2.1   人参皂苷Rg3对氧糖剥夺/复糖复氧损伤PC12细胞的保护作用   图1A是人参皂苷Rg3的结构式，使用1-100 nmol/L的Rg3处理受到不同时间氧糖剥夺损伤的PC12细胞，如图1B所示，在不同损伤时间内，Rg3在10-100 nmol/L浓度范围时，都可以不同程度地升高细胞活力。通过测定乳酸脱氢酶的释放来评估PC12细胞受损的程度，如图1C所示，在氧糖剥夺2 h时，Rg3在25-100 nmol/L时均可以明显减少乳酸脱氢酶的释放(P < 0.05)。因为在0.5，1，1.5，2 h时，细胞活力都出现明显下降，分别为81%，75%，55%，51%，为保证模型的稳定性与损伤的效果，后续实验使用氧糖剥夺2 h，复糖复氧16 h进行造模。



2.2   人参皂苷Rg3对氧糖剥夺/复糖复氧损伤诱导的细胞凋亡的影响   Calcein-AM/PI双染色结果显示Rg3可以减少氧糖剥夺/复糖复氧损伤诱导的细胞凋亡，见图2A。利用Western blot检测凋亡相关蛋白BAX、ProCaspase-3、Pro-Caspase-9、CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-9的表达水平，与模型组相比，Rg3在100 nmol/L时可以明显降低BAX蛋白的表达(P < 0.01)。意外的是，与对照组相比，模型组Cleaved-Caspase-9活性升高，Cleaved-Caspase-3活性降低，而Pro-Caspasse-9和Pro-Caspase-3蛋白的活性无明显变化；在使用不同浓度的Rg3处理后，Cleaved-Caspase-9表达降低，Cleaved-Caspase-3表达明显升高，对Pro-Caspasse-9和Pro-Caspase-3的表达无明显影响，见图2B。



2.3   人参皂苷Rg3对氧糖剥夺/复糖复氧损伤诱导的炎症反应的影响    如图3所示，Western blot结果表明，使用Rg3处理细胞后，与模型组相比，Rg3在100 nmol/L时可以明显降低NLRP3(P < 0.01)、白细胞介素1β(P < 0.000 1)和肿瘤坏死因子α(P < 0.000 1)的表达水平。



2.4   LY294002对氧糖剥夺/复糖复氧损伤PC12细胞的保护作用   为明确PI3K/AKT信号通路在氧糖剥夺/复糖复氧损伤模型中发挥的作用，使用特异性PI3K/AKT通路抑制剂LY294002进行阳性对照实验。在氧糖剥夺2 h的条件下，单独使用LY294002预处理细胞，结果表明不同浓度的LY294002均能够减少乳酸脱氢酶的释放，见图4A。

Calcein-AM/PI染色和流式结果均表明，LY294002能够抑制氧糖剥夺/复糖复氧损伤介导的细胞凋亡，Western blot结果发现LY294002能够明显降低炎症相关因子NLRP3、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和凋亡蛋白BAX的表达水平，并且随着LY294002浓度的升高，其对PI3K和AKT的磷酸化抑制程度逐渐增强，见图4B-F。



2.5   拮抗Rg3对PI3K/AKT信号通路调节作用后对氧糖剥夺/复糖复氧损伤PC12细胞的影响   为进一步探索Rg3对PI3K/AKT信号通路的调节作用，将Rg3与特异性AKT激活剂SC79联合使用。乳酸脱氢酶释放实验结果显示，与模型组相比，单独使用SC79的乳酸脱氢酶释放率无明显差异，而Rg3和SC79联合使用与单独使用Rg3相比，乳酸脱氢酶释放会增多，但无统计学差异，见图5A。Calcein-AM/PI染色和流式结果均表明，SC79能够促进细胞凋亡，升高细胞凋亡率，Western blot结果表明SC79能恢复炎症相关因子NLRP3、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和凋亡蛋白BAX的水平，并且能够明显促进AKT的磷酸化，图5B-F。

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脑卒中是危害人类健康的主要疾病之一，具有高致残率、高死亡率的特点[1]。脑卒中严重影响患者日常生活能力和社会功能[2]，因中风而导致的身体功能障碍可能会伴随患者终身[3]。脑缺血引起的神经元不可逆性损伤，是脑卒中导致患者残疾、死亡的重要原因，而缺血再灌注引起的神经细胞损伤是导致神经功能障碍的主要原因[4]，因此研究保护神经细胞免受缺血再灌注损伤具有重要意义。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信号通路是参与细胞增殖调控的重要通路，是一条经典的调节细胞存活、分化以及凋亡的细胞信号传导通路，它通过调节下游相关蛋白的活化过程发挥重要的生物学效应，在生理和病理过程中发挥关键作用[5]。研究发现，PI3K/AKT信号通路在神经系统中广泛存在，与神经细胞的存活、分化以及凋亡密切相关[6-7]。近年相关研究表明，PI3K/AKT信号通路与脑缺血损伤有关，在因脑缺血发生细胞凋亡时，缺血前处理、缺血后处理、神经营养因子等可以通过调节PI3K/AKT信号通路抑制细胞凋亡，发挥神经保护作用[8]。除此之外，也有研究表明抑制PI3K/AKT信号通路能够减轻炎症反应[9]，还能够抑制小胶质细胞的活化，从而控制神经炎症递质的表达[10]。

人参已在传统医学中广泛使用了2 000多年[11]。人参皂苷是人参的重要活性成分，目前能从各类人参中分离得到60多种人参皂苷，如Rg1、Rg2、Rg3、Rb1、Rb2、Re、Rk1等[12]。人参皂苷Rg3是一种原人参二醇，具有抗炎、抗氧化和神经保护作用[13-15]。人参皂苷Rg3在人参的人参皂苷中比例非常低，不到0.1%[16]，与多种人参皂苷相比，可以有效保护大脑免受缺血性损伤，具有很强的治疗活性[17]。但总体而言，关于人参皂苷Rg3的研究并不多，且其潜在作用机制也尚不明确。

该研究构建了PC12细胞的氧糖剥夺/复糖复氧损伤模型来模拟体外缺血再灌注的环境，探讨人参皂苷Rg3在氧糖剥夺/复糖复氧损伤模型中对PC12细胞的保护作用，并通过研究PI3K/AKT信号通路进一步探索其潜在机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   体外细胞学实验观察。对实验获得的数据进行方差齐性检测与正态性检验，若实验数据方差齐、符合正态分布则两组间采用t检验，多组间采用单因素方差分析；如果数据不符合正态分布，则采用非参数检验的秩和检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年11月至2021年12月在广州中医药大学科技创新中心完成。
1.3   材料   PC12细胞系购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库；人参皂苷Rg3标准品购自北京索莱宝科技有限公司(SG8360)；细胞培养试剂购自美国Gibco公司；EBSS平衡盐溶液购自上海贝博生物科技公司；流式凋亡试剂盒购自江苏凯基生物技术公司；RIPA裂解液、BCA试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒、Calcein-AM/PI试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；LY294002抑制剂、SC79激活剂购自德国Sigma公司；抗体见表1。

水套式CO2培养箱(Thermo，美国)；Multiskan Go酶标仪(Thermo，美国)； 伯乐电泳仪(BIO-RAD，美国)；三气培养箱(YCP，中国)；低温高速离心机(Scilogex，美国)；Orbital shaker TS-1摇床(Kylin-bell，中国)；Transference decoloring shaker TS-8摇床(Kylin-bell，中国)；HH-1数显恒温水浴锅(国华，中国)；TS2-S-SM倒置显微镜(Nikon，日本)；化学发光成像仪(BIO-RAD，美国)；徕卡显微镜(Leica，德国)，KGaA流式细胞仪(Merck，德国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   PC12细胞培养   PC12细胞使用DMEM+体积分数为10%胎牛血清+1%青链霉素混合液配制而成的DMEM完全培养基进行常规培养。细胞培养的条件：37 ℃，体积分数为5% CO2。
1.4.2   构建氧糖剥夺/复糖复氧损伤模型   传两三代的PC12细胞种板18-24 h后，弃去旧培养基，加入同等体积的EBSS缓冲盐溶液，然后将细胞置于YCP三气培养箱内，将YCP三气培养箱的参数调节为体积分数为94% N2、5% CO2、1% O2，待培养箱各项气体检测示数稳定，开始计算细胞的氧糖剥夺时间。根据实验需要，分别进行0.5，1，1.5，2 h的氧糖剥夺处理，随后将细胞从三气培养箱中取出，小心吸除EBSS缓冲盐溶液，沿着皿壁加入等体积的DMEM完全培养基，然后将细胞置于普通细胞培养箱内进行复糖复氧处理16 h。正常组细胞不进行氧糖剥夺处理，其余操作均与模型组同步进行。
1.4.3   药物处理

(1)人参皂苷Rg3的使用：PC12细胞在氧糖剥夺时，同时使用1-100 nmol/L的Rg3处理。

(2)PI3K/AKT抑制剂LY294002的使用：PC12细胞在氧糖剥夺前，分别使用10，20，40 μmol/L LY294002预处理2 h。

(3)AKT激活剂SC79与Rg3联合应用：在氧糖剥夺损伤前，将AKT激活剂SC79(20 μmol/L)加入到培养基中预处理1 h，然后在氧糖剥夺时，同时使用100 nmol/L Rg3处理PC12细胞。
1.4.4   MTT检测Rg3毒性以及细胞活力   将PC12细胞接种在96孔板中，每孔细胞约为8 000个，进行相应的氧糖剥夺/复糖复氧处理后，每孔加入20 μL的MTT工作液，37 ℃孵育三四个小时，然后弃去含有工作液的培养基，沿着孔壁加入200 μL二甲基亚砜，室温下摇床60 r/min摇动10 min，结束后使用酶标仪测定吸光度，波长为490 nm。以正常组PC12细胞的活力为参照，计算相对细胞活力。
1.4.5   乳酸脱氢酶释放检测   在复糖复氧15 h时加入乳酸脱氢酶释放试剂，随后吹打混匀，继续在细胞培养箱内孵育1 h，使用细胞培养板专用的孔板离心机以400×g的条件离心5 min，再吸取每个孔内120 μL上清液转移到新的96孔板中，此时在每孔内加入60 μL的乳酸脱氢酶工作液，在摇床上室温避光孵育30-40 min，在490 nm波长处测量吸光度值，并根据以下公式计算PC12细胞乳酸脱氢酶的释放率：
    乳酸脱氢酶释放率(%)=[吸光度值(处理)-吸光度值(对照)]/[吸光度值(最大值)-吸光度值(对照)]×100%
    吸光度值(对照)、吸光度值(处理)、吸光度值(最大值)均需减去背景空白吸光度值后才能用于计算乳酸脱氢酶释放率。
1.4.6   Calcein-AM/PI细胞凋亡双染色   Calcein-AM/PI染色试剂盒用于观察细胞凋亡，PC12细胞按照10 000个/孔的密度接种在96孔板内，经氧糖剥夺/复糖复氧处理后，使用真空泵吸干净旧培养基，沿着孔壁加入PBS润洗细胞1次，去除PBS后，每孔加入100 μL Calcein-AM/PI染色工作液，在37 ℃的细胞培养箱内避光孵育30-40 min，随后使用荧光显微镜进行图像的拍摄，并通过LAS X软件进行图像分析。
1.4.7   Western blot蛋白检测   经氧糖剥夺/复糖复氧处理后，使用RIPA裂解液提取PC12细胞的总蛋白，然后用BCA试剂盒定量蛋白浓度，随后使用5×Loading Buffer将蛋白样品稀释至合适浓度；上样前将蛋白样品进行加热煮沸处理，然后进行蛋白电泳：80 V恒压电泳浓缩胶，120 V恒压电泳分离胶；电泳结束后进行电转：200-250 mA恒流转膜一到两个小时。转膜结束后使用5% BSA室温封闭一到两个小时，随后使用TBST洗涤3次，10 min/次，然后使用相应一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，10 min/次，接着使用对应二抗室温孵育一到两个小时，TBST洗涤3次，10 min/次，最后进行显影曝光：使用Image Lab图像采集软件进行拍摄，使用Image J分析软件进行蛋白条带的灰度分析。蛋白条带的分析方法：将每条泳道的目的蛋白条带的灰度值分别除以对应泳道的蛋白内参照，得到目的蛋白/内参照的比值，因至少重复3次实验，所以至少有3组比值，将全部数值的比值进行归一化处理，再进行统计分析。
1.4.8   流式细胞仪检测细胞凋亡   PC12细胞进行氧糖剥夺/复糖复氧处理后，完全弃去旧培养基，使用不含EDTA的胰酶消化细胞，收集细胞后以2 000 r/min离心5 min，再用无菌PBS洗涤一两次，2 000 r/min离心5 min，洗干净上清液后加入250-500 μL Binding Buffer重悬细胞并将细胞悬液转移到流式进样管中。流式上机前移动到避光环境，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide到流式进样管内，与细胞充分混匀，室温避光反应5-10 min，随后调节Merck KGaA流式细胞仪至适当参数后进行上样检测。 
1.5   主要观察指标   ①细胞活力；②乳酸脱氢酶释放率；③细胞凋亡染色与细胞凋亡率；④炎症蛋白和凋亡蛋白表达水平；⑤PI3K/AKT信号通路蛋白表达水平。
1.6   统计学分析   实验数据以x±s表示。使用SPSS 25.0数据统计软件和GraphPad Prism 8.0绘图分析软件进行数据的统计与分析，两组间的比较使用t检验，多组间的比较使用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义，P > 0.05则认为差异无显著性意义。文章统计学方法已经通过广州中医药大学科技创新中心生物统计学专家审核。

缺血再灌注损伤是一种极其复杂的病理生理过程，能够激活细胞凋亡的内源性途径和外源性途径，促进细胞的凋亡[18]，还能诱导炎症细胞因子的表达，促进炎症反应的发生，破坏抗炎和促炎反应的动态平衡，加重对脑组织的损伤[19-20]。为便于体外研究，氧糖剥夺/复糖复氧损伤经常被用作缺血再灌注损伤的模型[21-23]。该研究发现，随着氧糖剥夺的时间延长，PC12细胞损伤的程度逐渐加重，主要表现为PC12细胞的活力随着时间延长而下降。同时，氧糖剥夺/复糖复氧损伤能够促进细胞凋亡，增加乳酸脱氢酶的释放，增强了炎症相关因子NLRP3、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和凋亡相关蛋白BAX、活化Caspase-9的表达。

人参皂苷是人参的主要活性成分，体内外模型表明人参皂苷可以对大脑产生多种药理作用，包括减弱兴奋性毒性、抗氧化应激、调节神经炎症和抗凋亡等[24-27]。在众多人参皂苷中，人参皂苷Rg3主要被用于癌症、代谢性疾病等的研究[16，28]，关于脑血管疾病的研究较少。最新的研究发现，人参皂苷Rg3可以有效保护大脑免受缺血性损伤，并且Rg3与其他多种人参皂苷相比，具有最强的治疗活性[17]。该研究利用氧糖剥夺/复糖复氧构建体外脑缺血再灌注损伤模型，进一步探索Rg3的神经保护作用以及相关机制，结果表明，人参皂苷Rg3能够对氧糖剥夺/复糖复氧损伤的PC12细胞起保护作用，主要表现在提高细胞活力，减少乳酸脱氢酶的释放，抑制炎症相关因子NLRP3、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的表达，从而减轻氧糖剥夺/复糖复氧诱导的炎症损伤。除此之外，Rg3还能够降低凋亡蛋白BAX和抑制活化的Caspase-9的表达，发挥抗凋亡的作用。意外的是，在氧糖剥夺/复糖复氧损伤后，活化的Caspase-3表达明显下降，而使用Rg3治疗后，会促进活化Caspase-3的表达。在凋亡相关途径中，Bax是一种促凋亡基因，其上调可以促进细胞凋亡[29]，而Caspase-3和Caspase-9是细胞凋亡的重要标志蛋白。Caspase-9作为细胞凋亡的起始蛋白，激活后会切割并激活下游的Caspase，例如Caspase-3、6和7等，从而启动细胞凋亡[30]，但也有研究表明Caspase-9被激活后，即使下游的效应Caspase因子不发挥促凋亡作用，具有活性凋亡体的细胞仍会死亡[31]。Caspase-3作为细胞凋亡的主要执行者，活化后可以降解细胞内结构蛋白和功能蛋白，并诱导细胞死亡[32]。除此之外，也有研究表明Caspase-3对正常大脑发育极为重要[33-34]， 并且与Caspase-7的功能不同，Caspase-3可以抑制活性氧的产生[31]，发挥抗氧化应激损伤的作用。因此，Rg3发挥抗凋亡作用与BAX、Caspase-3、Caspase-9蛋白密切相关，但具体作用机制仍需进一步研究。

PI3K/AKT通路是一条经典的调节细胞分化、代谢、炎症以及细胞凋亡的信号传导通路[35-36]。目前研究发现，PI3K/AKT信号通路在神经系统中广泛存在，与神经细胞的存活与凋亡密切相关[37-39]。1999年，Kitagawa等[40]首次发现，脑缺血损伤时会激活PI3K/AKT通路。近年的研究也表明PI3K/AKT信号通路与脑缺血损伤密切相关[41-43]。该研究观察到氧糖剥夺/复糖复氧损伤模型会激活PI3K/AKT信号通路，促进PI3K、AKT的磷酸化；当使用特异性的PI3K/AKT通路抑制剂LY294002时[44]，p-PI3K和p-AKT的表达被抑制，并且还观察到乳酸脱氢酶释放的减少，NLRP3、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和BAX蛋白水平的降低，表明PI3K/AKT通路可能调节氧糖剥夺/复糖复氧损伤诱导的炎症因子和凋亡因子的表达，影响炎症反应和细胞凋亡。当使用人参皂苷Rg3处理受到氧糖剥夺损伤的PC12细胞后，同样观察到p-PI3K和p-AKT表达下调，相关炎症因子和凋亡因子的表达下降，炎症反应和细胞凋亡得到抑制。进一步研究发现，使用AKT激活剂SC79后[45]，Rg3下调p-AKT的作用减弱，同时炎症相关因子NLRP3、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β以及凋亡相关蛋白BAX表达水平回升，乳酸脱氢酶的释放也有轻度升高，表明Rg3的保护作用被部分抵消，证明P-AKT的上调至少部分抵消了Rg3对PC12细胞的保护作用。这些数据表明，人参皂苷Rg3通过抑制PI3K/AKT信号通路，抑制PI3K和AKT的磷酸化，从而发挥其抗炎、抗凋亡的神经保护作用。

因此，人参皂苷Rg3可以改善氧糖剥夺/复糖复氧诱导的PC12细胞损伤，主要通过抗炎和抗凋亡来发挥保护作用，并且这与PI3K/AKT信号通路的抑制密切相关。该研究为后期进行PI3K/AKT信号通路上下游因子的深入研究提供了初步实验数据，同时也为深入研究人参皂苷Rg3对缺血再灌注损伤的保护作用以及作用机制奠定基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
人参皂苷Rg3：是一种原人参二醇，具有显著的抗肿瘤功效，但在神经系统相关疾病方面的研究很少。有研究指出人参皂苷Rg3与多种人参皂苷相比，神经保护作用更强，能够促进神经功能的恢复，但是其具体保护作用以及相关机制尚不明确。
氧糖剥夺/复糖复氧损伤：脑缺血再灌注损伤是中枢神经系统最常见的病理损伤之一，而氧糖剥夺/复糖复氧损伤是缺血再灌注损伤的经典体外模型，通过让细胞缺糖缺氧再复糖复氧，模拟缺血再灌注导致的细胞凋亡、氧化应激、炎性反应、线粒体功能障碍等多种病理损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

人参为五加科人参属植物，其性温、甘、微苦，归脾、肺、心经。人参的种类有许多，其中包括三七参、西洋参、高丽参等。人参皂苷是各类人参发挥药理作用的主要活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老等多种功能。目前关于人参皂苷Rg3的研究主要集中在癌症、糖尿病等领域，与脑缺血疾病相关的研究较少，且相关的药理作用机制尚不明确。该实验对人参皂苷Rg3进行了深入研究，通过构建体外脑缺血再灌注模型，筛选出合适的Rg3给药浓度，探讨人参皂苷Rg3对氧糖剥夺/复糖复氧损伤PC12细胞的保护作用以及相关机制，为人参皂苷Rg3治疗脑缺血疾病提供一定的实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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