亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞损伤及鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号轴的影响

doi:10.12307/2023.121

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (26): 4161-4167.doi: 10.12307/2023.121

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亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞损伤及鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号轴的影响

方兴艳1，田侦丽1，赵哲仪2，文平3，谢婷婷1

1贵州医科大学附属医院临床检验中心，贵州医科大学医学检验学院，贵州省贵阳市 550004；2四川省疾病预防控制中心，四川省成都市 614000；3贵州医科大学附属医院妇产科，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2022-03-14 接受日期:2022-05-13 出版日期:2023-09-18 发布日期:2023-01-28
通讯作者: 谢婷婷，博士，副教授，硕士生导师，贵州医科大学附属医院临床检验中心，贵州医科大学医学检验学院，贵州省贵阳市 550004
作者简介:方兴艳，女，1991年生，贵州省遵义市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事砷中毒机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81560514)，项目负责人：谢婷婷

Effects of sodium arsenite on human umbilical vein endothelial cell injury and sphingosine kinases 1/sphingosine 1-phosphate signaling axis

Fang Xingyan1, Tian Zhenli1, Zhao Zheyi2, Wen Ping3, Xie Tingting1

1Center for Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, School of Clinical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Sichuan Center for Disease Control and Prevention, Chengdu 614000, Sichuan Province, China; 3Department of Obstetrics and Gynecology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2022-03-14 Accepted:2022-05-13 Online:2023-09-18 Published:2023-01-28
Contact: Xie Tingting, MD, Associate professor, Master’s supervisor, Center for Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, School of Clinical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Fang Xingyan, Master candidate, Center for Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, School of Clinical Laboratory Science, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81560514 (to XTT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

亚砷酸钠：砷(Arsenic，As)为一种有毒类金属元素。亚砷酸钠为砷的化合物，已被广泛用于砷相关的毒性研究。
1-磷酸鞘氨醇( sphingosine 1-phosphate，S1P) ：一种生物活性脂质，由鞘氨醇激酶(sphingosine kinases，SPHK)磷酸化鞘氨醇而成，分泌至胞外与膜表面1-磷酸鞘氨醇受体( sphingosine 1-phosphate receptors，S1PRs) 结合或在胞内作为第二信使调节细胞增殖、凋亡、迁移、黏附、血管生成及血管屏障等，已成为肿瘤、炎症、动脉粥样硬化等多种疾病研究的热点之一。

背景：血管内皮细胞是砷毒作用的关键靶点，砷致内皮细胞损伤的分子机制有待进一步研究。
目的：研究亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞的损伤及鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇(SPHK1/S1P)信号轴的影响。
方法：分离培养并鉴定人脐静脉内皮细胞，将人脐静脉内皮细胞暴露于含0，5，10，15，20，25 µmol/L亚砷酸钠的培养液 24 h，CCK-8法检测细胞存活率；倒置显微镜观察细胞形态；荧光探针DCFH-DA染色检测细胞内活性氧含量；Annexin V-FITC/PI双标记结合流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡；ELISA检测细胞内1-磷酸鞘氨醇含量；实时荧光定量 PCR、Western blot 分别检测血管细胞黏附分子1、鞘氨醇激酶1、1-磷酸鞘氨醇受体1的mRNA和蛋白表达。

结果与结论：①与对照组(0 µmol/L亚砷酸钠)相比，随着亚砷酸钠浓度的增加：细胞存活率逐渐降低，且呈剂量-效应关系；细胞融合率逐渐降低，细胞间隙逐渐增宽，脱落漂浮的细胞逐渐增多；细胞内活性氧含量逐渐升高；细胞凋亡率逐渐升高；细胞内1-磷酸鞘氨醇含量逐渐升高；血管细胞黏附分子1、鞘氨醇激酶1 mRNA和蛋白的相对表达量逐渐升高，1-磷酸鞘氨醇受体1 mRNA和蛋白相对表达量逐渐降低。②结果提示，亚砷酸钠诱导的人脐静脉内皮细胞损伤可能与SPHK1/S1P信号轴激活、1-磷酸鞘氨醇受体1下调有关。SPHK1/S1P信号轴可能成为砷致心血管损伤的新靶点。

https:orcid.org/0000-0002-6895-5650(方兴艳)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 亚砷酸钠, 人脐静脉内皮细胞, 氧化应激, 凋亡, 炎症, 鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号轴

Abstract: BACKGROUND: Vascular endothelial cells are the main target of arsenic toxicity and the molecular mechanism of arsenic-induced endothelial cell injury needs to be further studied.
OBJECTIVE: To study the effects of sodium arsenite on human umbilical vein endothelial cell injury and sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate signaling axis of human umbilical vein endothelial cells.
METHODS: Human umbilical vein endothelial cells were isolated, cultured, and identified. The cells were treated with 0, 5, 10, 15, 20, 25 µmol/L sodium arsenite for 24 hours. Cell viability was detected by cell counting kit-8. Cell morphology was observed by inverted phase contrast microscope. The content of intracellular reactive oxygen species was detected by fluorescent probe DCFH-DA. Annexin V-FITC/PI double labeling combined with flow cytometry and TUNEL were used to detect apoptosis. The content of sphingosine 1-phosphate in cells was detected by ELISA. The mRNA and protein expressions of vascular cell adhesion molecule-1, sphingosine kinase 1, and sphingosine 1-phosphate were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and western blot respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group (0 µmol/L sodium arsenite), the cell viability decreased gradually along with the increased concentration of sodium arsenite in a dose-dependent manner; the cell fusion rate decreased gradually, the cell gap widened gradually, and the number of exfoliated and floating cells increased gradually; the reactive oxygen species content and apoptosis rate increased gradually; the sphingosine 1-phosphate content in cells increased gradually; the relative mRNA and protein expressions of vascular cell adhesion molecule-1 and sphingosine kinase 1 increased gradually, but the relative mRNA and protein expression of sphingosine kinase 1 decreased gradually. To conclude, sodium arsenite-injured human umbilical vein endothelial cell injury may be related to the activation of sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate signaling axis and the downregulation of sphingosine 1-phosphate receptor 1. Sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate signaling axis may become a new target of arsenic-induced cardiovascular injury.

Key words: sodium arsenite, human umbilical vein endothelial cell, oxidative stress, apoptosis, inflammation, sphingosine kinase 1/sphingosine 1-phosphate signaling axis

中图分类号:

方兴艳, 田侦丽, 赵哲仪, 文平, 谢婷婷. 亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞损伤及鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号轴的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4161-4167.

Fang Xingyan, Tian Zhenli, Zhao Zheyi, Wen Ping, Xie Tingting. Effects of sodium arsenite on human umbilical vein endothelial cell injury and sphingosine kinases 1/sphingosine 1-phosphate signaling axis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(26): 4161-4167.

图/表（结果） 10

2.1 人脐静脉内皮细胞鉴定培养的人脐静脉内皮细胞呈“铺路石”样或“漩涡状”排列，见图1A；流式细胞术结果显示，CD31阳性活细胞比例> 97%，成功分离培养出活性好、纯度高的人脐静脉内皮细胞，见图1B。

2.2 亚砷酸钠抑制人脐静脉内皮细胞活力且呈浓度依赖性 CCK-8结果显示，与对照组相比，其他剂量组细胞存活率显著降低(P < 0.05)，且随着亚砷酸钠浓度的增高，细胞存活率逐渐降低，呈剂量-效应关系，见图2。

2.3 亚砷酸钠导致人脐静脉内皮细胞形态改变倒置显微镜观察显示，对照组细胞排列紧密，呈“铺路石”样，细胞呈圆形、椭圆形，胞膜光滑完整，胞质丰富，胞核清晰可见。与对照组相比，随着亚砷酸钠浓度的增加，其他剂量组细胞融合率逐渐降低，细胞间隙逐渐增宽，细胞逐渐拉长呈梭形或变圆浮起，见图3。

2.4 亚砷酸钠引起人脐静脉内皮细胞发生氧化应激细胞内活性氧可氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，DCF荧光强度与活性氧水平呈正相关。荧光显微镜观察，对照组荧光强度弱，与对照组相比，5-25 μmol/L 组荧光强度增强，见图4。使用ImageJ软件测量平均荧光强度，结果显示，与对照组相比，10-25 μmol/L组细胞内活性氧水平升高(P < 0.05)，见表2。

2.5 亚砷酸钠诱导人脐静脉内皮细胞凋亡流式细胞术结果显示，0，5，10，15，20，25 μmol/L组细胞凋亡率分别为(4.43±0.36) %，(8.11±2.42)%，(11.25±3.24)%，(20.29±1.86)%，与对照组相比，10，15 μmol/L组细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)，见图5A，B。
TUNEL实验结果显示，0，20 μmol/L组细胞凋亡率分别为(5.67±2.14)%，(38.93±3.95)%，与对照组相比，20 μmol/L组细胞凋亡率显著升高(P < 0.05)，见图5C，D。

2.6 亚砷酸钠促进人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1表达实时荧光定量PCR、Western Blot法检测细胞血管细胞黏附分子1 mRNA及蛋白的相对表达。结果显示，与对照组相比，10-25 μmol/L 组细胞血管细胞黏附分子1 mRNA及蛋白相对表达量显著升高(P < 0.05)，见图6。

2.7 亚砷酸钠导致人脐静脉内皮细胞内S1P含量升高 ELISA结果显示，与对照组相比，10，20 μmol/L组细胞内S1P含量明显升高(P < 0.05)，见图7。

2.8 亚砷酸钠导致人脐静脉内皮细胞SPHK1 mRNA 水平增加、S1PR1 mRNA 水平降低实时荧光定量PCR结果显示，与对照组相比，15-25 μmol/L 组SPHK1 mRNA 明显升高，10-25 μmol/L 组S1PR1 mRNA 水平明显降低(P < 0.05)，见图8。

2.9 亚砷酸钠导致人脐静脉内皮细胞SPHK1蛋白水平增高、S1PR1蛋白水平降低 Western Blot结果显示，与对照组相比，5-25 μmol/L组SPHK1 蛋白水平明显升高，15-25 μmol/L组S1PR1 蛋白水平明显降低(P < 0.05)，见图9。

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引言

砷暴露会增加罹患高血压、动脉粥样硬化、缺血性心脏病、周围血管疾病等的风险[1-4]，而血管内皮细胞损伤是心血管系统疾病发生的始动环节[5]。细胞和动物实验研究发现，内皮细胞氧化应激、凋亡、炎症在砷诱导的心血管系统疾病中起重要作用[6-7]。然而，砷致血管内皮细胞损伤的分子机制有待进一步研究。
鞘脂是一类含鞘氨醇骨架的脂质家族，主要包括神经酰胺、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)及一系列代谢酶，除参与构成生物膜外，还作为一种高度活跃的生物活性分子调节机体生理过程，鞘脂代谢异常与多种疾病发生密切相关[8]。S1P由鞘氨醇激酶(sphingosine kinases，SPHK)催化鞘氨醇而成，在胞内作为第二信使发挥作用或分泌至胞外与其1-磷酸鞘氨醇受体( sphingosine 1-phosphate receptors，S1PRs)结合参与调节细胞增殖、凋亡、炎症、血管生成及血管屏障等，已成为肿瘤、炎症、动脉粥样硬化等多种疾病研究的热点之一[9]。SPHK高度保守，是合成S1P的关键限速酶，现已知有SPHK1和SPHK2两种亚型，SPHK1参与多种生理病理过程，SPHK2目前研究较少且存在争议[10]。S1PRs属G蛋白偶联受体，有 5种亚型，其中S1PR1、S1PR2、S1PR3广泛分布于心血管系统，S1PR4、S1PR5分别在淋巴系统和神经系统表达，此差异表达是构成S1P功能差异性的分子基础[11]。ZOU等[11-13]研究发现，三氧化二砷通过降低胃癌细胞系MGC-803中S1P水平发挥抗癌作用，进一步研究表明，S1P水平降低是由于三氧化二砷抑制SPHK1活性引起的，提示SPHK1/S1P信号轴与砷毒作用有关。
综上，推测SPHK1/S1P信号轴可能在砷致内皮损伤中发挥重要作用。因此，实验以亚砷酸钠作为处理因素，以人脐静脉内皮细胞代表血管内皮细胞构建砷暴露细胞模型，初步探究亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞的氧化应激、凋亡、炎症损伤及SPHK1/S1P信号轴的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2021年6月至2022年2月在贵州医科大学分子生物学重点实验室及临床研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 脐带组织取自贵州医科大学附属医院无HBV、HIV感染，无妊娠期高血压、健康足月产妇分娩后的脐带组织。研究方案的实施符合《赫尔辛基宣言》并经过贵州医科大学附属医院(原贵阳医学院附属医院)伦理委员会批准(2015伦审第33号)。供者对脐带组织的收集和用途完全知情同意并签署了“知情同意书”。
1.3.2 实验用试剂 Ⅱ型胶原酶(2275GR001)、肝素(1170GR001)购自BioFroxx公司；M199培养基(C11150500bt)购自Gibco公司；胎牛血清(FB25015)购自Clark公司；FITC anti-human CD31(303104)抗体购自BioLegend公司；非必需氨基酸(25-025-CI)购自Corning公司；HEPES缓冲液(H1090)、L-谷氨酰胺(G0200)、蛋白提取试剂盒(R0010)、BCA法蛋白浓度测定试剂盒(PC0020)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(P1200)购自索莱宝公司；ACCUTASE细胞消化液(00-4555-56)购自Invitrogen公司；亚砷酸钠购自Merck公司；CCK-8试剂盒(GK10001)购自Glpbio公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(MA0220)购自美仑公司；DCFH-DA活性氧检测试剂盒(S0033S)、TUNEL试剂盒(C1086)购自碧云天生物公司；人1-磷酸鞘氨醇(S1P)ELISA试剂盒(69-99298)购自默沙克生物公司；兔抗血管细胞黏附分子1抗体(ab134047)购自Abcam公司，兔抗SPHK1抗体(DF6005)、兔抗S1PR1抗体(DF2785)、兔抗GAPDH抗体(AF7021)、山羊抗兔IgG(S0001)购自Affinity公司。Navios流式细胞仪(COLORS/2LASER)购自美国Beckman公司，CFX Connect Real-Time PCR核酸定量仪(1855201)、Mini-PROTEAN Tetra(16580041EDU)小型垂直电泳仪购自美国Bio-Rad公司。
1.4 实验方法

1.4.1 人脐静脉内皮细胞分离培养、传代及鉴定根据CRAMPTON等[13]的方法，Ⅱ型胶原酶法分离人脐静脉内皮细胞，M199完全培养基重悬细胞沉淀，37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱中培养。按1∶4比例传代，实验采用第3-8代细胞。倒置相差显微镜下观察细胞形态，流式细胞术检测活细胞表面CD31表达。

1.4.2 实验分组及亚砷酸钠染毒接种细胞，当细胞融合度达80%时，用含0，5，10，15，20，25 µmol/L亚砷酸钠的培养液处理24 h；其中0 µmol/L组为对照组，其他剂量组为实验组。
1.4.3 CCK-8法检测细胞存活率调整细胞浓度至8×107 L-1，取100 µL 细胞悬液接种于96孔板，待细胞贴壁后分别加入100 µL含0，5，10，15，20，25 µmol/L亚砷酸钠的培养液处理24 h，加入 100 µL培养基及10 µL CCK-8试剂，避光孵育 2 h后，酶标仪检测 450 nm 波长处吸光度(A) 值并计算细胞存活率。
1.4.4 荧光探针DCFH-DA染色法检测细胞内活性氧水平调整细胞浓度至1×108 L-1，取1 mL细胞悬液接种于24孔板，待细胞贴壁后分别加入2 mL含0，5，10，15，20，25 µmol/L亚砷酸钠的培养液处理24 h，10 µmol/L DCFH-DA 孵育0.5 h，荧光显微镜下观察并拍照，ImageJ软件测量平均荧光强度。
1.4.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡调整细胞浓度至1×108 L-1，取2 mL细胞悬液接种于6孔板，待细胞贴壁后分别加入2 mL含0，5，10，15 µmol/L 亚砷酸钠的培养液处理24 h，制备单细胞悬液，5 µL Annexin V-FITC、5 µL PI孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.4.6 TUNEL法检测细胞凋亡调整细胞浓度至1×108 L-1，取0.5 mL细胞悬液接种于24孔板，待细胞贴壁后分别加入0.5 mL含0，20 µmol/L亚砷酸钠的培养液处理24 h，根据试剂盒说明书操作：PBS清洗细胞2次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，0.3% Triton x-100 通透5 min，TUNEL反应液37 ℃避光孵育1 h，DAPI复染1 min。荧光显微镜下拍照，计算细胞凋亡率。
1.4.7 ELISA检测细胞内S1P含量调整细胞浓度至1×108 L-1，取2 mL细胞悬液接种于6孔板，待细胞贴壁后分别加入2 mL含0，10，20 µmol/L 亚砷酸钠的培养液处理24 h，消化收集细胞并计数，根据ELISA试剂盒说明书操作。

1.4.8 实时荧光定量PCR法检测血管细胞黏附分子1、SPHK1、S1PR1的mRNA表达 TRIzol法提取总RNA，微量紫外分光光度法检测RNA纯度和浓度，凝胶电泳检测RNA完整性。反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，GAPDH为内参基因，SYBR Green I 嵌合法进行qPCR反应，反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s，60 ℃退火及延伸30 s，共40个循环；72 ℃10 min。采用2-ΔΔCt计算mRNA相对表达量，引物序列见表1。

1.4.9 Western Blot法检测血管细胞黏附分子1、SPHK1、S1PR1蛋白表达使用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭
2 h。血管细胞黏附分子1抗体(1∶5 000)、SPHK1抗体(1∶2 000)、S1PR1抗体(1∶2 000)、GAPDH抗体(1∶5 000)4 ℃孵育过夜。山羊抗兔IgG(1∶8 000)室温孵育2 h，ECL显影，ImageJ软件处理分析。
1.5 主要观察指标 ①细胞形态，细胞表面CD31表达情况；②细胞存活率；③细胞内活性氧含量；④细胞凋亡；⑤细胞内S1P含量；⑥细胞血管细胞黏附分子1、SPHK1、S1PR1 mRNA及蛋白表达。
1.6 统计学分析数据以x±s表示，采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析，Graphpad Prism 7.0绘数据图，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

砷致心血管损伤经久不愈、机制不清，而血管内皮细胞损伤是心血管疾病发生的始动因素，研究砷对血管内皮细胞的损伤及其分子机制具有重要意义。人脐静脉内皮细胞具有与动脉内皮细胞相似的生物学特征，已成为血管内皮细胞体外实验的重要材料[14]。课题组采用Ⅱ型胶原酶法分离人脐静脉内皮细胞，倒置显微镜下细胞呈“铺路石”样或“漩涡状”排列，根据这一典型的形态学特征可对其进行初步鉴别。CD31是人脐静脉内皮细胞表面特异性抗原之一，可被用于人脐静脉内皮细胞的纯度鉴定。此次研究流式细胞术结果显示，CD31阳性的活细胞比例大于97%，表明成功分离培养出活性好、纯度高的人脐静脉内皮细胞。
活性氧是一类具有高反应活性的含氧小分子物质，当活性氧产生过多超过机体抗氧化能力时，机体氧化还原稳态失衡，进而导致核酸、蛋白质、脂质结构和功能异常[15-16]。越来越多的证据表明，SPHK1/S1P信号轴与氧化应激密切相关。HARIJITH 等[17]研究发现，高氧诱导支气管肺损伤小鼠模型中，SPHK1/S1P信号轴被激活，进而通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶引起活性氧水平增加；进一步应用外源性S1P处理人肺微血管内皮细胞，发现S1P能刺激活性氧产生，而siRNA下调SPHK1能阻断此效应。另有学者证实，抑制SPHK1可降低转化生长因子β诱导的人肺成纤维细胞内线粒体活性氧水平[18]。而活性氧产生过多是砷毒作用机制之一[19]，多项研究证实砷可通过增强人脐静脉内皮细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性引起活性氧水平增加，也可扰乱线粒体膜完整性，引起活性氧释放到胞质从而导致氧化应激[20-21]。根据课题组前期研究基础及预实验结果，此次实验将人脐静脉内皮细胞暴露于含0，5，10，15，20，25 µmol/L亚砷酸钠的培养液 24 h 发现，亚砷酸钠显著诱导活性氧产生，上调SPHK1 mRNA及蛋白表达进而引起细胞内S1P水平明显增加，提示亚砷酸钠诱导的氧化应激可能与SPHK1/S1P信号轴激活有关，下一步实验将进一步明确亚砷酸钠诱导的SPHK1/S1P信号轴激活如何引起活性氧水平增加。
细胞凋亡是由一系列复杂信号通路调控的程序性细胞死亡，对维持机体内环境稳定至关重要，细胞凋亡异常与多种疾病关系密切。S1P是神经酰胺的下游代谢物，神经酰胺和S1P两者之间的动态平衡是决定细胞命运的重要因素。神经酰胺通常诱导细胞生长停滞和凋亡，S1P则促进细胞增殖和存活[22]。然而，多项研究发现，S1P可诱导多种细胞凋亡。DAVAILLE等[23]学者报道，胞内S1P作为第二信使通过环氧合酶2促进生长抑制递质前列腺素E2释放和cAMP产生从而抑制肝肌成纤维细胞增殖。他们还发现胞内S1P增加肝肌成纤维细胞凋亡执行分子caspase-3活性诱导细胞凋亡，表明胞内S1P通过caspase-3途径诱导细胞凋亡[24]。YANG等[25-26]研究则表明S1P激活S1PR1/3，促进环氧合酶2/前列腺素E2表达，进而激活caspase-3诱导人心肌成纤维细胞凋亡。以上研究表明S1P可在胞内或胞外上调环氧合酶2/前列腺素E2系统，激活caspase-3诱导细胞凋亡。而在一项全基因组基因表达谱中，与SPHK1双基因敲除小鼠高氧诱导肺损伤模型组相比，野生型小鼠高氧诱导肺损伤模型组促凋亡基因bax高4倍，抗凋亡基因bcl2低2倍[27]，提示SPHK1/S1P信号轴可能通过线粒体途径诱导细胞凋亡。多项实验研究显示砷可上调环氧合酶2/前列腺素E2系统[28-30]。
课题组前期研究表明，caspase-3、bax、bcl2与砷诱导的细胞凋亡关系密切，且其他学者也证实线粒体凋亡途径是砷毒作用重要机制[31-33]。因次，推测此次实验亚砷酸钠诱导的SPHK1/S1P信号轴激活可能与人脐静脉内皮细胞凋亡有一定联系，但其是否通过环氧合酶2/前列腺素E2系统或线粒体途径诱导细胞凋亡还需深入研究。
血管细胞黏附分子1是一种重要的细胞黏附分子，主要在炎症反应期间表达于血管内皮细胞，介导白细胞的滚动和黏附，从而导致心血管疾病的发生发展[34]。SPHK1/S1P信号轴可上调血管细胞黏附分子1表达[35]。SPHK1结合于肿瘤坏死因子受体相关因子2的指环结构域，产生的S1P激活E3泛素连接酶，活化的肿瘤坏死因子受体相关因子2使受体相互作用蛋白多泛素化，之后募集并激活IκB激酶，这些启动核转录因子κB通路的反应与S1PR无关[36-37]。高糖诱导人脐静脉内皮细胞SPHK1/S1P信号轴激活，胞内S1P作为第二信使激活核转录因子κB信号通路进而上调血管细胞黏附分子1、E-选择素的表达，为SPHK1/S1P信号轴不依赖S1PR激活核转录因子κB信号通路参与血管炎症反应提供了直接证据[38]。S1PR具有5种亚型，其中S1PR1、S1PR2、S1PR3主要在内皮细胞表达[39]。S1P通过与S1PR2结合进而激活核转录因子κB信号通路促进血管细胞黏附分子1和血管细胞黏附分子1分泌从而加重炎症反应[40]。而砷诱导核转录因子κB激活引起炎症反应也有相关报道[15，40-42]。此次实验S1P可能在胞内作为第二信使激活核转录因子κB信号通路促进内皮细胞血管细胞黏附分子1表达，S1P是否分泌至细胞外与内皮细胞上S1PR2结合激活核转录因子κB信号通路促进内皮细胞血管细胞黏附分子1表达将在下一步研究。
正常生理情况下，血液中S1P与内皮细胞上S1PR1结合，激活Gi蛋白，通过Gi-PI3K途径或Gi-PLC途径激活Rac1，而活化的Rac1通过抑制VE-钙粘蛋白分解介导皮质肌动蛋白组装和黏附链接重排从而增强内皮屏障功能[43-44]。S1PR1表达降低导致内皮屏障功能障碍、血管通透性增加，而内皮屏障功能障碍是血管炎症反应的关键因素。特异性敲除内皮细胞S1PR1的小鼠血管通透性增加，促炎黏附分子血管细胞黏附分子1增多，而内皮细胞S1PR1过表达小鼠血管细胞黏附分子1则降低[45]。0.13 µmol/L三氧化二砷即可致内皮细胞VE-钙粘蛋白被剪切，血管屏障功能障碍，血管通透性增加从而引起血管系统疾病[46]。此次实验亚砷酸钠可能通过抑制人脐静脉内皮细胞 S1PR1 mRNA和蛋白表达进而促进VE-钙粘蛋白分解导致内皮屏障功能损害。
综上所述，此次实验初步发现亚砷酸钠可激活人脐静脉内皮细胞SPHK1/S1P信号轴，且抑制S1PR1表达，为砷致心血管损伤提供了一种新的思路和靶点。实验只在细胞水平初步探讨SPHK1/S1P信号轴在砷致内皮细胞损伤中的作用，然而，体外细胞不能完全模拟体内环境，作者将在砷致心血管损伤动物模型中进行SPHK1阻断及S1PR1过表达等反向验证实验，并对SPHK1/S1P信号轴下游关键分子进行检测。此外，砷毒作用具有浓度-效应关系和时间-效应关系，但实验只探讨24 h不同浓度砷对SPHK1/S1P信号轴的影响，还需进一步研究砷不同作用时间对SPHK1/S1P信号轴的影响以便更深入地探究SPHK1/S1P信号轴在砷致内皮细胞损伤中的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞损伤及鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号轴的影响

Effects of sodium arsenite on human umbilical vein endothelial cell injury and sphingosine kinases 1/sphingosine 1-phosphate signaling axis

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