柔肝降酶方含药血清抑制人肝星状细胞的活化及自噬

doi:10.12307/2023.762

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (33): 5334-5341.doi: 10.12307/2023.762

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

柔肝降酶方含药血清抑制人肝星状细胞的活化及自噬

陶柏楠1，王咏兰1，江露1，张宗星1，刘道忠1，万星2，黄德斌1，袁林1

1湖北民族大学，风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北省恩施州 445000；2四川大学，华西基础医学与法医学院，四川省成都市 610064

收稿日期:2022-09-20 接受日期:2022-11-14 出版日期:2023-11-28 发布日期:2023-03-30
通讯作者: 袁林，副教授，湖北民族大学，风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北省恩施州 445000
作者简介:陶柏楠，男，1996年生，湖北民族大学在读硕士，主要从事中医药防治肝脏疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(82060745)，项目负责人：黄德斌；湖北省卫健委面上项目(ZY2019M076)，项目负责人：袁林；恩施州科技局科技计划性项目(E20190001)，项目负责人：袁林

Rougan Jiangmei Formula medicated serum inhibits activation and autophagy of human hepatic stellate cells

Tao Bonan1, Wang Yonglan1, Jiang Lu1, Zhang Zongxing1, Liu Daozhong1, Wan Xing2, Huang Debin1, Yuan Lin1

1Hubei Provincial Key Laboratory of Occurrence and Intervention of Rheumatic Diseases, Hubei Minzu University, Enshi 445000, Hubei Province, China; 2West China School of Preclinical Medicine and Forensic Medicine, Sichuan University, Chengdu 610064, Sichuan Province, China

Received:2022-09-20 Accepted:2022-11-14 Online:2023-11-28 Published:2023-03-30
Contact: Yuan Lin, Associate professor, Hubei Provincial Key Laboratory of Occurrence and Intervention of Rheumatic Diseases, Hubei Minzu University, Enshi 445000, Hubei Province, China
About author:Tao Bonan, Master candidate, Hubei Provincial Key Laboratory of Occurrence and Intervention of Rheumatic Diseases, Hubei Minzu University, Enshi 445000, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82060745 (to HDB); General Project of Hubei Provincial Health Commission, No. ZY2019M076 (to YL); Science and Technology Planning Project of Enshi Prefecture Science and Technology Bureau, No. E20190001 (to YL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

肝纤维化：是一种由病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝等多种病因引起的慢性肝损伤，肝细胞被反复破坏久之产生细胞外基质的沉积与异常分布的疾病，其主要机制在于肝脏损伤后造成肝星状细胞大量活化，活化后的肝星状细胞由原来的静息状态转为快速增殖状态并大量转化为肌成纤维细胞，替代正常肝细胞，肝脏发生实变，产生大量纤维样瘢痕，失去正常功能。
自噬：是一种进化上保守的细胞过程，在调节机体能量和营养、维持机体能量代谢中起着至关重要的作用，通过降解溶酶体中受损的细胞器、异常的蛋白质聚集物和受损的DNA来维持细胞内稳态。大量研究表明，自噬在慢性纤维化肝病中表现异常活跃，自噬已被报道在肝纤维化的发生和发展中发挥重要调节作用，肝星状细胞自噬参与肝纤维化病理进展，抑制肝星状细胞自噬可延缓肝纤维化进程。

背景：自噬在肝纤维化中发挥重要作用，可以通过诱导肝星状细胞活化促进肝纤维化的进程。前期研究表明，柔肝降酶方具有保护肝功能、抗炎、抗氧化应激反应等作用，其是否通过自噬抗肝纤维化的作用机制尚未阐明。
目的：探讨柔肝降酶方含药血清对脂多糖诱导的人肝星状细胞活化及自噬的影响及其潜在的作用机制。
方法：用脂多糖建立人肝星状细胞活化模型，分成不同的处理组：①空白组：人肝星状细胞+空白血清；②模型组：人肝星状细胞+空白血清+脂多糖；③柔肝降酶方低、中、高剂量含药血清组：人肝星状细胞+低、中、高剂量柔肝降酶方含药血清+脂多糖；④柔肝降酶方高剂量含药血清联合雷帕霉素组：高剂量组基础上+雷帕霉素；⑤柔肝降酶方高剂量含药血清联合PI3K抑制剂组：高剂量组基础上+
LY294002。CCK-8法观察细胞增殖情况；采用单丹磺酰尸胺染色法观察细胞自噬情况；Western Blot检测细胞通路蛋白(PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR)、自噬相关蛋白(P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)、人肝星状细胞活化标志蛋白(α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原纤维)表达水平的影响。

结果与结论：①柔肝降酶方含药血清能够降低人肝星状细胞的增殖活性，下调Ⅰ型胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达，上调自噬P62蛋白的表达，降低LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的表达，且呈现剂量依赖性；②MDC荧光染色结果显示，柔肝降酶方含药血清可使细胞绿色斑点荧光强度降低；③加入自噬激动剂雷帕霉素后，P62蛋白表达降低，LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达升高；④经过柔肝降酶方含药血清处理后，PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平升高，呈剂量依赖性，这种作用能被PI3K抑制剂LY294002减弱；⑤提示柔肝降酶方含药血清可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制自噬，减少脂多糖诱导的人肝星状细胞活化。

https://orcid.org/0000-0003-2483-6091 (陶柏楠)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 柔肝降酶方, 细胞自噬, Akt, mTOR, LC3-Ⅱ, 人肝星状细胞

Abstract: BACKGROUND: Autophagy can play an important role in liver fibrosis by inducing the progression of hepatic stellate cell activation. Previous studies have shown that Rougan Jiangmei Formula could protect liver function, anti-inflammation, and anti-oxidative stress response. The mechanism of fighting liver fibrosis through autophagy has not been elucidated.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Rougan Jiangmei Formula medicated serum on activation and autophagy of human hepatic stellate cells induced by lipopolysaccharide and its underlying mechanism.
METHODS: Human hepatic stellate cell activation models were established using lipopolysaccharide and divided into various treatment groups: (1) Blank group: human hepatic stellate cells+blank serum; (2) model group: human hepatic stellate cells+blank serum+lipopolysaccharide; (3) low-, medium- and high-dose Rougan Jiangmei Formula medicated serum groups: human hepatic stellate cells+low-, medium- and high-dose Rougan Jiangmei Formula medicated serum+lipopolysaccharide; (4) high-dose Rougan Jiangmei Formula medicated serum combined with rapamycin group: based on high-dose group+rapamycin; (5) high-dose Rougan Jiangmei Formula medicated serum combined with PI3K inhibitor group: based on high-dose group+LY294002. Cell proliferation was observed by CCK-8 assay. The autophagy was observed by monodansylcadaverine staining. The effects of Rougan Jiangmei Formula medicated serum on the expression levels of cell pathway-related proteins (PI3K, P-PI3K, AKT, P-AKT, mTOR, P-mTOR), autophagy-related proteins (P62, Beclin-1, LC3-I, LC3-II), the activation marker protein of hepatic stellate cells (α-smooth-muscle actin and collagen I) were determined by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Rougan Jiangmei Formula medicated serum significantly reduced the proliferation of activated human hepatic stellate cells, down-regulated the protein expression of α-smooth-muscle actin and collagen I, up-regulated the expression of autophagy protein P62, and decreased the expression of Beclin-1 and LC3-II in a dose-dependent manner. (2) Monodansylcadaverine staining results exhibited that Rougan Jiangmei Formula medicated serum significantly inhibited the fluorescence intensity of the cell green spots. (3) After the addition of autophagy agonist rapamycin, the expression of autophagy protein P62 was reduced and the expression levels of Beclin-1 and LC3-II were increased. (4) After Rougan Jiangmei Formula medicated serum treatment, the phosphorylation levels of PI3K, Akt, and mTOR proteins were increased in a dose-dependent manner. This effect could be inhibited by the PI3K inhibitor LY294002. (5) It is indicated that Rougan Jiangmei Formula medicated serum may inhibit autophagy via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and then reduce lipopolysaccharide-induced human hepatic stellate cell activation.

Key words: Rougan Jiangmei Formula, cell autophagy, Akt, mTOR, LC3-II, human hepatic stellate cell

中图分类号:

陶柏楠, 王咏兰, 江露, 张宗星, 刘道忠, 万星, 黄德斌, 袁林. 柔肝降酶方含药血清抑制人肝星状细胞的活化及自噬[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5334-5341.

Tao Bonan, Wang Yonglan, Jiang Lu, Zhang Zongxing, Liu Daozhong, Wan Xing, Huang Debin, Yuan Lin. Rougan Jiangmei Formula medicated serum inhibits activation and autophagy of human hepatic stellate cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(33): 5334-5341.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析 40只SD大鼠分为空白组、柔肝降酶方低、中、高剂量组，每组10只，灌胃结束后均无死亡。
2.2 柔肝降酶方含药血清对脂多糖诱导的人肝星状细胞存活率的影响 CCK-8结果表明，脂多糖诱导后细胞存活率为135.92±6.43，与空白组相比，差异有显著性意义(P < 0.01)。柔肝降酶方低、中、高剂量含药血清组细胞的存活率均显著低于模型组 (P < 0.05或P < 0.01)，随柔肝降酶方含药血清剂量增高，细胞存活率显著下降，见图1。

2.3 柔肝降酶方含药血清对脂多糖诱导的人肝星状细胞形态学的影响显微镜下观察细胞形态结果显示，空白组细胞呈梭形或多边形，贴壁良好，无明显改变；模型组细胞大量增殖聚集，失去原有形态；柔肝降酶方低、中、高剂量含药血清组的细胞出现不同程度体积缩小，形态皱缩，密度变低，见图2。

2.4 柔肝降酶方含药血清对脂多糖诱导的人肝星状细胞Ⅰ型胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达水平的影响 Ⅰ型胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白是肝星状细胞活化的标志。人肝星状细胞激活是肝脏细胞外基质沉积的来源，肝星状细胞活化转化为肌成纤维细胞，表达Ⅰ型胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白等细胞外基质成分。与空白组相比，模型组Ⅰ型胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达均显著升高(P < 0.01)；与模型组相比，柔肝降酶方低、中、高剂量含药血清组的Ⅰ型胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达均显著降低(P < 0.05，P < 0.01)，呈剂量依赖性。与柔肝降酶方低剂量含药血清组相比，柔肝降酶方高剂量含药血清组Ⅰ型胶原纤维蛋白表达显著降低(P < 0.05)，柔肝降酶方中、高剂量含药血清组α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达均显著降低(P < 0.05，P < 0.01)；与柔肝降酶方中剂量含药血清组相比，柔肝降酶方高剂量含药血清组Ⅰ型胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白表达均显著降低(P < 0.05)。以上结果提示，柔肝降酶方含药血清对人肝星状细胞活化具有抑制作用，见图3。

2.5 柔肝降酶方含药血清对脂多糖诱导的人肝星状细胞自噬水平的影响
2.5.1 柔肝降酶方含药血清对人肝星状细胞自噬水平的影响 MDC染色是通过离子捕获以及与膜脂的特异性结合，从而对自噬体进行标记，染色后呈现绿色荧光，荧光强弱能够反映细胞的自噬水平。与空白组相比，模型组细胞绿色点状荧光亮度明显增强(P < 0.01)；与模型组相比，柔肝降酶方低、中、高剂量含药血清组的绿色荧光强度明显减弱(P < 0.01)，呈现出剂量依赖性，见图4。

2.5.2 柔肝降酶方含药血清对人肝星状细胞自噬相关蛋白表达水平的影响 Western blot检测结果显示，与空白组相比，模型组P62蛋白表达水平显著降低(P < 0.01)；与模型组相比，柔肝降酶方低剂量含药血清组P62蛋白表达水平与模型组无显著差异，柔肝降酶方中、高剂量含药血清组的P62蛋白表达水平显著升高(P < 0.01)。与空白组相比，模型组Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P < 0.01)；与模型组相比，柔肝降酶方低、中、高剂量含药血清组的Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著降低(P < 0.05，P < 0.01)，呈剂量依赖性。与柔肝降酶方低剂量含药血清组相比，柔肝降酶方中、高剂量含药血清组P62蛋白表达均显著升高(P < 0.01)，LC3-Ⅱ蛋白表达均显著降低(P < 0.05，P < 0.01)，柔肝降酶方高剂量含药血清组Beclin-1蛋白表达显著降低(P < 0.01)；与柔肝降酶方中剂量含药血清组相比，柔肝降酶方高剂量含药血清组P62蛋白表达显著升高(P < 0.01)，Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平均显著降低(P < 0.05，P < 0.01)。见图5。

2.6 柔肝降酶方含药血清通过抑制自噬减少脂多糖诱导的人肝星状细胞活化
2.6.1 柔肝降酶方含药血清联合自噬激动剂雷帕霉素对人肝星状细胞自噬的影响 MDC染色法检测结果显示，与空白组相比，模型组细胞绿色点状荧光亮度明显增强(P < 0.01)；与模型组相比，柔肝降酶方高剂量含药血清组的绿色荧光强度明显减弱(P < 0.01)；与柔肝降酶方高剂量含药血清组相比，柔肝降酶方高剂量含药血清联合自噬激动剂雷帕霉素组绿色荧光强度明显增强(P < 0.01)，见图6。

2.6.2 柔肝降酶方含药血清联合雷帕霉素对人肝星状细胞自噬相关蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示，与空白组相比，模型组P62蛋白表达水平显著降低(P < 0.01)，Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P < 0.01)；与模型组相比，柔肝降酶方高剂量含药血清组、柔肝降酶方高剂量含药血清联合雷帕霉素组的P62蛋白表达水平均显著升高(P < 0.05，P < 0.01)，Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平均显著降低(P < 0.05，P < 0.01)；与柔肝降酶方高剂量含药血清组相比，柔肝降酶方高剂量含药血清联合雷帕霉素组的P62蛋白表达水平显著降低(P < 0.05)，Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平均显著升高(P < 0.05)，见图7。

2.6.3 柔肝降酶方含药血清联合雷帕霉素对人肝星状细胞活化标志蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示，与空白组相比，模型组Ⅰ型胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达均显著升高(P < 0.01)；与模型组相比，柔肝降酶方高剂量含药血清组、柔肝降酶方联合雷帕霉素组的Ⅰ型胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达均显著降低(P < 0.05，P < 0.01)。与柔肝降酶方高剂量含药血清组相比，柔肝降酶方高剂量含药血清联合雷帕霉素组α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原纤维蛋白表达显著升高(P < 0.05，P < 0.01)，见图8。以上结果提示，柔肝降酶方含药血清能够抑制自噬来减少肝星状细胞的活化。

2.7 柔肝降酶方含药血清对脂多糖诱导的人肝星状细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响
2.7.1 柔肝降酶方含药血清对人肝星状细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响 Western blot检测结果显示，与空白组相比，模型组P-PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表达水平显著降低(P < 0.01)；与模型组相比，柔肝降酶方低、中、高剂量含药血清组的P-PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表达水平均显著升高(P < 0.05，P < 0.01)，呈剂量依赖性。与柔肝降酶方低剂量含药血清组相比，中、高剂量含药血清组P-PI3K蛋白表达显著升高(P < 0.01)，柔肝降酶方高剂量含药血清组P-Akt蛋白表达显著升高(P < 0.05)；与柔肝降酶方中剂量含药血清组相比，柔肝降酶方高剂量含药血清组P-PI3K、P-Akt蛋白表达均显著升高(P < 0.01，P < 0.05)。见图9。

2.7.2 柔肝降酶方含药血清联合LY294002对人肝星状细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响 Western blot检测结果显示，与空白组相比，模型组P-PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表达水平显著降低(P < 0.01)；与模型组相比，柔肝降酶方高剂量含药血清组、柔肝降酶方高剂量含药血清联合LY294002组的P-Akt、P-mTOR蛋白表达水平显著升高(P < 0.05，P < 0.01)；与柔肝降酶方高剂量含药血清组相比，柔肝降酶方高剂量含药血清联合LY294002组的p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平显著降低(P < 0.05，P < 0.01)，见图10。以上结果表明，柔肝降酶方含药血清抑制人肝星状细胞自噬与活化，与PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

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引言

肝纤维化是一种由病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝等多种病因引起的慢性肝损伤，肝细胞被反复破坏久之产生细胞外基质的沉积与异常分布的疾病[1]。肝纤维化病情逐渐进展，数年至数十年后可进展为肝硬化等危重病。肝纤维化具有可逆转性，因此，防治肝纤维化发展具有重要意义[2-3]。肝纤维化的发生发展机制复杂，一般来说，肝脏受到长期损伤驱动肝星状细胞激活，活化后的肝星状细胞大量转化为肌成纤维细胞，分泌细胞外基质，产生纤维性瘢痕[4-5]。因此，抑制肝星状细胞的激活是纤维化起始阶段的关键。
细胞自噬对于细胞应对各种应激条件以及维持稳态平衡至关重要，是一种在真核生物中高度保守的由溶酶体介导的胞内降解途径[6]。自噬在肝纤维化的进程中异常活跃，大量研究表明，自噬可以为肝星状细胞活化供能，来促进肝纤维化发生与发展，抑制肝星状细胞自噬可以阻止其活化，减轻肝纤维化[7-8]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路是一条经典的介导自噬的通路[9]，调节该通路可调控肝星状细胞自噬[10-11]。
柔肝降酶方是湖北民族大学附属民大医院内自制药剂，方中山楂主行气，散瘀血，消积滞；五味子入肝经，敛肝阴补肾固精；黄芪行气补气，既助山楂行气以散瘀，又补虚以扶正气；大枣味甘入脾，以达健脾，助运化积。全方共奏补虚扶正散积之功效，在临床中治疗肝损害性疾病具有良好的疗效。课题组前期研究表明，柔肝降酶方具有保护肝功能、上调血红加氧酶1水平、抗氧化、下调肝脏炎症反应等作
用[12-13]，但柔肝降酶方是否通过自噬抗肝纤维化的作用机制尚未阐明。因而，此次实验以人肝星状细胞为研究对象，就柔肝降酶方含药血清抗脂多糖诱导人肝星状细胞活化及自噬的作用及其潜在机制进行探讨。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验及指标检测，多组间比较满足正态分布及方差齐性时，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2022年5-10月在湖北民族大学风湿性疾病发生与干预湖北重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 动物和细胞雄性SPF级SD大鼠40只，体质量(200±20) g，由重庆医科大学实验动物房提供，许可证号：SCXK(渝)2018-003。控制室温为(22±2) ℃，湿度为(55±15) %，
饲养7 d后开始实验，严格按照实验动物3R原则给予人道关怀，实验动物操作已通过湖北民族大学动物伦理委员会批准(批准号：2022-043)。
HSC-LX2人肝星状细胞系购自上海歌凡生物科技有限公司。
1.3.2 药物与试剂柔肝降酶方由黄芪20 g、五味子10 g、山楂60 g、大枣20 g组成，购自湖北民族大学附属民大医院中药房，水煎剂浓缩至100 mL，质量浓度1 g/mL。黄芪(G03200111)，甘肃九州天润中药产业有限公司、五味子(B711073-01)，河北楚风中药饮片有限公司；山楂(21120105)，四川国强中药饮片有限公司；大枣(E2017110301)，麻城九州中药发展有限公司。
自噬激动剂雷帕霉素(53123-88-9)、PI3K抑制剂LY294002(HY-10108)，均购自MCE公司；脂多糖(L2880)，购自美国Sigma公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)，购自Beyotime公司；二抗羊抗兔(SA00001-2)、羊抗鼠(SA00001-1)、抗体P62(18420-1-AP)、LC3(18725-1-AP)、Beclin-1(11306-1-AP)、β-actin(66009-1-Ig)、mTOR(66888-1-Ig)，均购自美国Proteintech公司；抗体PI3K(CSB-RA578819A0HU)、P-PI3K(CSB-PA000712)，均购自CUSABIO公司；抗体p-mTOR(bs-3495R)，购自Bioss公司；抗体AKT(#4691)、P-AKT(#4060)，均购自美国CST公司；BCA试剂盒(KR0008)、ECL化学发光剂(KR0016)，均购自武汉科瑞公司；1640培养液(8120481)，购自美国Gibco公司；胎牛血清(SF202104)，购自广州汉强生物技术有限公司；0.25%胰蛋白酶消化液(CR2109105)，购自武汉赛维尔公司。
1.3.3 仪器超净工作台购自苏州安泰公司；电泳仪、转印仪统购自美国BIO-RAD公司；旋转蒸发仪购自郑州英宇裕华仪器有限公司；真空冷冻干燥机购自瑞士Buchi公司；倒置生物显微镜购自日本Olympus公司；超纯水制备系统购自上海乐枫生物科技有限公司；高压蒸汽灭菌锅购自日本SANYO公司；多功能酶标仪购自美国Thermo Scientific公司。
1.4 方法
1.4.1 含药血清的制备 40只SD大鼠按随机数字表法分为4组，每组10只，即空白组、柔肝降酶方低、中、高剂量组。空白组连续5 d给予10 mL/kg的生理盐水；根据人与大鼠体表面积换算，柔肝降酶方给药组大鼠分别灌胃柔肝降酶方 4.95 g/kg(0.5倍临床等效剂量)、9.9 g/kg(临床等效剂量)和19.8 g/kg(2倍临床等效剂量)，每天灌胃2次，每次间隔10 h，连续5 d。在第5天大鼠第一次灌胃给药2 h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，通过腹主动脉采集血样，室温静置保存0.5 h分离血清，4 ℃，3 500 r/min离心20 min。上层血清即为含药血清，然后在56 ℃水浴灭活30 min，用0.22 µm孔径过滤器过滤血清，过滤后，收集滤液并在-20 ℃下保存，用于后续的细胞实验。
1.4.2 细胞培养及分组人肝星状细胞常规培养于1640+体积分数10%胎牛血清+1%青链霉素培养液中，培养条件为37 ℃，体积分数5%CO2的培养箱。细胞生长到密度80%左右，使用0.25%胰蛋白酶消化传代，传代至3-5代，开始用于实验。当细胞生长到对数期时，细胞悬液接种在1×106/孔的6孔板中，换成无血清1640培养液继续培养24 h，使细胞同步化，将细胞分组加相应药物培养24 h，收集细胞进行蛋白印迹检测。细胞分为7组：①空白组：人肝星状细胞+10%空白血清；②模型组：人肝星状细胞+10%空白血清+1 μg/mL脂多糖；③柔肝降酶方低剂量含药血清组：人肝星状细胞+10%低剂量柔肝降酶方含药血清+1 μg/mL 脂多糖；④柔肝降酶方中剂量含药血清组：人肝星状细胞+10%中剂量柔肝降酶方含药血清+1 μg/mL脂多糖；⑤柔肝降酶方高剂量含药血清组：人肝星状细胞+10%高剂量柔肝降酶方含药血清+1 μg/mL脂多糖；⑥柔肝降酶方高剂量含药血清联合雷帕霉素组：人肝星状细胞+10%柔肝降酶方高剂量含药血清+1 μg/mL脂多糖+100 nmol/L雷帕霉素；⑦柔肝降酶方高剂量含药血清联合PI3K抑制剂组：人肝星状细胞+10%柔肝降酶方高剂量含药血清+1 μg/mL脂多糖+10 μmol/L LY294002。

1.4.3 CCK-8法检测人肝星状细胞增殖取对数生长期细胞，采用1640培养液将细胞悬浊液细胞个数调整为每孔1×104个，每组设6个复孔，接种于96孔板中培养过夜。空白组细胞用空白大鼠血清处理，低、中、高剂量的含药血清和1 μg/mL 脂多糖加入到培养基中干预24 h后，每个孔加入10 μL的CCK-8增强型溶液，继续放入培养箱内培养一两小时后，酶标仪450 nm处测定各孔吸光度(A)值，计算细胞存活率，以评估柔肝降酶方含药血清对细胞增殖的影响。各个剂量重复3次。细胞存活率=(药物干预组A值-空白组A值)/(空白组A值-空白组A值)×100%。

1.4.4 单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色检测人肝星状细胞自噬取对数生长期细胞，采用1640培养液将细胞悬浊液细胞个数调整为每孔1×106个，接种于内置有无菌玻片的6孔板中，培养24 h后，在37 ℃的水浴中加入0.05 mmol/L MDC避光染色15 min，PBS洗涤3次，取出玻片置于载玻片上。然后应用荧光显微镜观察，避光，拍照。

1.4.5 Western blot法检测人肝星状细胞的PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白(PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR)、自噬相关蛋白(P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)、人肝星状细胞的活化标志蛋白(α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原纤维)表达水平弃去培养液，使用PBS清洗3遍以排除血清干扰，6孔板中每孔加入250 μL含有1%苯甲磺酰氟蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，获得人肝星状细胞蛋白裂解液。在4 ℃下，12 000 r/min离心15 min后，收集上清，然后用蛋白浓度测定试剂盒定量蛋白量。然后将蛋白样品与4倍十二烷基硫酸钠蛋白装载缓冲液混合，在100 ℃沸水变性蛋白10 min。等量的变性蛋白在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上通过蛋白印迹分离，并立即转印到PVDF膜上。接下来，将PVDF条带在含5%脱脂奶粉TBST中孵育1 h，取出封闭液，TBST洗3次，孵育特异性一抗，在4 ℃下过夜，取出一抗，TBST洗3次，孵育二抗(1∶2 000稀释)，在室温下孵育至少1 h。最后用增强化学发光液与二抗结合，于显影成像系统检测免疫反应性条带。
1.5 主要观察指标 ①柔肝降酶方含药血清对脂多糖诱导活化的人肝星状细胞的影响：通过显微镜观察细胞形态变化，CCK-8法检测细胞增殖情况，Western Blot测定Ⅰ型胶原纤维、α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达情况。②柔肝降酶方含药血清通过调节自噬减少脂多糖诱导的人肝星状细胞活化，并加入自噬激动剂雷帕霉素进一步证明：MDC染色通过荧光强度观察自噬水平，Western Blot测定自噬蛋白P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表达水平。③柔肝降酶方含药血清调节自噬，减少人肝星状细胞活化与PI3K/Akt/mTOR信号通路有关，加入PI3K抑制剂LY294002进一步反证这一现象：Western Blot测定PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR的表达水平。
1.6 统计学分析采用Image J软件进行图片分析，使用SPSS 21.0软件包进行结果分析，结果用x±s表示。多组间比较满足正态分布及方差齐性时，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；不满足方差齐性检验时，采用非参数检验(Kruskal-Wallis)进行两两比较，且用Bonferroni校正检验调整显著性值。以P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已经由湖北民族大学生物统计学专家审核。

讨论

肝纤维化是一种肝脏对各种刺激可逆的伤口愈合反应，是大多数慢性肝病的主要特征，其特征是过量细胞外基质积累[14]。其机制主要由于肝细胞受到外界刺激，导致肝星状细胞的激活，激活的星状细胞不断转化为成纤维细胞，导致肝细胞外基质的过度增生和沉积，从而产生一系列炎症反应等过程，所以肝星状细胞的活化是肝纤维化发生、发展的核心环节[15]。在健康的肝脏中肝星状细胞活力低，仅有贮藏维生素A的功能[16]。在肝纤维化的过程中，静止的肝星状细胞被激活后，增殖存活率急速上升，并且大量转化为肌成纤维细胞，表现为细胞外基质的沉积，表达Ⅰ型胶原纤维以及α-平滑肌肌动蛋白等蛋白[17]。抑制肝星状细胞的活化被认为是抗肝纤维化治疗的重要策略[18]。
中医领域根据肝纤维化临床的表现，将其列为治疗过程中的“胁痛”“臌胀”“黄疸”“积聚”等病理学范畴。《医宗必读》云：“积之成也，正气不足，而后邪气踞之。”在致病因素中，既包括六淫、疫毒痰瘀、饮食劳倦等外因，又包括正气亏虚、七情内伤等内因。但基本病机为正虚邪盛，邪毒久稽，肝络受损，气滞血瘀，归纳为‘虚损生积’[19]，其中‘虚损’主要表现在脾气虚、肝气虚和肝肾阴精虚损等方面，气虚则反映了机体功能的损伤与降低，而肝肾阴精虚损则指肝脏形质损伤，致使肝脏失荣，肝络受损；“积”主要表现为邪毒积聚、气滞血瘀，致使肝络瘀阻，痹阻胁络。基于此理论基础，作者所在课题组提出补虚扶正散积法治疗肝纤维化，并根据临床实践柔肝降酶方作为院内制剂，方中山楂主行气，散瘀血，消积滞；五味子入肝经，敛肝阴补肾固精；黄芪行气补气，既助山楂行气以散瘀，又补虚以扶正气；大枣味甘入脾，以达健脾，助运化积。全方共奏补虚扶正散积之功效，在临床中治疗肝纤维化具有良好的疗效。作者所在课题组前期相关研究表明，柔肝降酶方能够调节α-谷氨酰转肽酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶的分泌水平改善肝功能，减轻炎症反应，减少氧化应激反应，上调血红加氧酶1表达水平降低氧化损伤，发挥对肝损害的防治作用[12-13]。
脂多糖作为一种炎症物质，主要产生于革兰阴性菌的细胞壁，常用于诱导各种炎症损伤模型[20]。既往研究表明，在肝纤维化的发展过程中，脂多糖可以间接或直接刺激人肝星状细胞的激活，诱导细胞外基质成分的表达[21-22]，因此，脂多糖被广泛用于诱导肝星状细胞的活化，建立体外肝纤维化模型[23-26]。在此次研究中，成功建立脂多糖诱导的人肝星状细胞系HSC-LX2活化模型，使用1 μg/mL 脂多糖诱导人肝星状细胞后，表现为细胞存活率急剧上升，Ⅰ型胶原纤维和α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达明显升高，细胞大量活化。
自噬是一种进化上保守的细胞过程，通过形成双层膜的自噬体包裹胞质中的待降解组分，降解受损的细胞器、异常的蛋白质聚集物和受损的DNA来维持细胞内稳态[27]。在自噬起始阶段中，游离的双层膜结构的自噬吞噬泡首先形成，这个过程由ULK1(Uncoordinat-51-like kinase1)激酶磷酸化Beclin1进而激活脂酶和PIK3C3/VPS34复合体来启动，Beclin1常被视为自噬起始阶段复合体形成的标志蛋白[28]。吞噬泡形成后开始不断延伸，微管蛋白1轻链3(MAP1-LC3/LC3/Atg8)的前体分子被ATG4B切割剪去C端的5肽，裂解形成胞质形式LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺通过Atg7和Atg3反应与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ，形成膜结合形式LC3-Ⅱ，附着到自噬体的膜上，使自噬体膜逐渐延伸，直至形成一个包裹着细胞降解物的自噬小体。LC3-Ⅱ被视为自噬小体形成的标志物，LC3-Ⅱ的表达常用来衡量自噬水平[29]。自噬小体形成后，与溶酶体结合，形成自噬溶酶体。在自噬溶酶体与降解底物结合的P62被蛋白水解酶降解，完成泛素化底物降解，P62的增多代表自噬受阻，减少代表自噬流畅[30]。自噬在慢性纤维化肝病中表现异常活跃，自噬已被报道在肝纤维化的发生和发展中发挥重要调节作用，抑制过度自噬可减轻肝纤维化[31-32]。
在此次研究中，脂多糖诱导后，人肝星状细胞存活率显著上升，Ⅰ型胶原纤维和α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达显著升高，自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ表达显著升高，P62蛋白表达显著降低，表明活化后的细胞自噬过度增加。柔肝降酶方含药血清干预后，细胞存活率显著下降，Ⅰ型胶原纤维和α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达显著降低，自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ表达显著降低，P62蛋白表达显著升高。为进一步明确柔肝降酶方含药血清能够通过抑制自噬来减少人肝星状细胞活化的作用，加入自噬激动剂雷帕霉素后，柔肝降酶方含药血清对细胞的活化抑制作用减弱，Ⅰ型胶原纤维和α-平滑肌肌动蛋白的蛋白表达水平显著上升，细胞自噬增加。由此可见，柔肝降酶方含药血清可能是通过抑制细胞的过度自噬，起到减少肝星状细胞活化的作用。
mTOR是调节自噬的核心蛋白，对自噬有双向调节作用[33]。PI3K/Akt/mTOR所组成的信号通路是哺乳动物最重要的细胞内信号通路之一，对多种重要生理功能至关重要，包括转录、翻译、增殖、生长和存活[34]。受上游生长因子、细胞因子等刺激物影响，p85/p110异源二聚体通过构象变化选择性转运到质膜并随后被激活，随后PI3K会磷酸化膜肌醇脂质，产生第二信使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，反过来招募其他一些蛋白质到细胞膜上，如磷酸肌醇依赖性激酶1和丝氨酸苏氨酸激酶Akt，也称为蛋白激酶B(PKB)，使Akt蛋白上的苏氨酸磷酸化位点(Thr308)和丝氨酸磷酸化位点(Ser473)磷酸化而使其激活。Akt作为一种磷酸化关键分子，通过与溶酶体蛋白2结合，参与抑制自噬体形成和溶酶体积累，Akt是定位溶酶体的核心溶酶体蛋白，可以直接磷酸化mTOR，也可以通过失活结节性硬化复合物2，然后增强mTOR的激活。mTOR作为自噬的负反馈蛋白，在调节细胞自噬方面发挥关键作用[35]，当mTOR磷酸化增强，可与ULK1第757丝氨酸(Ser757)和第637丝氨酸(Ser637)结合，抑制ULK1的促自噬活性[36]。当mTOR活性被抑制，于是与ULK1分离，因此，ULK1特定位点的磷酸化被解除，ULK1复合物通过处自磷酸化而变得活跃，随后转移到内质网的隔离膜上，自噬被启动。大量研究表明，PI3K/Akt/mTOR信号通路通过调节自噬，减少肝星状细胞的活化，因此，该信号通路对抑制肝纤维化的发生发展起到至关重要的作用[37-39]。
在此次研究中，脂多糖诱导后，人肝星状细胞的P-PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表达显著降低，PI3K/Akt/mTOR信号通路受到抑制。柔肝降酶方含药血清能够显著上调P-PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表达，PI3K抑制剂LY294002能够减弱柔肝降酶方含药血清上调P-PI3K、P-Akt、P-mTOR蛋白表达的作用，故此次研究得出结论，柔肝降酶方含药血清能够抑制人肝星状细胞的活化、抑制自噬，可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。柔肝降酶方含药血清抑制人肝星状细胞活化的机制可能是通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路介导的自噬途径来实现的。
综上所述，柔肝降酶方含药血清可能通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制自噬，起到抑制人肝星状细胞活化的作用。由于此次研究仅为细胞实验，且自噬的判断机制十分复杂，作者所在课题组后期将进行体内实验，进一步研究柔肝降酶方抗肝纤维化的机制，为柔肝降酶方的临床运用提供依据和方向。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

柔肝降酶方含药血清抑制人肝星状细胞的活化及自噬

Rougan Jiangmei Formula medicated serum inhibits activation and autophagy of human hepatic stellate cells

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