振荡电场刺激脊髓损伤模型大鼠抑制神经炎症反应促进功能恢复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3088

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (11): 1717-1722.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3088

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振荡电场刺激脊髓损伤模型大鼠抑制神经炎症反应促进功能恢复

方超1，孙健1，魏来福2，高飞2，钱军1，2

1安徽医科大学第二附属医院，安徽省合肥市 230601；2安徽医科大学第一附属医院，安徽省合肥市 230031

收稿日期:2020-03-09 修回日期:2020-03-13 接受日期:2020-05-16 出版日期:2021-04-18 发布日期:2020-12-21
通讯作者: 钱军，博士，主任医师，硕士生导师，安徽医科大学第二附属医院，安徽省合肥市 230601；安徽医科大学第一附属医院，安徽省合肥市 230031
作者简介:方超，男，1995年生，安徽省宿松县人，汉族，安徽医科大学在读博士，主要从事脊柱与脊髓损伤的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81471273)，项目负责人，钱军

Oscillating field stimulation inhibits neuroinflammatory response and promotes functional recovery after spinal cord injury in rats

Fang Chao1, Sun Jian1, Wei Laifu2, Gao Fei2, Qian Jun1, 2

1The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230601, Anhui Province, China; 2The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230031, Anhui Province, China

Received:2020-03-09 Revised:2020-03-13 Accepted:2020-05-16 Online:2021-04-18 Published:2020-12-21
Contact: Qian Jun, MD, Chief physician, Master’s supervisor, the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230601, Anhui Province, China; the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230031, Anhui Province, China
About author:Fang Chao, MD candidate, the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230601, Anhui Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81471273 (to QJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
振荡电场：电场阴极刺激能显著促进轴突再生，而长期暴露于阳极的轴突最终萎缩。振荡电场即每隔15 min改变一次电场极性，减轻了电场阳极对神经轴突的抑制作用，使阴极对轴突生长的有益影响作用于头尾两个方向，从而实现轴突的双向生长。
损伤后炎症反应：炎症反应被认为是加速脊髓损伤病理生理变化的重要因素，包括趋化因子的募集、炎性细胞的浸润以及损伤局部星形胶质细胞和小胶质细胞的激活，这些变化加重了脊髓损伤的程度，使修复受损神经的难度显著增加。

背景：振荡场刺激是一种新兴的脊髓损伤治疗技术，在受伤的脊髓上施加电流可以促进愈合和组织再生。然而，振荡电场刺激导致脊髓损伤恢复的机制尚不完全清楚。
目的：探讨振荡电场能否通过减轻大鼠脊髓损伤后神经炎症反应促进神经功能恢复。
方法：雌性SD大鼠63只，随机被分为3组：实验组、脊髓损伤组和假手术组。假手术组大鼠仅行椎板切除术而不损伤脊髓；实验组和脊髓损伤组大鼠建立大鼠脊髓损伤模型，并在大鼠胸部(T9-T10)植入振荡电场刺激器装置，实验组在术后接受持续电刺激，脊髓损伤组不进行电刺激。用Basso-bettie-Bresnahan(BBB)评分法评价大鼠术后运动功能恢复情况；苏木精-伊红染色检测损伤部位组织修复和炎性细胞的募集；免疫荧光染色检测损伤部位星形胶质细胞和小胶质细胞的数量。动物实验方案由安徽医科大学实验动物伦理委员会批准，编号为LLSC20190736。
结果与结论：①BBB评分，实验组的BBB评分较脊髓损伤组显著增加；②苏木精-伊红染色结果表明，实验组损伤局部炎性细胞的数量较脊髓损伤组显著减少；③免疫荧光结果显示，实验组术后各时间点的神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞和小胶质细胞数量均明显少于脊髓损伤组；④结果说明，振荡电场刺激能改善大鼠脊髓损伤后的下肢运动功能，促进脊髓损伤后的组织修复，减轻炎性细胞募集，有效抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的激活；提示振荡电场可以通过抑制脊髓损伤后炎症反应促进神经功能恢复。
https://orcid.org/0000-0003-2284-9323 (钱军)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 振荡电场, 脊髓, 脊髓损伤, 炎症, 功能恢复, 再生, 星形胶质细胞

Abstract: BACKGROUND: Oscillating field stimulation (OFS) is an emerging technology that has been used to treat spinal cord injury (SCI) with promising therapeutic effects. The application of electric current to the injured spinal cord is known to promote healing and tissue regeneration. However, the mechanisms by which OFS leads to SCI recovery are not yet fully understood.
OBJECTIVE: To investigate whether OFS can promote the recovery of neurological function by reducing neuroinflammatory responses after SCI in rats.
METHODS: Sixty-three female Sprague-Dawley rats were randomized into an experimental group, a SCI group and a sham operation group. Rats in the sham operation group only underwent laminectomy without damaging the spinal cord, and animal models of thoracic (T9-T10) SCI were established in the SCI and experimental groups. The OFS device was implanted into the injured site in the experimental group, followed by continuous electrical stimulation. Basso-Bettie-Bresnahan score was used to evaluate the recovery of motor function after SCI in rats. In addition, hematoxylin-eosin staining was used to test tissue repair and inflammatory cell recruitment. The number of astrocytes and microglia was examined by immunofluorescence staining. The study protocol was approved by the Animal Ethics Committee of Anhui Medical University, with an approval No. LLSC20190736.
RESULTS AND CONCLUSION: The Basso-Bettie-Bresnahan score of the experimental group was significantly higher than that of the SCI group. Hematoxylin-eosin staining results showed that the number of inflammatory cells in the injured site was considerably reduced in the experimental group compared with the SCI group. The results of immunofluorescence detection showed that the number of glial fibrillary acidic protein positive cells and microglia in the experimental group was dramatically lower than that in the SCI group at different time after surgery. These findings indicate that OFS can improve the motor function of lower limbs, promote tissue repair, reduce inflammatory cell recruitment, and inhibit the activation of astrocytes and microglia after spinal cord injury in rats. OFS can promote the recovery of neurological function by inhibiting inflammatory response after SCI.

Key words: oscillating field, spinal cord, spinal cord injury, inflammation, functional recovery, regeneration, astrocyte

中图分类号:

方超, 孙健, 魏来福, 高飞, 钱军. 振荡电场刺激脊髓损伤模型大鼠抑制神经炎症反应促进功能恢复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1717-1722.

Fang Chao, Sun Jian, Wei Laifu, Gao Fei, Qian Jun . Oscillating field stimulation inhibits neuroinflammatory response and promotes functional recovery after spinal cord injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(11): 1717-1722.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠63只，分为3组，实验组与脊髓损伤组各有2只手术后死亡，予以及时补充模型，进入结果分析63只。
2.2 大鼠运动功能BBB评分假手术组术后各时间点的BBB评分为满分。实验组和脊髓损伤组大鼠术后双下肢完全瘫痪，运动完全依赖前肢。随着时间推移，实验组和脊髓损伤组大鼠的BBB评分逐渐增高，且实验组大鼠的BBB评分在术后14-35 d均高于脊髓损伤组，其中，术后21-35 d的BBB评分差异有显著性意义(P < 0.05，图1)。

2.3 振荡电场减轻脊髓损伤后局部炎性细胞浸润为了观察脊髓损伤后损伤局部的细微变化，对各组大鼠术后14 d的脊髓组织切片进行苏木精和伊红染色。结果显示，脊髓损伤组的组织缺损严重，而实验组损伤部位的组织较为完整(图2A)。在高倍镜下可见，脊髓损伤组局部有大量炎性细胞浸润，而实验组损伤局部炎性细胞的数量显著减少(P < 0.05，图2B，C)。

2.4 振荡电场抑制脊髓损伤后星形胶质细胞增生通过免疫荧光分析比较各组在术后不同时间点神经胶质纤维酸性蛋白的表达，结果显示假手术组术后神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数量较少，且各时间点无明显变化。实验组与脊髓损伤组术后的神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数量有显著提高，且随时间推移逐渐增高(图3A-C)，实验组术后各时间点的神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数量均明显少于脊髓损伤组，差异均有显著性意义(P < 0.05，图3D)。

2.5 振荡电场抑制脊髓损伤后小胶质细胞增生为了检测脊髓损伤后小胶质细胞的活化增生情况，对各组术后7，14和21 d的组织切片行IBA-1免疫荧光染色。结果显示，假手术组的IBA-1阳性细胞数无明显增高。实验组与脊髓损伤组术后的IBA-1阳性细胞数量随时间推移逐渐增高(图4A-C)，且实验组术后各时间点的IBA-1阳性细胞数量均明显少于脊髓损伤组 (P < 0.05，图4D)。

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验
1.2 时间及地点研究于2019年3至9月在安徽医科大学第二附属医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 动物 SPF级8周龄成年雌性SD大鼠63只，体质量220-240 g，购自安徽医科大学实验动物中心，许可证号： SYXK(皖)2011007。大鼠统一安置在26 ℃环境温度的动物房内饲养，内部环境湿度适宜，12 h/12 h昼夜节律。每3只大鼠一个饲养笼，大鼠可随意获取水和食物，笼中铺垫适量干木屑为垫料保持干燥，垫料每3 d更换1次。
1.3.2 振荡电场刺激装置振荡电场刺激装置由中国科学院电工研究所生物电磁学北京市重点实验室提供，采用有限元仿真的方法研究了电场刺激时脊髓上的电场强度分布，得到了刺激电流与电场强度的对应关系。该装置尺寸为24 mm×22 mm，由3.0 V主电池(CR1220)供电，输出电流为40 μA，正负极之间的电场强度为400 μV/mm。电源由感应系统控制，每隔15 min改变一次电场极性。项目组前期的研究已经证实，植入式振荡电场刺激器在动物体内具有良好的生物相容性[3，6]。
1.3.3 实验用主要试剂及仪器兔多克隆抗体神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP，G9269，Sigma，美国)；鼠多克隆抗体IBA-1(GB12105)、二抗CY3标记山羊抗兔IgG(GB21303)、CY3标记山羊抗鼠IgG(GB21301)(Servicebio，中国)；显微镜(Eclipse E100，尼康，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组将动物随机分为3组：实验组(n=21)，脊髓损伤组(n=21)和假手术组(n=21)。假手术组大鼠仅行椎板切除术而不损伤脊髓，实验组和脊髓损伤组大鼠均接受椎板咬除、脊髓打击和振荡电场刺激器植入，但只有实验组在术后接受持续电刺激，脊髓损伤组大鼠的刺激器不予通电。动物实验有关的所有操作均按照安徽医科大学动物伦理委员会的要求进行。所有的实验设计都是为了尽可能减少动物的痛苦和使用数量。

1.4.2 大鼠脊髓损伤模型制备腹腔注射300 mg/kg水合氯醛麻醉大鼠，大鼠呼吸平稳、四肢肌力明显减弱、疼痛反射与角膜反射消失表示麻醉成功。将麻醉后的大鼠固定于手术台上，剃除背部毛发，用碘伏棉球擦拭2遍消毒皮肤。计数肋骨确定T10水平，并以T10水平为中心在背部正中作一个3 cm长的纵向切口。钝性剥离椎旁肌，用咬骨钳去除棘突和椎板，彻底暴露T9-T10节段脊髓，操作过程中要小心避免额外的组织损伤。用10 g NYU打击器自3 cm高度自由下落打击暴露的脊髓中心造成脊髓损伤，脊髓明显充血、水肿，大鼠出现后肢和尾部抽搐表明造模成功。将振荡电场装置电极缝接在损伤节段上下棘突根部，并将装置缝合到外表皮。最后，各组大鼠均采用4-0缝线逐层缝合切口，碘伏棉球擦拭切口2遍消毒。脊髓损伤模型完成后，实验组的电场刺激装置即予以通电并开始持续电场刺激，直至实验结束。为预防感染和降低术后死亡率，所有大鼠术后皮下注射青霉素G(105 U/kg)，每日1次，连续3 d。每8 h进行1次人工膀胱排空，直至大鼠恢复自主排尿。假手术组大鼠未发生术后死亡，实验组与脊髓损伤组各有2只大鼠手术后死亡，发现后及时补充模型。
1.4.3 运动功能评分 Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分被广泛应用于评价脊髓损伤后大鼠功能性运动恢复[7-8]。将动物放置于平台上，观察臀、膝、踝关节的行走和躯干运动及其协调情况，评分范围为0-21分，0分代表完全瘫痪，每增加一分表示运动功能逐渐恢复。在术后7，14，21，28和35 d采用BBB评分法评价各组大鼠运动功能恢复及后肢协调情况，每只大鼠在术后各时间点由2名独立观察者进行评估，并在最终分析中取平均数。
1.4.4 取材及标本制作在术后7，14和21 d将各组大鼠深度麻醉后，打开大鼠胸腔暴露心脏，由心尖处向左心室插入注射器针头，同时剪开右心耳，匀速注入冰冻PBS 300 mL，待大鼠肺和肝脏发白及右心房流出液澄清，再匀速注入40 g/L多聚甲醛300 mL灌注固定。分离出大鼠脊柱，去除肌肉和椎骨，取下以损伤部位为中心的1 cm长脊髓组织，置于组织盒中流水冲洗。洗净后放入40 g/L多聚甲醛中固定12 h，常规脱水后石蜡包埋，在损伤部位处连续横向切片，另取各组大鼠术后14 d的组织沿正中线作纵向切片，切片厚度均为10 μm，写好标签后-20 ℃保存备用。
1.4.5 苏木精和伊红染色将各组术后14 d的组织切片放入二甲苯(Ⅰ，Ⅱ)中，然后在体积分数100%(Ⅰ，Ⅱ)、90%，80%和70%的乙醇中各放置5 min脱蜡至水，蒸馏水冲洗5 min×3次。切片放入苏木精染液5 min(视染色情况适当调整时间)，流水冲洗。滴加5%乙酸分化1 min，洗净乙酸后用0.6%氨水返蓝，流水冲洗。再将切片置于伊红染液中染色2 min，依次放入体积分数70%，80%，90%和100%的乙醇中各10 s，二甲苯中1 min脱水透明，晾干切片后中性树胶封固。在显微镜下观察染色结果并采集图像。
1.4.6 免疫荧光染色组织切片放入盛满EDTA的修复盒，在微波炉内进行抗原修复(中火8 min停火8 min转中低火7 min)。切片自然冷却后用PBS冲洗5 min×3次，甩干切片，用组化笔在组织周围画圈并加入自发荧光猝灭剂5 min，流水冲洗10 min。在圈内滴加BSA孵育30 min，甩去封闭液，在切片上滴加兔多克隆抗体神经胶质纤维酸性蛋白或鼠多克隆抗体IBA-1，放于湿盒内4 ℃孵育过夜。用PBS冲洗切片后滴加相应二抗CY3标记山羊抗兔IgG或CY3标记山羊抗鼠IgG覆盖组织，避光室温孵育50 min。切片冲洗甩干后滴加DAPI染液避光室温孵育10 min，用抗荧光猝灭封片剂封固，在荧光显微镜下观察并采集图像(DAPI发蓝光，CY3发红光)。
1.5 主要观察指标 ①大鼠运动功能BBB评分；②脊髓组织切片苏木精和伊红染色观察；③大鼠不同时间点脊髓损伤部位组织神经胶质纤维酸性蛋白表达及小胶质细胞的活化增生情况。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，t检验用于组间比较，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

脊髓损伤是一种创伤性中枢神经系统疾病，有很高的发病率和致残率，在世界各地每年都有大量的脊髓损伤新发病例，为社会带来沉重的负担[9-11]。脊髓损伤的定义为脊髓节段或神经根的损伤，这种损伤常常导致永久性的功能改变。脊髓损伤的症状因损伤部位和程度的不同而不同，如瘫痪或肌肉力量减弱、受伤部位以下的感觉和运动功能障碍。在骨折碎片压迫或暴力直接刺激造成脊髓原发性损伤后，会引发一系列病理生理变化，这些变化加重了脊髓损伤的程度、阻碍了脊髓的修复过程，包括继发性炎症反应、神经元坏死和凋亡、轴突脱髓鞘以及胶质瘢痕的形成[12-13]。尽管目前临床上存在许多治疗脊髓损伤的方案，如手术减压、药物治疗、干细胞移植等，但其治疗效果仍远未达到理想[14-15]，因此，迫切需要更加有效的治疗方法来改善脊髓损伤患者的预后。
哺乳动物的脊髓组织拥有很强的神经可塑性，在损伤后通过康复训练能够有效恢复瘫痪肢体的运动功能[16]。然而脊髓的自我修复能力有限，实验动物脊髓损伤后无法完全恢复自主运动和肢体平衡能力，如何加速脊髓的修复是治疗脊髓损伤的重点。过去的研究已经证明，直流电刺激疗法可以改善大鼠脊髓损伤模型的功能恢复，研究发现当刺激器的阴极和阳极放置在损伤部位时，受阴极刺激的神经轴突出现明显的再生，而暴露在阳极下的轴突最终萎缩[17]。为了避免电场阳极对轴突生长的抑制作用，开发了一种改进的刺激技术，即振荡电场刺激，该装置能够每隔15 min自动改变一次电场极性，从而实现在两个方向上促进轴突生长[18]。使用振荡电场刺激疗法对完全性截瘫和四肢瘫痪患者产生了有益的治疗效果，然而也有人对其有效性提出质疑，因为振荡电场引起的神经功能恢复的确切程度尚待评估[19-20]。
文章介绍了振荡电场刺激对大鼠实验性脊髓损伤的治疗作用。在术后整个恢复过程中，植入振荡电场装置的大鼠没有发生严重感染或不良反应；用BBB评分来评估振荡电场装置植入后大鼠运动功能的恢复情况，结果显示实验组的后肢运动功能较脊髓损伤组有更大程度的改善，以上结果表明振荡电场刺激是一种安全、可靠、有效的治疗策略。
炎症反应被认为是加速脊髓损伤病理生理变化的重要因素，是脊髓损伤后继发性损伤级联反应的关键点，包括趋化因子的募集、炎性细胞的浸润以及损伤脊髓局部星形胶质细胞和小胶质细胞的激活，这些变化加重了脊髓损伤的远期影响，增加了修复受损神经的难度[21-22]。为了探究振荡电场治疗后，损伤脊髓局部细胞和组织的细微变化，采用苏木精-伊红染色观察各组术后14 d的脊髓组织，结果表明振荡电场的应用明显减轻了损伤部位的组织坏死，有益于脊髓保持其结构的完整性。此外，振荡电场刺激明显减少了损伤局部炎性细胞的浸润，有效改善了损伤部位的微环境。
反应性星形胶质细胞增生是脊髓损伤的病理标志之一，其特征是星形胶质细胞在脊髓损伤后数小时内发生形态、数量和功能的变化，并随着损伤时间的推移而演变[23]。星形胶质细胞增生持续发展，最终形成胶质瘢痕，严重阻碍轴突的再生和神经功能恢复[24-25]。神经胶质纤维酸性蛋白是一种Ⅲ型中间丝状蛋白，是星形胶质细胞活化的标志物[26]。此次研究检测了星形胶质细胞标记物神经胶质纤维酸性蛋白在术后各时间点的表达，结果显示随着损伤后的时间推移，各组的神经胶质纤维酸性蛋白表达量均逐渐增高，其中假手术组的增长无统计学意义，系手术操作中刺激了脊髓组织引起；实验组表现出较低的增长趋势，且在术后各时间点，实验组的神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数均明显少于脊髓损伤组。这一结果表明振荡电场刺激可有效抑制脊髓损伤后星形胶质细胞的增生，为轴突的再生创造有益条件。
脊髓损伤后，小胶质细胞被激活，表现吞噬功能和释放炎症因子，从而加剧继发性损伤[24，27-28]。IBA-1是一种钙结合蛋白，在小胶质细胞中表达，并在其活化过程中表达升高[29]。为了探究振荡电场对脊髓损伤后小胶质细胞激活的影响，在术后各时间点用免疫荧光检测小胶质细胞标记物IBA-1的表达，结果显示，随着损伤后的时间推移，假手术组有轻微的IBA-1表达上调，无统计学意义；实验组与脊髓损伤组在术后均有明显的IBA-1表达上调，而实验组的IBA-1阳性细胞数量在术后各时间点均明显少于脊髓损伤组，表明振荡电场刺激能够明显减少脊髓损伤后小胶质细胞的激活，抑制炎症反应。
结论和展望：研究充分证明了振荡电场刺激可以有效抑制大鼠脊髓损伤后的继发性炎症反应，包括减轻炎性细胞向损伤部位浸润、抑制损伤部位星形胶质细胞和小胶质细胞的活化及增生，改善了脊髓损伤后的局部微环境，从而促进神经功能恢复。振荡电场作为一种新兴的治疗技术，想要让其真正应用于临床，还需要大量的实验提供理论基础。振荡电场刺激是通过什么作用途径减轻脊髓损伤局部的炎症反应？有哪些细胞通路和因子参与了这个过程？这些问题的答案还有待继续探索。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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[1]	闵友江, 姚海华, 孙洁, 周璇, 余航, 孙前谱, 洪恩四. 磁共振评价“三通针法”对脊髓损伤患者脑功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-8.
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