室旁核硫化氢对高盐诱导高血压模型大鼠PI3K/Akt通路及血压的影响

doi:10.12307/2023.188

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (26): 4168-4174.doi: 10.12307/2023.188

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室旁核硫化氢对高盐诱导高血压模型大鼠PI3K/Akt通路及血压的影响

张东东1，2，谷青芸1，2，尤清欣1，2，金颖新1，2，张嘉倪1，2，王浩然1，2，王凤月1，2，陈淑月1，2，苏嘉璐1，2，梁衍锋1，2

佳木斯大学，1基础医学院，2微生态-免疫调节网络与相关疾病重点实验室，黑龙江省佳木斯市 154007

收稿日期:2022-03-17 接受日期:2022-06-13 出版日期:2023-09-18 发布日期:2023-01-28
通讯作者: 梁衍锋，博士，副教授，佳木斯大学，基础医学院，微生态-免疫调节网络与相关疾病重点实验室，黑龙江省佳木斯市 154007
作者简介:张东东，男，1977年生，黑龙江省密山市人，汉族，2010年佳木斯大学基础医学院毕业，硕士，副教授，主要从事高血压的中枢机制研究。
基金资助:
黑龙江省自然科学基金项目(LH2021H103)，项目负责人：梁衍锋；黑龙江省省属高等学校基本科研业务费项目(2019-KYYWF-1339)，项目负责人：梁衍锋；黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(202010222056)，项目负责人：张嘉倪

Effects of hydrogen sulfide in paraventricular nuclei on PI3K/Akt pathway and blood pressure in high salt-induced hypertensive rats

Zhang Dongdong1, 2, Gu Qingyun1, 2, You Qingxin1, 2, Jin Yingxin1, 2, Zhang Jiani1, 2, Wang Haoran1, 2, Wang Fengyue1, 2, Chen Shuyue1, 2, Su Jialu1, 2, Liang Yanfeng1, 2#br#

1School of Basic Medicine, 2Key Laboratory of Microecology-Immune Regulation Network and Related Diseases, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China

Received:2022-03-17 Accepted:2022-06-13 Online:2023-09-18 Published:2023-01-28
Contact: Liang Yanfeng, MD, Associate professor, School of Basic Medicine, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China; Key Laboratory of Microecology-Immune Regulation Network and Related Diseases, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China
About author:Zhang Dongdong, Master, Associate professor, School of Basic Medicine, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China; Key Laboratory of Microecology-Immune Regulation Network and Related Diseases, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Heilongjiang Province, No. LH2021H103 (to LYF); Fundamental Research Foundation for Heilongjiang Provincial Universities, No. 2019-KYYWF-1339 (to LYF); Heilongjiang University Student Innovation and Entrepreneurship Training Plan, No. 202010222056 (to ZJN)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

室旁核：紧贴第三脑室，位于下丘脑内侧区，视上核的背、尾侧，由核发出的室旁垂体束可以到达垂体后叶。室旁核是调控和整合心血管活动及交感神经的重要中枢核团，而交感神经活动增强是促进高血压发生发展的外周效应机制。
PI3K/Akt通路：磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是由调节亚基p85和催化亚基p110构成的异源性二聚体，具有催化磷脂酰肌醇环3位羟基磷酸化的活性。蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)是一种丝氨酸/苏氨酸(serine/threonine，Ser/Thr)蛋白激酶，其结构包括结构域、催化域及调节域，其中调节域含有磷酸化位点Ser473，该位点的磷酸化是Akt完全活化所必需的。PI3K/Akt信号通路是哺乳动物最重要的细胞内信号通路之一，在调控各种不同细胞功能(包括代谢、炎症、氧化应激、生长以及蛋白质合成等方面)发挥重要作用，并与高血压等疾病有关。

背景：室旁核是心血管调节中枢，其对外周交感神经和血压的调控起着重要作用。硫化氢(H2S)作为一种新型气体信号分子，具有抗炎、抗氧化等作用，其合成酶在室旁核存在表达，其在高血压的作用机制仍需进一步研究。
目的：研究室旁核H2S对高盐诱导的高血压大鼠血压、外周交感神经活动及室旁核PI3K/Akt通路的影响，探讨其在高血压中的作用及中枢机制。
方法：雄性Dahl盐敏感性大鼠40只，随机分为4组：正常对照组、正常干预组、高盐模型组和高盐干预组，2个高盐组大鼠给予高盐饲料喂养4周，每周用尾动脉血压测量仪监测大鼠血压。4周后，干预组大鼠双侧室旁核通过微型渗透泵持续注射H2S缓释剂GYY4137，正常对照组和高盐模型组均给予等量人工脑脊液。干预6周后取材，ELISA法检测血浆去甲肾上腺素和室旁核H2S水平，Western blot、免疫组化法检测室旁核中的PI3K-p85、p-Akt和t-Akt的蛋白表达。

结果与结论：①与正常对照组相比，高盐模型组的平均动脉压、血浆去甲肾上腺素水平明显升高(P < 0.01)；与高盐模型组相比，高盐干预组平均动脉压、去甲肾上腺素水平明显下降(P < 0.01)；②与正常对照组相比，高盐模型组室旁核中PI3K-p85和p-Akt的蛋白表达明显升高(P < 0.01)；与高盐模型组相比，高盐干预组室旁核中PI3K-p85和p-Akt的蛋白表达明显下降(P < 0.01)；③以上结果表明，室旁核H2S在高盐诱导的高血压中具有抑制外周交感神经活动、降低血压的作用，其在降低血压时可明显抑制室旁核PI3K/Akt通路，这将为高血压的临床治疗寻找新的靶点，并为新药开发奠定了理论基础。

https://orcid.org/0000-0003-4765-4362(张东东)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 硫化氢, 高血压, 室旁核, PI3K/Akt通路, 去甲状腺素, 模型, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: The paraventricular nucleus is the center of cardiovascular regulation, which plays an important role in the regulation of peripheral sympathetic nerves and blood pressure. As a new type of gas signal molecular, hydrogen sulfide has anti-inflammatory and anti-oxidation effects. And the synthetase of hydrogen sulfide is expressed in the paraventricular nucleus. The mechanism of hydrogen sulfide in hypertension needs to be studied.
OBJECTIVE: To study the effects of hydrogen sulfide in the paraventricular nucleus on blood pressure, peripheral sympathetic nerve activity and PI3K/Akt pathway in high salt-induced hypertensive rats and to explore the mechanism of hydrogen sulfide in hypertension.
METHODS: Forty male Dahl rats were randomly divided into four groups: normal control group, normal intervention group, high-salt model group and high-salt intervention group. The rats in the two high-salt groups were fed high-salt diet for 4 weeks. The blood pressure of each rat was monitored by the caudal artery every week. After 4 weeks, the rats in the intervention groups were injected with GYY4137 in the bilateral paraventricular hypothalamic nucleus through a micro osmotic pump. Rats in the normal control group and the high-salt model group were given the same amount of artificial cerebrospinal fluid. After 6 weeks, the levels of plasma norepinephrine and hydrogen sulfide in the paraventricular nucleus were detected by ELISA, and the expressions of PI3K-p85, p-Akt and t-Akt in the paraventricular nucleus were detected by western blot and immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal control group, the levels of mean arterial pressure and plasma norepinephrine were significantly increased in the high-salt model group (P < 0.01). Compared with the high-salt model group, the levels of mean arterial pressure and plasma norepinephrine were significantly decreased in the high-salt intervention group (P < 0.01). Compared with the normal control group, the expressions of PI3K-P85 and p-Akt in the paraventricular nucleus were significantly increased in the high-salt model group (P < 0.01). Compared with the high-salt model group, the expressions of PI3K-P85 and p-Akt were significantly decreased in the high-salt intervention group (P < 0.01). These results suggest that hydrogen sulfide in the paraventricular nucleus can inhibit the peripheral sympathetic nerve activity and lower the blood pressure after high salt-induced hypertension. When the blood pressure is decreased by hydrogen sulfide, the PI3K/Akt pathway in the paraventricular nucleus can be significantly inhibited, which will lay a theoretical foundation for finding new targets and developing new drugs for the clinical treatment of hypertension.

Key words: hydrogen sulfide, hypertension, paraventricular nucleus, PI3K/Akt pathway, norepinephrine, model, rat

中图分类号:

张东东, 谷青芸, 尤清欣, 金颖新, 张嘉倪, 王浩然, 王凤月, 陈淑月, 苏嘉璐, 梁衍锋. 室旁核硫化氢对高盐诱导高血压模型大鼠PI3K/Akt通路及血压的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4168-4174.

Zhang Dongdong, Gu Qingyun, You Qingxin, Jin Yingxin, Zhang Jiani, Wang Haoran, Wang Fengyue, Chen Shuyue, Su Jialu, Liang Yanfeng. Effects of hydrogen sulfide in paraventricular nuclei on PI3K/Akt pathway and blood pressure in high salt-induced hypertensive rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(26): 4168-4174.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析实验初期选用45只Dahl盐敏感大鼠，手术后死亡9只，剩正常对照组10只，正常干预组8只，高盐模型组9只，高盐干预组9只，为保证每组10只大鼠，又陆续选取8只大鼠，术后死亡4只，统计时剔除死亡大鼠，最终样本量为40只。
2.2 平均动脉压的变化经过2周的适应性测压训练再给予高盐饮食4周后，高盐模型组大鼠平均动脉压明显升高并持续上升，第4周达到造模标准(平均动脉压≥120 mmHg)。与正常对照组相比，差异有显著性意义(P < 0.01)；从第4周末开始，在大鼠双侧PVN内微量注射GYY4137后，高盐干预组大鼠平均动脉压明显下降，与高盐模型组相比，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图1。

2.3 血浆中的去甲肾上腺素水平图2为慢性给予PVN注射GYY4137对大鼠外周血血浆去甲肾上腺素水平的影响，结果显示，与正常对照组相比，高盐模型组血浆去甲肾上腺素水平明显升高(P < 0.01)；与高盐模型组相比，双侧PVN内微量注射GYY4137的高盐干预组血浆去甲肾上腺素水平明显下降(P < 0.01)。

2.4 PVN中H2S水平图3为慢性给予PVN注射GYY4137对大鼠室旁核H2S水平的影响，结果显示，与正常对照组相比，高盐模型组大鼠PVN中H2S水平明显下降(P < 0.01)；与高盐模型组大鼠相比，高盐干预组大鼠PVN中H2S水平明显升高(P < 0.01)。

2.5 PI3K-p85的蛋白表达图4免疫组化染色和图5Western blot检测慢性给予PVN注射GYY4137对大鼠室旁核PI3K-p85阳性细胞及蛋白表达的影响。结果显示，与正常对照组相比，高盐模型组大鼠PVN中PI3K-p85的蛋白表达明显升高(P < 0.01)；与高盐模型组大鼠相比，双侧PVN内微量注射GYY4137的高盐干预组PI3K-p85的蛋白表达明显下降(P < 0.01)。

2.6 Akt的蛋白表达图6免疫组化染色和图7 Western blot检测慢性给予PVN注射GYY4137对大鼠室旁核p-Akt阳性细胞及蛋白表达的影响。结果显示，与正常对照组相比，高盐模型组大鼠PVN中p-Akt的蛋白表达明显升高(P < 0.01)；与高盐模型组大鼠相比，双侧PVN内微量注射GYY4137的高盐干预组p-Akt的蛋白表达明显下降(P < 0.01)。

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引言

高血压是常见的慢性病之一，也是导致心脑血管疾病的主要危险因素。据统计，脑卒中、冠心病等心脑血管疾病已成为中国居民死亡的首要原因[1]。因此，高血压的防治也越来越受到重视。但由于高血压的发病机制复杂，其临床治疗效果仍不甚理想。根据最新《中国心血管健康与疾病报告2019》统计显示，国人的人均用盐水平可达到 10.5 g/d，这与 WHO 对每日钠盐摄入量在 6 g 以下的建议相去甚远，且各种膳食因素中高钠摄入对高血压的影响最大[1]。因此，此次研究选择了高盐诱导的高血压模型并进一步深入研究其发生机制。以往对于高血压的研究主要集中在外周调控机制上，随着近年来研究的深入，高血压的中枢机制也越来越受到广泛重视。下丘脑室旁核(paraventricular hypothalamic nucleus，PVN)与脊髓中间外侧柱、孤束核和延髓头端腹外侧区存在广泛联系，其在机体自主调节中起着重要的作用，是心血管活动调节的整合中枢[2]，对外周交感神经活动和血压的调节具有十分重要的作用。因此深入研究PVN对血压及外周交感神经活动的调控及影响机制，不仅补充了高血压发病的中枢机制，更能为高血压在中枢上的治疗提供理论依据。
硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是继一氧化氮和一氧化碳之后发现的第3种内源性气体信号分子，它可以跨越血脑屏障，直接影响中枢神经系统。研究发现，H2S具有抗炎、抗氧化和抑制肾素合成和释放等作用，其在调节神经免疫活动以及降低血压中具有重要的作用[3]。GYY4137是一种水溶性的H2S缓释供体，能够更好地模拟生理情况下H2S的释放，在外源性H2S研究中被广为使用。作者前期研究也通过向PVN中注射GYY4137发现，内源性或外源性H2S可以通过抑制PVN中的氧化应激和炎症，调节交感神经活动和血压[4]，但其降低血压的具体通路尚不清楚。
磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B，PI3K/Akt)信号传导通路是哺乳动物最重要的细胞内信号通路之一，在调控细胞代谢、炎症、氧化应激、生长以及蛋白质合成等方面发挥重要作用[5]。而且，PI3K/Akt信号通路对高血压中交感神经兴奋也具有调控作用[6]。因此，基于H2S的抗炎和抗氧化作用以及PVN炎症和氧化应激与高血压的关系，此次实验通过对高盐诱导的高血压大鼠PVN中注射H2S缓释供体GYY4137，观察室旁核H2S对该区域PI3K/Akt信号通路以及外周交感神经活动和血压的影响，探讨室旁核H2S抗高血压的作用信号通路，从而为高血压的临床治疗提供新的思路和治疗靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2020年9至2021年10月在佳木斯大学生命科学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 主要试剂和仪器 H2S供体GYY4137 (美国Sigma-Aldrich公司)；PI3K-p85α兔多克隆抗体、Akt兔单克隆抗体、p-Akt兔单克隆抗体(上海碧云天生物科技公司)；GAPDH鼠单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司)；BCA试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、多聚体抗兔IgG-HRP两步法免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；脑蛋白提取试剂盒、PMSF(陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司)；微型渗透泵 2006(美国ALZET 公司)；稳压稳流电泳仪EPS-300、化学发光成像系统Tanon 4800(上海天能科技有限公司)；大鼠立体定位仪MP-8003(深圳瑞沃德公司)；高速冷冻离心机Beckman® Allegra X-64R(美国贝克曼库尔克公司)；全自动多功能酶标仪BioTek® SynergyHT(美国博腾公司)；生物显微镜Leica DM4000B(德国徕卡公司)。
1.3.2 动物饲养健康成年雄性Dahl盐敏感性大鼠53只，体质量250-275 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2002-0003。保持温度(23±2) ℃和全天候正常的自然光照(12 h昼夜节律)，自由饮水及进食。所有实验程序均经佳木斯大学科研伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.3 人工脑脊液配方 KCl 0.224 g，NaCl 8.66 g，MgCl2·6 H2O 0.163 g，CaCl2 0.206 g溶于500 mL三蒸水；Na2HPO4·2H2O 0.028 g，Na2HPO4·12H2O 0.214 g 溶于500 mL三蒸水中，将两种液体混合后pH值调整为7.4。
1.4 方法
1.4.1 动物分组及模型制备将大鼠随机分为正常对照组、正常干预组、高盐模型组和高盐干预组，每组10只，适应性喂养和适应性测量血压2周后开始造模。分别饲喂正常盐饲料(NS，0.3%NaCl，即普通饲料，由佳木斯大学动物实验中心提供)和高盐饲料(HS，8%NaCl，由佳木斯大学动物实验中心提供散料，计算后混入高盐溶液烘干成团)，高盐饲料喂养4周，并监测大鼠血压值。

1.4.2 PVN给药动物模型制备结束后，各组大鼠用乙酰丙嗪(10 mg/kg)和盐酸氯胺酮(80 mg/kg)经腹腔注射麻醉，将大鼠头部固定于脑立体定位仪中，备皮消毒后剪开头皮，暴露出前囟和后囟以便确定位置，根据脑立体定位图谱进行双侧PVN插管，以前囟为基点后移1.8 mm，再外移0.4 mm，插管深度为7.9 mm，然后将插管固定在颅骨上，并与已经注入药物的微型渗透泵相连，然后将微型渗透泵植入颈后皮下，持续给药6周。给药期间高盐模型组和高盐干预组大鼠仍继续饲喂高盐饲料。正常干预组和高盐干预组大鼠通过渗透泵给予溶解于人工脑脊液中的H2S缓释剂GYY4137(2 nmol 99.2nL/h)，正常对照组和高盐模型组均给予人工脑脊液(99.2 nL/h)。

1.4.3 平均动脉压测量和样本收集实验用BP-100大鼠尾动脉血压测量仪(四川成都泰盟科技有限公司)每周监测大鼠的血压。实验中为了减少应激对实验结果的影响，在正式的测量之前，对所有大鼠先进行为期2周的适应性训练。将保温箱温度控制在38 ℃，固定大鼠，将阻断器、传感器套于大鼠尾部，当出现脉搏图像时将箱体温度调至 32 ℃，等大鼠适应环境后开始给大鼠尾部加压。在达到一定压力后，阻断器会自动减压，直至出现波动，记录为收缩压，继续减压，会出现另一个波峰，记录为舒张压，测出这2个值后进行计算，平均动脉压=(收缩压+舒张压X2)/3。每只大鼠重复测量8次计算后取平均值作为大鼠的平均动脉压，持续测10周(每周测量1次)。平均动脉压≥120 mmHg视为高血压造模成功。麻醉后处死大鼠，收集血液和脑组织，用显微解剖的方法分离出大鼠双侧PVN组织，保存在-80 ℃，直至检测。
1.4.4 样本收集最后一次血压测量后取材，采集血浆样品并储存在-80 ℃下。随机选取每组大鼠各4只，在全麻下取仰卧位，解剖开胸腹壁充分暴露心脏，用注射针头刺入其左心室尖部，止血钳固定注射针头，将0.1 mol/L PBS和40 g/L多聚甲醛依次加入输液器，直至其四肢、头颈和尾部变硬后取脑，立即浸入40 g/L多聚甲醛中1 h，再放入30%蔗糖中2 d固定。固定后用自来水冲洗5 min，过梯度乙醇脱水，二甲苯透明，然后经浸蜡和包埋后，于超薄切片机切片。其余每组大鼠各6只，全麻下断头取脑，在冰盘上迅速分离取出两侧PVN组织，迅速浸没在液氮中，然后在-80 ℃下保存，用于后续检测。
1.4.5 ELISA法检测血浆去甲肾上腺素和室旁核H2S的水平根据说明，将标准品和样品进行稀释，转移到加有特异性抗体的96孔板上，然后在37 ℃下孵育后洗涤，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的显色剂，37 ℃孵育并再次洗涤，依次加入显色液、停止液以终止反应，然后使用酶标仪测定450 nm波长处的吸光度(A)，绘制标准曲线并计算样品浓度。
1.4.6 免疫组化检测室旁核PI3K-p85和p-Akt阳性细胞表达对各组大鼠的脑组织进行免疫组化分析。大鼠取脑组织前用40 g/L甲醛进行体内固定再取脑，并经40 g/L甲醛再次固定，自来水冲洗30 min，依次过梯度乙醇进行脱水，再经二甲苯透明、浸蜡和包埋后制作2 µm厚的切片。石蜡切片脱蜡至水，再经0.3%甲醇过氧化氢孵育10 min，枸橼酸钠抗原修复液修复20 min，取出后放在盒内冷却至室温，再入PBS内冲洗3次，每次5 min；滴加封闭液37 ℃孵育30 min，滴加一抗4 ℃过夜(PI3k和p-Akt 的一抗浓度均为 1∶100)。第2天取出复温后，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加二抗，37 ℃孵育30 min。再次用PBS冲洗，DAB 显色，脱水透明，封固，每张切片在400倍视野下随机选取3个中心视野拍摄图像，显微镜下观察拍照，再用图像分析软件Image Pro Plus 6.0进行分析，测量参数选用目标蛋白免疫反应阳性面积(Area)表示目标蛋白免疫阳性反应范围；积分吸光度(IA)表示室旁核组织目标蛋白的免疫阳性反应程度；平均吸光度表示单位面积内室旁核组织目标蛋白的免疫阳性反应水平(平均吸光度 =积分吸光度/阳性面积)，并用平均吸光度值探讨各组大鼠室旁核组织相关蛋白的表达变化。
1.4.7 蛋白免疫印迹(Western blot)法检测室旁核PI3K-p85、Akt、p-Akt的蛋白表达取室旁核组织按比例加入预冷的蛋白裂解液进行超声裂解，4 ℃，12 000 r/min，离心15 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度后调整为均一浓度，加入适量上样缓冲液后-80 ℃冰箱冻存。按照凝胶试剂盒制胶，将蛋白样品5 μL(10 g/L)和预染Marker按顺序依次加入梳孔，连接电源电泳至蛋白完全分离。湿转法转膜，37 ℃下封闭1 h，p-Akt应用5% BSA封闭，PI3k和Akt应用5%脱脂奶粉封闭，加一抗(PI3k和Akt浓度均为 1∶1 500，p-Akt浓度为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。第2天复温后，用TBST洗3次，每次10 min，加二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，根据化学发光底物检测试剂盒比例配置好曝光液，均匀铺满整张膜，放入曝光机进行曝光。曝光后获得的蛋白条带应用Image J 软件分析各组蛋白条带的灰度值，并计算目的蛋白的相对表达量。
1.5 主要观察指标 ①平均动脉压；②血浆去甲肾上腺素水平；③室旁核H2S水平；④室旁核PI3K-p85、Akt、p-Akt的蛋白表达。
1.6 统计学分析结果数据用x±s表示，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析及turkey’s事后检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经佳木斯大学公共卫生学院统计学专家审核。

讨论

高盐诱导的高血压发病机制复杂，有报道称其发生发展与肾素-血管紧张素系统激活、外周交感神经活动增强、血管炎症反应等多种因素密切相关[7]。近些年研究表明，高盐诱导的血压升高与中枢神经的调控也是密不可分的，尤其是中枢核团的作用。PVN和延髓头端腹外侧区(rostral ventrolateral medulla，RVLM)可通过调节雌激素受体β亚单位的表达影响醛固酮或高盐诱导的高血压[8]。高血压前期Dahl盐敏感大鼠的孤束核(NTS)中调节钠食欲的神经元大约增加20%，这些神经元可能在高盐诱导的高血压中发挥着重要作用[9]。而且，越来越多的研究表明PVN的炎症和氧化应激等也是促进盐敏感性高血压的重要机制[10-11]。作者前期研究发现，PVN中H2S在高盐诱导的高血压中可明显抑制室旁核的炎症反应和氧化应激，但其对高血压影响的信号通路尚不明确[4]。
H2S是一种新型气体信号分子，已被证实具有抗氧化、抗炎、神经调节等功能，并与心血管疾病密切相关[12]。此次研究发现，高盐诱导的高血压发生时，外周血去甲肾上腺素水平明显增强，而PVN中H2S水平明显降低；而在给予室旁核H2S缓释供体GYY4137后，大鼠平均动脉压明显降低，同时外周血去甲肾上腺素水平明显下降。去甲肾上腺素是交感神经兴奋后释放到血液中的儿茶酚胺物质，其水平高低可以间接反映交感神经活动状态。上述结果进一步证明了室旁核H2S水平降低是高盐诱导的高血压发生发展的促发因素，其可能通过影响室旁核神经元功能而促进外周交感神经活动，从而进一步使血压升高。H2S不仅在室旁核中能够调控血压，在其他中枢核团中对于外周交感神经活动及血压调控也起着相应作用。研究发现，自发性高血压大鼠(SHR)的延髓头端腹外侧区中H2S水平也出现明显下降，且该区域H2S合成酶胱硫醚β合成酶的蛋白表达也明显降低，提示高血压大鼠中枢H2S/胱硫醚β合成酶体系出现下调[13]。硫氢化钠(NaHS)作为H2S供体，注入自发性高血压大鼠或血管紧张素Ⅱ诱导的高血压大鼠侧脑室后，可明显降低平均动脉压和心率[14]。另有研究表明，NaHS可通过抑制氧化应激的生成而改善环孢素A诱导的高血压[15]。对于H2S调控交感神经的研究还发现，延髓头端腹外侧区中H2S可通过调节ATP敏感性K+通道抑制交感神经而调控血管运动张力[16]；H2S还可通过抑制中枢NLRP3炎症小体的激活进而调控交感神经的紧张性，从而降低血压[17]；以及室旁核H2S可明显抑制室旁核的炎症反应和氧化应激而改善高血压[4]。可见，室旁核H2S与交感神经活动密切相关，其水平降低在各种高血压中均存在影响。此次实验证实室旁核H2S水平下降是盐敏感性高血压的促发因素，适当提高室旁核H2S水平可以改善高盐诱导的高血压，这可能为高血压的治疗提供潜在的靶点。
PI3K/Akt通路是一条经典的信号通路，该通路与细胞增殖、凋亡、炎症、氧化应激及代谢等密切相关[18]。而作者前期研究发现室旁核H2S能够明显抑制炎症反应和氧化应激[4]，首先考虑H2S是否通过影响该通路而起作用？且众多研究发现，PI3K/Akt信号通路还参与高血压的中枢调节。自发性高血压大鼠PVN中PI3K/Akt通路关键蛋白表达明显增加，且PVN的升压作用是通过PI3K-Akt通路的交感神经激活和加压素释放来介导的[19]。在一项关于松弛素促进自发性高血压大鼠交感神经激活和血压升高的研究中发现[20]，自发性高血压PVN中Akt磷酸化增强，松弛素可通过刺激PI3K p85α亚基表达和Akt磷酸化进而促进外周交感神经活动增强；应用PI3K抑制剂LY294002或Akt抑制剂MK-2206可消除松弛素对肾交感神经活动、平均动脉压和血浆去甲肾上腺素的影响。另有研究表明，心肌梗死大鼠PVN中PI3K和Akt蛋白的磷酸化明显增高，而应用LY294002可以抑制PI3K和Akt磷酸化，同时抑制大鼠外周交感神经活动[21]。另有研究发现，PI3K通路介导的神经炎症也参与了高血压时交感功能亢进作用，高血压大鼠延髓头端腹外侧区特异性过表达血管紧张素转化酶2可以通过抑制PI3K/Akt通路，减弱延髓头端腹外侧区的神经炎症水平，从而抑制高血压时外周交感神经活动兴奋[22]。这些研究进一步提示，室旁核H2S对血压及外周交感神经活动的调控可能与PI3K/Akt通路存在一定的关系。于是，此次实验在给予PVN微量注射H2S缓释供体GYY4137后，发现增高室旁核H2S水平可明显降低PI3K-p85和p-Akt的蛋白表达，并同时抑制外周交感神经活动。而高盐诱导的高血压大鼠的PVN中H2S水平降低时，PI3K-p85和p-Akt的蛋白表达明显升高，同时外周交感神经活动增强和血压升高。这表明高盐诱导的高血压大鼠室旁核PI3K/Akt通路存在过度激活；增高室旁核H2S水平可明显抑制PI3K/Akt通路激活，并同时抑制交感神经活动而降低血压。H2S对PI3K/Akt通路的抑制作用，在一些癌症的相关研究中也有报道。NaHS可明显抑制肝癌细胞中p-PI3K、p-Akt和mTOR蛋白的表达[23]。外源性H2S还可通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路抑制人黑色素瘤细胞的发育[24]。但是，也有很多关于H2S促进PI3K/Akt信号通路的相关报道[25-26]，这可能与作用部位、外源性给药途径和药物剂量等不同有关。此次研究发现PVN中长期微量给予H2S后对PI3K/Akt通路起到了抑制效应。
PI3K/Akt通路与炎症反应和氧化应激关系密切。在应用脂多糖预处理的BV2小胶质细胞后可使肿瘤坏死因子α、白细胞介绍1β、核因子κB和Akt表达明显增高，而在应用PI3K抑制剂LY294002后，可明显降低上述炎症因子的表达[27]。PI3K/Akt通路对于炎症递质的影响在其他疾病如内毒素诱导的葡萄膜炎、高血压眼病中同样得到了证实[28-29]。而在肾细胞核给予LY294002抑制PI3K表达后，可明显抑制由血管紧张素Ⅱ诱导的活性氧水平增高[30]。众多研究表明，室旁核炎症和氧化应激是促进各种高血压时外周交感神经活动的重要因素[4，10-11]。因此，推断室旁核H2S对高盐诱导的高血压的降压作用可能与其对PI3K/Akt通路的调控有关。然而，此次研究只是探讨了室旁核H2S在高盐诱导的高血压中对PI3K/Akt信号通路的影响及其降压作用和对外周交感神经活动的影响，没能够通过应用信号通路激活剂或抑制剂进一步确定该信号通路在室旁核H2S降压过程中的作用机制。下一步作者将通过干预PI3K/Akt信号通路后检测该通路中相关因子PIP3、Akt等的表达变化，进一步确定其在室旁核H2S降压过程是否具有关键作用，从而为临床治疗提供更有利的科学证据。
综上所述，高盐诱导的高血压发生时室旁核PI3K/Akt信号通路明显激活，外周交感神经活动增强；室旁核H2S明显抑制PI3K/Akt信号通路，并降低外周交感神经活动和高盐诱导的血压升高。室旁核H2S在降低血压时可明显抑制PI3K/Akt通路的发现，将为高血压的临床治疗寻找新的靶点，并为新药开发奠定了理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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高血压是常见的慢性病之一，也是导致心脑血管疾病的主要危险因素。以往对于高血压的研究主要集中在外周调控机制上，随着近年来研究的深入，高血压的中枢机制也越来越受到广泛重视。下丘脑室旁核(paraventricular hypothalamic nucleus，PVN)与脊髓中间外侧柱、孤束核和延髓头端腹外侧区存在广泛联系，其在机体自主调节中起着重要的作用，是心血管活动调节的整合中枢[2]，对外周交感神经活动和血压的调节具有十分重要的作用。#br# 硫化氢(H2S)是继一氧化氮和一氧化碳之后发现的第3种内源性气体信号分子，它可以跨越血脑屏障，直接影响中枢神经系统。研究发现，H2S具有抗炎、抗氧化和抑制肾素合成和释放等作用，其在调节神经免疫活动以及降低血压中具有重要的作用。GYY4137是一种水溶性的H2S缓释供体，能够更好地模拟生理情况下H2S的释放，在外源性H2S研究中被广为使用。#br# 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号传导通路是哺乳动物最重要的细胞内信号通路之一，在调控细胞代谢、炎症、氧化应激、生长以及蛋白质合成等方面发挥重要作用。而且，PI3K/Akt信号通路对高血压中交感神经兴奋也具有调控作用。因此，基于H2S的抗炎和抗氧化作用以及PVN炎症和氧化应激与高血压的关系，该实验通过对高盐诱导的高血压大鼠PVN中注射H2S缓释供体GYY4137，观察室旁核H2S对该区域PI3K/Akt信号通路以及外周交感神经活动和血压的影响，探讨室旁核H2S抗高血压的作用信号通路，从而为高血压的临床治疗提供新的思路和治疗靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

室旁核硫化氢对高盐诱导高血压模型大鼠PI3K/Akt通路及血压的影响

Effects of hydrogen sulfide in paraventricular nuclei on PI3K/Akt pathway and blood pressure in high salt-induced hypertensive rats

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