骨细胞活跃，新骨结构类似板层骨，已存在部分骨性连接；骨质疏松症组骨缺损区仅可见少量新生骨质，纤维结缔组织丰富，与周边骨交界明显；ADSCs组骨缺损区可见明显新骨生成，纤维组织较多，新生骨结构较紊乱，无明显骨连接；BMP2/ADSCs组骨缺损区可见大量新骨和部分血管生成，成骨细胞充盈，但新骨结构较紊乱，存在骨与类骨连接形式。与假手术组相比，骨质疏松症组、ADSCs组和BMP2/ADSCs组的组织学评分明显降低，新骨面积明显减小；与骨质疏松症组相比，ADSCs组和BMP2/ADSCs组的组织学评分明显升高，新骨面积明显增加；与ADSCs组相比，BMP2/ADSCs组的组织学评分明显升高，新骨面积明显增加(均P < 0.05)，见图4。

2.5 过表达BMP2的ADSCs对骨质疏松症大鼠牙槽骨成骨相关基因碱性磷酸酶、骨钙素及BMP2表达的影响免疫组化染色结果显示，与假手术组相比，骨质疏松症组、ADSCs组碱性磷酸酶、骨钙素、BMP2的平均吸光度值明显降低；BMP2/ADSCs组碱性磷酸酶、骨钙素的平均吸光度值明显降低，BMP2的平均吸光度值明显升高。与骨质疏松症组相比，ADSCs组和BMP2/ADSCs组碱性磷酸酶、骨钙素及BMP2的平均吸光度值明显升高；与ADSCs组相比，BMP2/ADSCs组碱性磷酸酶、骨钙素及BMP2的平均吸光度值明显升高(均P < 0.05)。RT-qPCR和Western blot检测结果也显示，与假手术组相比，骨质疏松症组、ADSCs组碱性磷酸酶、骨钙素、BMP2 mRNA和蛋白水平明显降低；BMP2/ADSCs组碱性磷酸酶、骨钙素 mRNA和蛋白水平明显降低，BMP2 mRNA和蛋白水平明显升高；与骨质疏松症组相比，ADSCs组和BMP2/ADSCs组碱性磷酸酶、骨钙素及BMP2 mRNA和蛋白水平明显升高；与ADSCs组相比，BMP2/ADSCs组碱性磷酸酶、骨钙素及BMP2 mRNA和蛋白水平明显升高(均P < 0.05)。见图5。

2.6 过表达BMP2的ADSCs对骨质疏松症大鼠牙槽骨缺损修复的可能机制该实验建立骨质疏松症大鼠牙槽骨缺损模型，将过表达BMP2基因的ADSCs联合明胶海绵复合体植入上颌骨缺损处，发现骨质疏松症组骨缺损处BMP2水平较低，而过表达BMP2的ADSCs显著促进骨缺损处的新骨形成。从基因和蛋白水平检测成骨分化早/晚期标志物水平，发现过表达BMP2的ADSCs通过升高碱性磷酸酶、骨钙素mRNA和蛋白水平促进成骨分化，且成骨效果优于单纯ADSCs组，与假手术组较接近，说明过表达BMP2能够促进牙槽骨的成骨再生，见图6。

参考文献

[1] FISCHER V, HAFFNER-LUNTZER M. Interaction between bone and immune cells: Implications for postmenopausal osteoporosis. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:14-21.
[2] SIMON P, POMPE W, BOBETH M, et al. Podosome-Driven Defect Development in Lamellar Bone under the Conditions of Senile Osteoporosis Observed at the Nanometer Scale. ACS Biomater Sci Eng. 2021;7(6):2255-2267.
[3] GULSAHI A. Osteoporosis and jawbones in women. J Int Soc Prev Community Dent. 2015;5(4):263-267.
[4] PARK JS, PIAO JY, PARK G, et al. Osteoporotic Conditions Influence the Activity of Adipose-Derived Stem Cells. Tissue Eng Regen Med. 2020;17(6):875-885.
[5] AN Y, ZHAO JF, NIE FF, et al. Parathyroid hormone (PTH) promotes ADSC osteogenesis by regulating SIK2 and Wnt4. Biochem Biophys Res Commun. 2019;516(2):551-557.
[6] WANG F, WANG Q, ZHAO Y, et al. Adipose-derived stem cells with miR-150-5p inhibition laden in hydroxyapatite/tricalcium phosphate ceramic powders promote osteogenesis via regulating Notch3 and activating FAK/ERK and RhoA. Acta Biomater. 2023;155:644-653.
[7] 周昊楠.葛根素联合ADSCs支架修复绝经后骨质疏松大鼠胫骨缺损的实验研究及机制初探[D].南宁:广西中医药大学,2020.
[8] 苏之文. ADSCs和HUVECs复合CS-10%P24/nHA支架共培养修复骨质疏松性骨缺损的试验研究[D]. 广州:南方医科大学,2022.
[9] CHEN GQ, XU HD, YAO YF, et al. BMP Signaling in the Development and Regeneration of Cranium Bones and Maintenance of Calvarial Stem Cells. Front Cell Dev Biol. 2020;8:135.
[10] CIPITRIA A, REICHERT JC, EPARI DR, et al. Polycaprolactone scaffold and reduced rhBMP-7 dose for the regeneration of critical-sized defects in sheep tibiae. Biomaterials. 2013;34(38):9960-9968.
[11] 杨显红.静脉注射hBMP2基因转染ADSCs干预兔骨质疏松性骨折的实验研究[D]. 遵义:遵义医科大学,2020.
[12] 熊坤.渐进性梯度孔径支架联合BMP2-ADSCs及自体PRP凝胶修复骨软骨缺损的实验研究[D].遵义:遵义医科大学, 2020.
[13] 郑毅,赵彤.NLR家族Pyrin域蛋白3炎症小体对糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合的作用及其机制研究[J]. 中国现代医学杂志,2022, 32(10):18-23.
[14] ZHANG HL, ZHOU YL, YU N, et al. Construction of vascularized tissue-engineered bone with polylysine-modified coral hydroxyapatite and a double cell-sheet complex to repair a large radius bone defect in rabbits. Acta Biomater. 2019;91:82-98.
[15] MEHRABANI D, KHODAKARAM-TAFTI A, SHATERZADEH-YAZDI H, et al. Comparison of the regenerative effect of adipose-derived stem cells, fibrin glue scaffold, and autologous bone graft in experimental mandibular defect in rabbit. Dent Traumatol. 2018;34(6):413-420.
[16] KHOJASTEH A, HOSSEINPOUR S, RAD MR, et al. Buccal Fat Pad-Derived Stem Cells in Three-Dimensional Rehabilitation of Large Alveolar Defects: A Report of Two Cases. J Oral Implantol. 2019;45(1):45-54.
[17] CHANG SC, CHUANG HL, CHEN YR, et al. Ex vivo gene therapy in autologous bone marrow stromal stem cells for tissue-engineered maxillofacial bone regeneration. Gene Ther. 2003;10(24):2013-2019.
[18] CASTRO-GOVEA Y, CERVANTES-KARDASCH VH, BORREGO-SOTO G, et al. Human bone morphogenetic protein 2-transduced mesenchymal stem cells improve bone regeneration in a model of mandible distraction surgery. J Craniofac Surg. 2012;23(2):392-396.
[19] RAMESH T. Osteogenic differentiation potential of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells enhanced by bacoside-A. Cell Biochem Funct. 2021;39(1):148-158.
[20] HOU ZY, WANG Z, TAO YX, et al. KLF2 regulates osteoblast differentiation by targeting of Runx2. Lab Invest. 2019;99(2):271-280.
[21] 王红.MicroRNA-21在上颌骨缺损愈合中的作用研究[D].济南:山东大学,2018.
[22] YU T, YOU XM, ZHOU HC, et al. MiR-16-5p regulates postmenopausal osteoporosis by directly targeting VEGFA. Aging (Albany NY). 2020; 12(10):9500-9514.
[23] QIAO L, LI CG, LIU D. CircRNA_0048211 protects postmenopausal osteoporosis through targeting miRNA-93-5p to regulate BMP2. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(7):3459-3466.

引言

骨质疏松症是一种慢性系统性骨病，以骨微细结构破坏、骨量下降为特征。骨质疏松症患者骨脆性增加，容易发生骨折，以老年人和绝经后妇女居多[1]。在骨质疏松症患者中，骨折或骨缺损发生率高达75%以上[2]。由于患者颌骨骨骼代谢活跃且自我修复能力较差，使得颌骨在骨质疏松症中最容易受累，表现为颌骨骨密度及牙槽嵴高度降低[3]，因此帮助牙槽骨组织重建是口腔医生亟待解决的问题。来源于脂肪组织的脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)能够自我更新和多向分化(如分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞及内皮细胞等)，同时具有较低的免疫排斥性[4]。越来越多的研究表明ADSCs在骨质疏松症骨缺损修复中扮演重要角色[5]，如ADSCs能够促进骨质疏松症裸鼠骨再生[6]，修复骨质疏松症大鼠胫骨缺损[7]、颅骨缺损等[8]。作为转化生长因子超家族成员，骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein2，BMP2)不但可以诱导骨和软骨的形成，还能调节细胞的增殖和分化[9]。研究发现BMP2能够促进骨折及骨缺损动物的骨愈合[10]，例如静脉注射过表达人BMP2的ADSCs能够修复骨质疏松症兔骨折[11]，过表达BMP2的ADSCs联合富血小板血浆凝胶及梯度孔径丝素蛋白-壳聚糖-纳米羟基磷灰石骨软骨支架能够显著修复比格犬膝关节骨软骨缺损[12]。然而BMP2修饰的ADSCs对骨质疏松症牙槽骨缺损的修复作用鲜有报道。
该研究利用慢病毒转染技术获得过表达BMP2的ADSCs，建立骨质疏松症大鼠牙槽骨缺损模型，观察过表达BMP2的ADSCs对骨质疏松症大鼠牙槽骨缺损的修复作用，为牙槽骨修复提供新的思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析(ANOVA)。
1.2 时间及地点实验于2020年3月至2021年5月在成都大学附属医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6周龄SPF级雌性SD大鼠50只，体质量为250-280 g，购自四川大学(实验动物中心)，许可证号：SYXK(川)2018-185。动物于室温23-25℃、标准湿度55%-60%、光照/黑夜各12 h环境中饲养，饮水饮食正常，1周后实验。
实验方案经成都大学附属医院动物实验伦理委员会批准，审批号为20210118。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂明胶海绵(南京市金陵药业股份有限公司)；胰蛋白酶(美国Invitrogen公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；茜素红、油红O、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；过表达BMP2基因及空载体慢病毒(上海吉凯基因化学有限公司)；CD90、CD45、CD105、CD34抗体(美国Abcam公司)；BMP2、骨钙素(osteocalcin，OCN)抗体(武汉菲恩生物科技有限公司)。
1.3.3 主要仪器高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；石蜡切片机(大连达健医疗器械有限公司)；Bio-Rad蛋白电泳仪、转膜仪(美国伯乐公司)；光学/荧光显微镜(日本Olympus公司)；Inveon Micro-CT(德国Siemens公司)。
1.4 方法
1.4.1 大鼠骨质疏松症模型的制作与鉴定将10只SD大鼠随机分为假手术组和骨质疏松症组，每组5只。腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，仰卧位固定大鼠、备皮消毒。自耻骨2.0-3.0 cm纵向切开皮肤，分离筋膜，切除卵巢(桑葚状红色组织)，缝合筋膜和皮肤组织。假手术组仅切除卵巢周围脂肪组织。术后每天注射10万单位青霉素，连续3 d。
造模3个月时，麻醉后处死大鼠，取股骨用40 g/L多聚甲醛固定，避光保存，采用micro-CT对股骨进行扫描和重建，比较骨小梁厚度、骨小梁数目、骨小梁间距和骨体积分数等指标。
取固定的股骨置于乙二胺四乙酸脱钙液中脱钙，每隔2 d更换1次脱钙液，当探针能轻易刺破骨骼时脱钙完成，流水冲洗、脱水包埋，制作石蜡切片(厚度为3 μm)，然后将石蜡切片脱蜡、脱水，苏木精-伊红染色，水中浸泡，乙醇梯度脱水，透明封固，显微镜(×200)下观察骨组织结构。
1.4.2 ADSCs的培养与鉴定
(1) ADSCs的分离和培养：无菌条件下取大鼠腹部脂肪组织，置于体积分数为75%乙醇中浸泡30 min，用含青/链霉素的PBS冲洗，用剪刀剪碎并用胰酶消化，经100目滤网过滤，离心收集细胞，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养，每隔48 h换液1次，当密度达到90%时，胰酶消化传代，取第3代ADSCs进行实验。
(2) ADSCs成骨分化：取第3代ADSCs，每孔以1×105个细胞的密度接种于6孔板，常规培养，待细胞融合至80%时，用成骨诱导液(体积分数10%胎牛血清+DMEM培养基+1%青/链霉素+100 nmol/L地塞米松+50 μmol/L抗坏血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸钠)进行诱导分化，每3 d换液1次，3周后进行碱性磷酸酶和茜素红染色，光学显微镜(×100)下观察矿化结节形成情况。
(3) ADSCs成脂分化：取第3代ADSCs，每孔以1×105个细胞的密度接种于6孔板，常规培养，待细胞融合至80%时，用成脂诱导液(体积分数10%胎牛血清+DMEM培养基+1%青/链霉素+1 μmol/L地塞米松+10 μg/mL胰岛素+0.2 mmol/L吲哚美辛+0.5 mmol/mL 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)进行诱导分化，每3 d换液1次，3周后进行油红O染色，光学显微镜(×100)下观察成脂染色效果。
(4) ADSCs表面标志物的鉴定：取第3代ADSCs，分别加入FITC标记的CD90、CD105、CD45及CD34，流式细胞仪检测细胞相应抗原的表达。
1.4.3 慢病毒感染ADSCs以及与明胶海绵复合取第3代ADSCs，在含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，将过表达BMP2基因及空载体的慢病毒加入8 μg/mL polybrene感染ADSCs，置于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱培养，感染24 h后更换无病毒培养基，然后用含2 μg/mL嘌呤霉素连续筛选7 d获得稳定传代的细胞。
将明胶海绵在无菌条件下剪裁至3 mm×3 mm×3 mm大小并放置在48孔板内，将转染后的ADSCs消化、离心后，以每孔1×105个细胞接种于明胶海绵上，体外培养3 d，用于后续实验。
1.4.4 大鼠牙槽骨缺损模型制作与分组将40只SD大鼠随机分为假手术组、骨质疏松症组、ADSCs组和BMP2/ADSCs组，每组10只。采用1.4.1的方法制作骨质疏松症模型，假手术组仅切除卵巢周围脂肪组织。骨质疏松症建模完成(3个月)后，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，暴露上颌牙槽骨，利用牙科涡轮机在上颌两侧第一磨牙位置各制备3 mm×3 mm× 3 mm的圆柱形缺损，假手术组和骨质疏松症组大鼠植入明胶海绵，BMP2/ADSCs组植入转染BMP2基因的ADSCs(细胞数为5×106个)与明胶海绵复合体，ADSCs组植入转染空载体慢病毒的ADSCs(细胞数为5×106个)与明胶海绵复合体。放置完成后缝合牙龈，术后每天注射10万单位青霉素，连续3 d。1个月后进行指标检测。实验过程中未有大鼠死亡。
1.4.5 micro-CT扫描和重建分离大鼠上颌骨置于40 g/L多聚甲醛固定，避光保存，micro-CT对上颌骨进行扫描和重建，分析骨缺损区骨体积分数、骨小梁厚度。
1.4.6 苏木精-伊红染色按照1.4.1的方法取固定的上颌骨进行脱钙、制作石蜡切片，进行苏木精-伊红染色，显微镜(×200)下观察上颌骨新骨形成情况。参照Lane-Sandhu组织学标准记录观察结果[13]，从骨形成、骨连接和皮质骨(0-4分) 3方面进行评分，得分越高，骨缺损修复效果越好。
1.4.7 新生骨面积分析随机取3张石蜡切片，每张切片于显微镜(×4)下随机取3个不同视野，利用IDA-2000数码显微图像分析系统计算新生骨面积百分比，新生骨面积百分比=新骨面积/视野面积×100%。
1.4.8 免疫组化染色石蜡切片经脱蜡、脱水、高温抗原修复、血清封闭，加入碱性磷酸酶、骨钙素、BMP2一抗(1∶400) 4 ℃孵育过夜，加入二抗37 ℃孵育1 h，滴加DAB显色液，苏木精复染，脱水，透明，封固。随机取3张石蜡切片，每张切片于显微镜(×400)下随机取5个不同视野，利用IPP软件测量骨缺损区的累积吸光度值(integrated option density，IOD)，计算平均吸光度值(mean option density，MOD)。
1.4.9 RT-qPCR检测采用Trizol试剂从上颌骨组织中提取总RNA并反转录为cDNA，使用SYBR Green法进行扩增，GAPDH作内参。反应条件：95 ℃预变性60 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 50 s，共40个循环。使用2-ΔΔCT公式计算碱性磷酸酶、骨钙素、BMP2相对表达水平。PCR引物序列：碱性磷酸酶-F：5’-CAT CGC CTA TCA GCT AAT GCA CA-3’，碱性磷酸酶-R：5’-ATG AGG TCC AGG CCA TCC AG-3’；骨钙素-F：5’-CCT GAC TGC ATT CTG CCT CTC-3’，骨钙素-R：5’-ACC ACC TTA CTG CCC TCC T-3’；BMP2-F：5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3’，BMP2-R：5’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’；GAPDH-F：5’-TGC ACC ACC AAC TGC TTA GC-3’，GAPDH-R：5’-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3’。
1.4.10 Western blot检测收集上颌骨组织，加入裂解液冰上裂解，提取蛋白并测定蛋白浓度，蛋白稀释后进行电泳，转聚偏二氟乙烯膜，脱脂牛奶中封闭2 h，分别加入碱性磷酸酶、骨钙素、BMP2一抗(1∶2 000)4℃过夜，TBST洗涤后，加入二抗(1∶5 000)4 ℃孵育2 h，加入增强型化学发光显色剂显色，凝胶成像仪拍照，分析各组蛋白相对GAPDH的表达量。
1.5 主要观察指标 ①上颌骨新骨形成情况；②碱性磷酸酶、骨钙素、BMP2表达。
1.6 统计学分析使用SPSS 16.0软件进行统计学分析。所有计量数据均符合正态分布，以x±s表示，多组间计量数据的比较使用单因素方差分析，两两比较使用LSD-t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过成都大学附属医院生物统计学专家审核。

讨论

骨质疏松症患者全身骨量减少的同时存在颌骨骨量减少，当前局部恢复牙槽骨缺损已成为研究热点。ADSCs常用于骨组织工程研究，对骨缺损的愈合具有促进作用。由于来源充足、外源基因容易引入等，ADSCs已成为骨缺损修复治疗的热门选择[14]。ADSCs联合纤维蛋白胶支架比单独使用纤维蛋白胶或自体骨移植更能促进颅面骨缺损的再生[15]。ADSCs联合牛骨矿物质比单独使用牛骨矿物质更能够促进牙槽骨缺损中骨再生，前者皮质骨厚度显著增加[16]。BMP2是转化生长因子β的家族成员，在骨修复中发挥重要作用。研究发现在猪颌骨缺损模型中，移植转染BMP2的骨髓间充质干细胞比单独骨髓间充质干细胞更能促进上颌骨的修复，且骨质更为成熟和完整[17]。此外在犬下颌骨牵张成骨模型中，以脱矿骨基质为载体，植入转染BMP2的ADSCs组比非转染ADSCs组更能促进骨愈合，且促进成熟骨生成[18]。因此作者受到启发，探究过表达BMP2的ADSCs在骨质疏松症大鼠上颌骨修复中的可能作用。该研究通过切除卵巢构建大鼠骨质疏松症模型，在术后3个月时骨小梁减少，骨密度降低，骨质疏松情况严重；同时发现骨质疏松症组BMP2表达减少，推测BMP2可能是影响骨质疏松症发病的因素。虽然切除卵巢构建的骨质疏松症大鼠重复性好，成功率高，但也存在一定的缺陷，如手术容易对机体造成较大的创伤，引起应激反应，可能会对实验造成干扰。随后采用慢病毒载体构建过表达BMP2的ADSCs，利用明胶海绵作为支架，植入骨质疏松症大鼠上颌骨缺损处，结果显示，与骨质疏松症组相比，ADSCs组和BMP2/ADSCs组骨缺损体积明显减小，骨缺损区可见明显新骨和血管生成；BMP2/ADSCs组骨缺损修复情况优于ADSCs组，且与假手术组较接近。
碱性磷酸酶是成骨分化早期标志物，直接反映成骨细胞的活性和功能情况，同时还能产生磷酸沉积于骨中[19]。骨钙素是成骨分化晚期标志物，能够反映成骨细胞的活性和保持骨的转化速率，是骨生成晚期的标志蛋白，在骨折患者体内表达异常升高[20]。成骨细胞的活性及其成骨分化能力是骨再生的必要条件。研究发现miR-21通过提高成骨相关因子碱性磷酸酶、骨钙素的表达，加速新骨生成及矿化，从而促进上颌骨缺损小鼠的骨愈合[21]。绝经后骨质疏松患者体内成骨标志物碱性磷酸酶、骨钙素的表达显著降低，通过上调成骨相关基因和BMP2的表达能够缓解骨质疏松症进展[22-23]。该研究在基因和蛋白水平发现，BMP2/ADSCs组相比ADSCs组和骨质疏松症组，更能够提高骨质疏松症大鼠体内成骨分化早期和晚期标志物碱性磷酸酶、骨钙素的表达，进而促进新骨生成和成熟。
综上所述，BMP2在骨质疏松症大鼠牙槽骨表达较少，过表达BMP2的ADSCs能够促进骨质疏松症大鼠牙槽骨缺损的成骨再生。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程