人脐带间充质干细胞来源外泌体减轻大鼠脊髓星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧损伤所致的水肿

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1788

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (25): 4011-4017.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1788

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人脐带间充质干细胞来源外泌体减轻大鼠脊髓星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧损伤所致的水肿

张勇^1，2，马迅¹，孙麟¹，张丽¹，关晓明¹，吕聪¹，陈旭¹

¹山西医科大学附属大医院骨科，山西省太原市 030032；²乡宁县人民医院骨科，山西省临汾市 042100

修回日期:2019-03-13 出版日期:2019-09-08 发布日期:2019-09-08
通讯作者: 马迅，教授，博士生导师，主任医师，山西医科大学附属大医院骨科，山西省太原市 030032
作者简介:张勇，男，1982年生，山西省运城市人，山西医科大学在读硕士，主要从事脊柱脊髓损伤的研究。
基金资助:
山西省科技成果转化引导专项(201604D132044)，项目负责人：马迅；山西省卫生和计划生育委员会青年项目(2015001)，项目负责人：张丽；山西省卫生和计划生育委员会青年项目(201601012)，项目负责人：关晓明

Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells attenuate edema of spinal astrocytes after oxygen-glucose deprivation/reoxygenation injury in rats

Zhang Yong^{1, 2}, Ma Xun¹, Sun Lin¹, Zhang Li¹, Guan Xiaoming¹, Lü Cong¹, Chen Xu¹

¹Department of Orthopedics, Shanxi Dayi Hospital Affiliated to Shanxi Medical University, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China; ²Department of Orthopedics, Xiangning County People’s Hospital, Linfen 042100, Shanxi Province, China

Revised:2019-03-13 Online:2019-09-08 Published:2019-09-08
Contact: Ma Xun, Professor, Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Orthopedics, Shanxi Dayi Hospital Affiliated to Shanxi Medical University, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China
About author:Zhang Yong, Master candidate, Department of Orthopedics, Shanxi Dayi Hospital Affiliated to Shanxi Medical University, Taiyuan 030032, Shanxi Province, China
Supported by:
Special Project for the Commercialization of Scientific Achievements in Shanxi Province, No. 201604D132044 (to MX); Youth Project of the Shanxi Provincial Health and Family Planning Commission, No. 2015001 (to ZL) and 201601012 (to GXM)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人脐带间充质干细胞来源外泌体：从足月妊娠健康新生儿脐带中提取脐带间充质干细胞，再从脐带间充质干细胞内提取的盘状小囊泡，是一种新发现的重要的细胞间调控分子，在脊髓损伤疾病治疗过程中脐带间充质干细胞来源外泌体具有非常重要的作用，也许将成为未来治疗脊髓损伤疾病的一种新方式。
星形胶质细胞：在神经系统中，星形胶质细胞广泛分布于中枢神经系统各个区域，是主要的细胞组成部分。星形胶质细胞在脊髓损伤的发生、发展与脊髓功能恢复过程中起到关键性的作用，利用其胶质分隔作用保护神经元胞体、轴突和微小血管的结构和功能。

摘要
背景：外泌体对神经细胞具有调控修复作用，从而促进神经细胞增生，减轻脊髓损伤，但外泌体对脊髓损伤水肿作用的相关研究较少。
目的：探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体减轻氧糖剥夺/复氧损伤大鼠脊髓星形胶质细胞水肿的作用及机制。
方法：超高速离心法分离提取人脐带间充质干细胞外泌体，采用胰酶消化法提取新生SD大鼠脊髓星形胶质细胞。第一部分实验分组：①对照组，细胞正常培养，未进行氧糖剥夺/复氧处理；②模型组：氧糖剥夺6 h/复氧24 h；③人脐带间充质干细胞外泌体组：氧糖剥夺6 h/复氧24 h，在复氧过程的培养基中分别加入30，60，90 μg人脐带间充质干细胞外泌体，作用24 h。Western blot检测细胞AQP4蛋白表达，活细胞工作站检测细胞体积，透射电镜观察细胞水肿超微结构变化。第二部分实验分组：①对照组：细胞正常培养，未进行氧糖剥夺/复氧处理；②模型组：氧糖剥夺6 h/复氧24 h；③人脐带间充质干细胞外泌体组：氧糖剥夺6 h/复氧24 h，在复氧过程的培养基中加入90 μg人脐带间充质干细胞外泌体，作用24 h；④JNK受体抑制剂SP600125组：氧糖剥夺6 h/复氧24 h，在复氧过程的培养基中加入5 μmol/L JNK受体抑制剂 SP600125，作用24 h。Western blot检测细胞AQP4及p-JNK蛋白表达，活细胞工作站检测细胞体积。
结果与结论：①与模型组比较，人脐带间充质干细胞外泌体干预24 h后，透射电镜可见线粒体、内质网水肿减轻，溶酶体数量减少，细胞水肿体积显著降低(P < 0.05)，AQP4蛋白的表达量减少(P < 0.05)；②与模型组比较，人脐带间充质干细胞外泌体与JNK抑制剂SP600125干预后，细胞中AQP4、p-JNK表达明显降低 (P < 0.05)，细胞水肿体积显著降低(P < 0.05)；③结果表明，人脐带间充质干细胞外泌体可通过抑制JNK信号通路降低氧糖剥夺/复氧损伤后脊髓星形胶质细胞AQP4蛋白的表达，减轻细胞水肿。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9358-7124(张勇)

关键词: 人脐带间充质干细胞外泌体, 星形胶质细胞, 脊髓损伤, 氧糖剥夺/复氧损伤, 细胞水肿, AQP4, JNK受体抑制剂

Abstract:

BACKGROUND: Exosomes can regulate and repair nerve cells, thus promoting the proliferation of nerve cells to alleviate spinal cord injury. Exosomes have been less reported to alleviate edema after spinal cord injury.
OBJECTIVE: To study the effect and mechanism by which human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes (hucMSCs-exo) alleviate the edema of spinal astrocytes induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation.
METHODS: Ultrahigh speed centrifugation method was used to isolate and extract hucMSCs-exo. Spinal astrocytes were extracted from newborn Sprague-Dawley rats by trypsin digestion. Part One: The cells were (1) cultured normally in normal control group, (2) subjected to 6 hours of oxygen-glucose deprivation and 24 hours of reoxygenation in model group, or (3) cultured in medium containing 30, 60, and 90 μg of hucMSCs-exo for 24 hours following 6 hours of oxygen-glucose deprivation and 24 hours of reoxygenation in hucMSCs-exo group. Western blot assay was performed to detect the expression of AQP4. Living cell workstation was used to detect cell volume. Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure of intracellular edema. Part Two: The cells were (1) cultured normally in normal control group, (2) subjected to 6 hours of oxygen-glucose deprivation and 24 hours of reoxygenation in model group, (3) cultured in medium containing 90 μg of hucMSCs-exo for 24 hours following 6 hours of oxygen-glucose deprivation and 24 hours of reoxygenation in hucMSCs-exo group, or (4) cultured in medium containing 5 μmol/L JNK inhibitor sp600125 for 24 hours following 6 hours of oxygen-glucose deprivation and 24 hours of reoxygenation in JNK inhibitor sp600125 group. AQP4 expression and p-JNK protein expression were measured by western blot assay. Living cell workstation was used to detect cell volume
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After 24-hour hucMSCs-exo intervention, mitochondrial and endoplasmic reticular edemas were alleviated, the number of lysosomes decreased, the volume of intracellular cell edema was significantly reduced, and the expression of AQP4 in the cells was significantly lowered as compared with the model group (P < 0. 05). (2) Intervention with hucMSCs-exo and JNK inhibitor SP600125 significantly reduced the expression of AQP4 and p-JNK (P < 0.05) and the volume of intracellular edema (P < 0.05) as compared with the model group. Therefore, hucMSCs-exo can reduce the expression of AQP4 protein in spinal astrocytes after oxygen-glucose deprivation/reoxygenation by inhibiting JNK signaling pathway, thereby alleviating cell edema.

Key words: human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes, astrocytes, spinal cord injury, oxygen-glucose deprivation/reoxygenation injury, intracellular edema, AQP4, JNK receptor inhibitor

中图分类号:

张勇，马迅，孙麟，张丽，关晓明，吕聪，陈旭. 人脐带间充质干细胞来源外泌体减轻大鼠脊髓星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧损伤所致的水肿[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(25): 4011-4017.

Zhang Yong, Ma Xun, Sun Lin, Zhang Li, Guan Xiaoming, Lü Cong, Chen Xu. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells attenuate edema of spinal astrocytes after oxygen-glucose deprivation/reoxygenation injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(25): 4011-4017.

图/表（结果） 6

2.1 人脐带间充质干细胞外泌体形态及表面标志 透射电镜观察外泌体直径介于40-120 nm之间，大小不一、具有茶托样或凹半球样结构，见图1A，B。Western blot方法检测外泌体中CD9呈阳性表达，见图2。

2.2 人脐带间充质干细胞外泌体对氧糖剥夺/复氧后脊髓星形胶质细胞水肿的影响 通过活细胞工作站检测上述各组细胞体积，与正常对照组细胞体积[(3 527.85±759.36) μm³]相比，模型组细胞体积[(6 024.36±860.26) μm³]明显增高(P=0.019 6)，加入人脐带间充质干细胞外泌体后，能明显降低细胞水肿的体积，并且随着外泌体浓度的增高，体积减少越明显，见图3。

2.3 透射电镜观察人脐带间充质干细胞外泌体对氧糖剥夺/复氧后星形胶质细胞水肿的影响 正常细胞胞质内细胞器形态结构正常，染色质分布均匀。氧糖剥夺/复氧后，多数线粒体形态结构肿胀，有的粗面内质网也会发生肿胀，质膜断裂，胞质中溶酶体数量增多。人脐带间充质干细胞外泌体能明显降低细胞线粒体、内质网的水肿损伤情况，减少溶酶体数量，见图4。

2.4 人脐带间充质干细胞外泌体对氧糖剥夺/复氧后脊髓星形胶质细胞AQP4蛋白表达的影响 模型组AQP4的蛋白表达明显高于正常对照组(P=0.001 4)。人脐带间充质干细胞外泌体干预后，AQP4蛋白的表达量明显减少，并且随着人脐带间充质干细胞外泌体浓度的增加蛋白表达量减少越多，见图5。

2.5 JNK受体抑制剂SP600125对氧糖剥夺/复氧后大鼠脊髓星形胶质细胞体积的影响 与模型组细胞体积 [(6 024.36±860.26) μm³]相比，JNK受体抑制剂SP600125组细胞体积降低，为(3 751.37±736.42) μm³，差异有显著性意义(P=0.025 4)，见图6。

2.6 JNK受体抑制剂SP600125对氧糖剥夺/复氧后大鼠脊髓星形胶质细胞AQP4蛋白表达及核中JNK活化的影响 模型组AQP4蛋白的表达明显高于正常对照组(P < 0.05)；与模型组比较，人脐带间充质干细胞外泌体及SP600125能明显降低AQP4蛋白的表达及核中JNK活化(P < 0.05)，见图7。

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引言

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤性疾病。急性脊髓损伤后继发脊髓水肿、出血、炎性反应、局部缺血等，特别是水肿可致一系列放大效应，导致严重后果^[1-3]。

间充质干细胞是体内一类具有增殖、分化潜能的成体干细胞，被认为是产生外泌体能力最强的细胞。研究表明外泌体在神经细胞修复中具有重要作用^[4-5]。与其他成人干细胞相比，人脐带间充质干细胞更原始，再生性与适应性更好，脐带中干细胞含量更多^[6-8]。将神经元和星形胶质细胞在表达miR-133b的间充质干细胞来源外泌体中培养，发现外泌体使神经细胞突起的数量增多，长度增加，具有促进神经生长的作用^[9]。

脊髓损伤后星形胶质细胞上AQP4的表达发生变化，AQP4参与了脊髓损伤后水肿形成和消退。有研究用氧糖剥夺后复氧模型模拟脊髓损伤后缺血再灌注状态，培养脊髓星形胶质细胞，发现星形胶质细胞AQP4表达增强，细胞水肿加重且氧糖剥夺6 h/复氧24 h时细胞水肿最严重^[10-11]。以往研究表明，外泌体可通过下调星形胶质细胞AQP4表达从而减轻星形胶质细胞水肿，对脑组织损伤起到保护作用^[12]。星形胶质细胞可通过JNK信号通路被激活^[13]。因此作者推测外泌体可通过下调脊髓星形胶质细胞AQP4表达以达到减轻脊髓星形胶质细胞水肿的作用，其机制可能涉及到JNK通路。为证实这一假说，实验拟制备脊髓星形胶质细胞氧糖剥夺后复氧模型，应用细胞形态学及分子生物学技术，观察人脐带间充质干细胞来源外泌体对氧糖剥夺/复氧损伤大鼠脊髓星形胶质细胞水肿的作用及机制，为急性脊髓损伤寻找一种新的治疗方法并提供细胞实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年2至11月在山西医科大学转化医学中心实验室完成。

1.3 材料 6例足月妊娠健康新生儿脐带(由山西医科大学附属大医院妇产科提供并通过伦理委员会批准，征求产妇及家属同意)；新生SD大鼠6只，2 d龄，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(军)2012-0004。

实验试剂与仪器：DMEM/F12培养基、DMEM高糖培养基、DMEM无糖培养基、胎牛血清(Gibco公司)；CD9抗体(上海生工公司)；山羊抗鼠二抗(碧云天公司)；山羊抗兔二抗(碧云天公司)；兔多克隆抗体AQP4(Abcam公司)；兔单克隆抗体JNK(CST公司)；JNK受体抑制剂(SP600125) (Invivo Gen公司)；活细胞工作站(Delta Vision Applied Precision公司)；HITACHI超高速离心机(日立公司)；透射电子显微镜(Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 原代人脐带间充质干细胞的培养及其外泌体的提取方法 采用组织块培养方法获得人脐带间充质干细胞。该课题团队已经建立起成熟的原代脐带间充质干细胞培养及鉴定方法^[14]。收集第3代人脐带间充质干细胞的培养上清，采用高速超速离心法提取外泌体^[15]，具体步骤简述如下：①通过“饥饿”预处理收集第3代人脐带间充质干细胞培养上清液200 mL；②4 ℃，300×g低速离心10 min；③4 ℃，2 000×g离心10 min；④将收集的上清液重新分装，按离心参数(10 000×g，30 min，4 ℃)离心，收集上清液；⑤4 ℃，100 000×g条件下超速离心70 min，弃去上清，即可获得外泌体，重悬于PBS中，用BCA法测定外泌体质量浓度，并调整至0.2 g/L，-80 ℃保存备用。

1.4.2 人脐带间充质干细胞外泌体的鉴定 ①形态观察：透射电镜观察外泌体形态是目前鉴定外泌体的国际通用手段^[16]；②Western blot检测表面标志：采用 Western blot方法检测外泌体中CD9的表达。

1.4.3 原代大鼠脊髓星形胶质细胞的培养^[17] 取新生2 d内SD大鼠，取出脊髓组织，仔细剥离脊膜和血管，用剪刀剪成1 mm的小块，加入0.125%胰蛋白酶，37 ℃温箱中反复消化，加入完全培养基终止消化，离心收集细胞沉淀，加入培养液吹打成单细胞悬液，将细胞悬液接种于培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养30 min进行差速黏附处理。取出培养瓶，轻轻翻转，吸取细胞悬液以1×10⁶/cm²接种于新的培养瓶中培养，培养三四天后换液，待细胞融合度达90%以上进行1∶2消化传代培养，生长到第3代得到纯化成熟的星形胶质细胞，用于后续实验。

1.4.4 实验分组

第一部分：①对照组，细胞正常培养，未进行氧糖剥夺/复氧处理；②模型组：氧糖剥夺6 h/复氧24 h；③氧糖剥夺6 h/复氧24 h+人脐带间充质干细胞外泌体组：氧糖剥夺6 h/复氧24 h，在复氧过程的培养基中分别加入30，60，90 μg人脐带间充质干细胞外泌体，作用24 h。

第二部分：①对照组，细胞正常培养，未进行氧糖剥夺/复氧处理；②模型组：氧糖剥夺6 h/复氧24 h；③氧糖剥夺6 h/复氧24 h+人脐带间充质干细胞外泌体组：氧糖剥夺6 h/复氧24 h，在复氧过程的培养基中加入90 μg人脐带间充质干细胞外泌体，作用24 h；④氧糖剥夺6 h/复氧24 h+ SP600125组：氧糖剥夺6 h/复氧24 h，在复氧过程的培养基中加入5 μmol/L JNK受体抑制剂SP600125，作用24 h。

1.4.5 氧糖剥夺/复氧模型的建立^[18-19] 首先，去掉原有培养瓶内的细胞培养基，PBS漂洗1-3遍，加入无血清、无糖的DMEM培养基，置于体积分数为1%O₂、5%CO₂、94%N₂的三气培养箱中孵育6 h(以O₂含量达到设定值1%开始进行计时)，再灌注实验时，弃掉瓶中无血清、无糖DMEM培养基，再加入原来的星形胶质细胞培养基，置于复氧孵育箱继续培养，复氧24 h进行细胞观察并行相关实验检测。

1.4.6 星形胶质细胞的形态观察 在光学显微镜下观察各组细胞形态变化。

1.4.7 活细胞工作站检测细胞体积 将各组细胞接种于含DMEM高糖培养基的6孔板，每孔接种约6×10⁵个细胞，培养24 h后按上述分组干预细胞。细胞测量前1 h，各组细胞培养液中加入染色剂DiI，然后继续培养1 h，PBS漂洗3遍，将细胞消化成单细胞悬浮液，移到共聚焦四分皿里，放在活细胞工作站扫描孔中，光镜下随机选定其中1个细胞，然后进行扫描。将扫描后的图像利用软件进行压缩重叠合成，获得此时球形细胞的最大平面，利用测量工具测量细胞面的4条直径，求出平均直径，计算出细胞的近似体积。

1.4.8 透射电镜观察外泌体的形态、氧糖剥夺/复氧后星形胶质细胞水肿超微结构变化

(1)透射电镜观察外泌体的形态：①用移液枪吸取外泌体悬液大约10 μL，缓慢滴于200目载样铜网上，在室温下静置2 min；②用薄型滤条干燥载样铜网一侧的液体，然后在同一片载样铜网上滴加20 μL 0.1%的磷钨酸，室温下负染5 min；③使用细长滤纸条从载样铜网侧面吸干负染液，在白炽灯下烤干，把载样铜网放到透射电镜下观察悬浮的颗粒物形态，确定外泌体的大小。

(2)透射电镜观察氧糖剥夺/复氧后星形胶质细胞水肿超微结构变化：①贴壁细胞处理：倒出细胞培养液，胰蛋白酶消化，将培养液收集到1.5 mL EP管内，离心(2 000 r/min，10 min)，弃上清，使细胞厚度至少达到1 mm；②固定：加入2.5%戊二醛固定30 min，0.1 mol/L PBS漂洗3次，然后用1%锇酸固定1 h；③分别用体积分数为50%，70%，80%，90%(2次)，100%(2次)丙酮梯度脱水，10 min/次。经丙酮和包埋剂(Epon812)分别以1∶1、1∶2和1∶3比例混合浸透，60 min/次。纯包埋剂浸透3 h后，包埋并置于37 ℃烘箱聚合12 h，60 ℃烘箱聚合48 h，制作超薄切片，厚度60 nm，再以醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染法染色后上透射电镜观察。

1.4.9 Western blot测定人脐带间充质干细胞外泌体表面标志CD9、星形胶质细胞AQP4及p-JNK蛋白表达水平 ①根据实验目的分别选用10%分离胶和5%浓缩胶，缓慢注胶至离玻璃口平面1.5 cm，注入异丙醇进行压胶，常温静置30 min，待其凝固后，弃去异丙醇，在玻璃空隙中加满积层胶，并插上15孔梳子，防止产生气泡，常温静置30 min，待其凝固；②上样：拔掉梳子，在每个规定的梳孔中分别加入20 µg蛋白样品和5 µL Marker；③电压60 V电泳1 h后，将电压改为80 V继续电泳至溴酚蓝近胶底处；④切除掉多余的分离胶，将含有目的条带的分离胶置于配置好的电转液中，并剪切与胶大小合适的PVDF膜置于甲醇中1 min后放于电转液中，将转膜夹的黑色一侧放在下面，将厚滤纸、分离胶、PVDF膜、薄滤纸依次摆放在夹中，接通电源，电流调为250 mA，电转90 min后取出PVDF膜进行封闭；⑤封闭：将膜放于5%的脱脂奶粉中，37 ℃孵育2 h；⑥孵育一抗：用5%的脱脂奶粉稀释一抗，将抗体均匀敷在PVDF膜上，4 ℃冰箱过夜；⑦孵育二抗：次日，将膜用TBST漂洗10 min×3次，用封闭液稀释山羊抗小鼠/兔二抗，将PVDF膜置于配置好的抗体中，室温摇床孵育2 h。二抗孵育后，TBST漂洗×3 次；⑧显影：打开BIO凝胶成像仪，预热5 min，配制适量增强型ECL发光液滴在PVDF膜上，曝光显影后得出相应蛋白条带，并用相关软件算出各条带的灰度值，与内参作比较，得出相应蛋白的表达量。

1.5 主要观察指标 ①人脐带间充质干细胞外泌体形态及表面标志；②人脐带间充质干细胞外泌体对氧糖剥夺/复氧后脊髓星形胶质细胞水肿的影响；③人脐带间充质干细胞外泌体对氧糖剥夺/复氧后脊髓星形胶质细胞AQP4蛋白表达的影响；④JNK受体抑制剂SP600125对氧糖剥夺/复氧后大鼠脊髓星形胶质细胞水肿的影响；⑤JNK受体抑制剂SP600125对氧糖剥夺/复氧后大鼠脊髓星形胶质细胞AQP4蛋白表达及核中JNK活化的影响。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0进行统计分析，计量资料采用x(_)±s表示，组间比较均采用单因素方差分析处理，进一步两两比较采用LSD法，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

人脐带间充质干细胞和其他大多数哺乳动物细胞一样，均可分泌外泌体，其外泌体除能有效转运母体细胞的mRNA、miRNAs和蛋白质，行使细胞-细胞之间信息交流的功能之外，还可作为靶向药物和基因治疗的载体，干细胞源外泌体用于特定miRNAs分子基因载体的研究日渐增多^[20-21]。外泌体的生物学效应取决于来源的细胞及细胞所处的微环境，不同应激状态下细胞外泌体内包裹的生物活性物质不同。例如，炎症条件下巨噬细胞产生的外泌体内含有调节大量炎症发展和转归的信号分子，如NF-κB、STAT3、核抑制因子、DNA损伤修复通路的相关信号分子等，而肿瘤细胞旁分泌的外泌体中则更多含有促进肿瘤发生发展的因子，如P53、Fasl、Bcl及Wnt-β-catenin等信号分子^[22]。目前，外泌体的功能已从免疫学拓展到神经学、干细胞与肿瘤等。近期有报道，包括外泌体在内的纳米颗粒，鉴于它们的尺寸越小，其所包含的信号越强，对机体产生的生物学效应也越强，这是关于外泌体的一个新的研究视角^[23]。首先实验成功分离提取出了人脐带间充质干细胞外泌体，并通过透射电镜和Western blot验证了外泌体的形态、大小及其特异性标志物。研究发现人脐带间充质干细胞外泌体可以成功被摄取内吞进入细胞并在细胞内聚集，且部分外泌体还能入核。外泌体作为一种新兴的重要的细胞间调控分子，在脊髓损伤疾病治疗过程中将具有非常重要的作用，也许将成为未来脊髓损伤疾病一种新的治疗方式。该研究在人脐带间充质干细胞来源外泌体的基本特征和潜在作用方面进行了初步探索，为后续外泌体在脊髓损伤领域的深入研究奠定了基础。

现在越来越多的证据表明星形胶质细胞在脊髓损伤修复过程中起到关键性的作用^[24^-25^]。Abdullah等^[2⁶^]报道淀粉样蛋白β能够通过抑制JNK通路减少星形胶质细胞的外泌体释放。研究显示miRNA可以通过阻断JNK磷酸化起到促进脊髓后索损伤修复的作用^[2⁷^]。Tang等^[2⁸^]报道星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧后AQP4的表达上调，细胞体积增加，导致细胞水肿，形态结构发生改变，使用小干扰核糖核酸沉默AQP4表达后，可明显改善星形细胞肿胀，并能抑制MAPK的过度活化，减少了AQP4的表达和细胞体积。在神经系统中，星形胶质细胞广泛分布于中枢神经系统各个区域，是最主要的细胞组成部分。在营养支持、信号传递、神经营养因子的释放、能量产生和新陈代谢方面等方面发挥着重要的作用^[2⁹^]。Cho等^[³⁰^]报道外泌体能够通过JNK通路对损伤的小鼠肝脏细胞起到保护作用。Jia等^[3¹^]研究显示抑制星形胶质细胞FAK-JNK信号通路对脑神经障碍起到保护作用。在此次研究中，通过氧糖剥夺/复氧制作星形胶质细胞水肿模型，选择氧糖剥夺6 h/复氧24 h作为实验时间点，在氧糖剥夺/复氧的过程中加入人脐带间充质干细胞外泌体，发现其能显著降低星形胶质细胞AQP4蛋白的表达，减小细胞体积，改善细胞水肿，并且随着人脐带间充质干细胞外泌体浓度的增高作用更加明显。该研究亦证实人脐带间充质干细胞外泌体通过抑制JNK信号通路在减轻星形胶质细胞水肿过程中发挥了重要作用。

文献中报道的透射电镜下外泌体形态图片各式各样，是提取外泌体的技术问题还是处理外泌体的方法有问题尚需进一步探索。Western blot方法检测外泌体表面标志的过程中是否会有其他蛋白的影响而出现假阳性的结果也需要在今后的实验中证实。活细胞工作站检测细胞体积过程会有多种影响因素，测量细胞体积时也会有人为因素影响最后测量结果，所以如何能使最终测得的细胞体积更有可靠性，将会在今后实验过程中进一步摸索。在生物体内，信号传递非常复杂，人脐带间充质干细胞外泌体减轻氧糖剥夺/复氧后脊髓星形胶质细胞水肿可能也伴有其他信号通路的激活，在今后的研究中还应该进一步明确各通路之间的相互作用。另外大剂量的外泌体是否能更好地减轻脊髓损伤后细胞水肿，人脐带间充质干细胞外泌体中是哪些成分发挥作用，体内实验是否会因其体内环境发生变化而影响实验结果。这些问题都需要在今后的研究中进一步证实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人脐带间充质干细胞来源外泌体减轻大鼠脊髓星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧损伤所致的水肿

Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells attenuate edema of spinal astrocytes after oxygen-glucose deprivation/reoxygenation injury in rats

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