姜黄素通过Wnt信号通路调节人牙髓干细胞的成牙本质分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1784

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (25): 4018-4024.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1784

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姜黄素通过Wnt信号通路调节人牙髓干细胞的成牙本质分化

陈冬梅¹，徐丽丽²，周建伟¹

西南医科大学附属医院，¹中医科，²康复医学科，四川省泸州市 646000

修回日期:2019-04-15 出版日期:2019-09-08 发布日期:2019-09-08
通讯作者: 周建伟，博士生导师，主任中医师，西南医科大学附属医院中医科，四川省泸州市 646000
作者简介:陈冬梅，女，1985年生，四川省眉山市人，汉族，2008年成都中医药大学毕业，主治中医师，主要从事针灸康复研究。
基金资助:
四川省科学技术厅项目(2014SZ0235)，项目负责人：徐丽丽

Curcumin regulates odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells through Wnt signaling pathway

Chen Dongmei¹, Xu Lili², Zhou Jianwei¹

¹Department of Traditional Chinese Medicine, ²Department of Rehabilitation, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Revised:2019-04-15 Online:2019-09-08 Published:2019-09-08
Contact: Zhou Jianwei, Doctoral supervisor, Chief physician, Department of Rehabilitation, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Chen Dongmei, Attending physician, Department of Traditional Chinese Medicine, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Project of Sichuan Provincial Science and Technology Department, No. 2014SZ0235 (to XLL)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
牙髓干细胞与组织工程：牙髓干细胞是从牙髓组织中获得的具有高度增殖活性、自我更新能力和超强可塑性的成体干细胞。目前，牙髓干细胞在组织工程应用中的研究主要集中在牙周组织再生、神经元分化、成骨骼肌分化和血管内皮细胞再生方面，特别是成骨/成牙本质化方向，为牙周组织损伤的功能化修复带来希望。
姜黄素：是一种从天然植物姜黄的根茎中提取的酚类色素，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种生物活性作用。近来的研究发现，姜黄素在干细胞增殖、凋亡、成骨分化和旁分泌等方面发挥调节作用。临床研究证实，姜黄素在牙周炎的治疗方面取得了令人满意的临床效果，但其在牙周组织修复中的作用及机制尚不明确。

摘要
背景：研究证实，姜黄素不仅可促进成体干细胞成骨分化还可通过激活Wnt信号通路促进神经干细胞的增殖与分化。但姜黄素能否通过激活Wnt信号通路促进人牙髓干细胞成牙本质分化尚未见报道。
目的：探讨姜黄素对人牙髓干细胞增殖和成牙本质分化的影响及其可能机制。
方法：将人牙髓干细胞(购于上海妍生实业有限公司)分为6组：正常对照组不进行干预，低、中、高浓度姜黄素组用50，250，500 nmol/L姜黄素干预，IWR-1组用1 μmol/L Wnt信号通路抑制剂IWR-1干预，IWR-1+姜黄素组用1 μmol/L IWR-1和500 nmol/L姜黄素干预。各组进行矿化诱导7 d和14 d后，实时定量PCR检测Wnt5a、碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白的mRNA表达；Western blot检测Wnt5a、β-catenin、骨唾液酸蛋白、牙本质涎磷蛋白、骨钙蛋白、牙本质基质蛋白1水平；比色法检测细胞碱性磷酸酶活性；CCK-8法检测细胞增殖活性。
结果与结论：①姜黄素能够提高牙髓干细胞增殖活性和碱性磷酸酶活性，且呈时间和剂量依赖性；②姜黄素能够提高牙髓干细胞中牙本质涎磷蛋白、碱性磷酸酶的mRNA表达以及牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1、骨唾液酸蛋白和骨钙蛋白水平，且呈时间和剂量依赖性；③姜黄素能够提高牙髓干细胞中Wnt5a和β-catenin蛋白的表达，且呈时间和剂量依赖性；④IWR-1+姜黄素组人牙髓干细胞中Wnt5a mRNA表达以及Wnt5a、牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1、骨唾液酸蛋白及骨钙蛋白水平和增殖活性高于正常对照组和IWR-1组(P < 0.05)；⑤以上结果表明，姜黄素通过激活Wnt信号通路促进人牙髓干细胞的增殖和成牙本质分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8680-2343(陈冬梅)

关键词: 牙髓干细胞, 姜黄素, Wnt信号通路, 成牙本质分化, 成骨分化, 牙齿再生, 细胞增殖

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that curcumin not only promotes osteogenic differentiation of adult stem cells, but also promotes proliferation and differentiation of neural stem cells by activating the Wnt signaling pathway. However, there is no report on whether curcumin can promote odontoblast the differentiation of human dental pulp stem cells by activating the Wnt signaling pathway.
OBJECTIVE: To investigate the effect of curcumin on the proliferation and odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells and its possible mechanism.
METHODS: Human dental pulp stem cells (purchased from Shanghai Yansheng Industrial Co., Ltd., China) were divided into six groups according to different intervention methods. The normal control group was not intervened. Low-, medium- and high-concentration curcumin groups were treated with 50, 250, and 500 nmol/L curcumin, respectively. IWR-1 group was intervened with 1 μmol/L Wnt signaling pathway inhibitor IWR-1. IWR-1+curcumin group were treated with 1 μmol/L IWR-1 and 500 nmol/L curcumin. After 7 and 14 days of mineralization, the mRNA levels of Wnt5a, alkaline phosphatase and dentin sialophosphoprotein were detected by real-time quantitative PCR. The protein levels of Wnt5a, β-catenin, bone sialic acid protein, dentin sialophosphoprotein, osteocalcin and dentin matrix protein 1 were detected by western blot. The activity of alkaline phosphatase was detected by colorimetry, and the proliferation activity of the cells was detected by cell counting kit-8 method.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Curcumin had a time-dependent and dose-dependent effect on the proliferation of dental pulp stem cells. (2) Curcumin had a time- and dose-dependent effect on the mRNA expressions of dentin sialophosphoprotein and alkaline phosphatase, as well as the protein expressions of dentin sialophosphoprotein, dentin matrix protein 1, bone sialoprotein and osteocalcin in dental pulp stem cells. (3) Curcumin up-regulated the expressions of Wnt5a and β-catenin proteins in dental pulp stem cells in a time- and dose-dependent manner. (4) Compared with the control and IWR-1 groups, the combination of curcumin and IWR-1 significantly increased the expressions of Wnt5a mRNA and protein, dentin sialophosphoprotein, dentin matrix protein 1, and bone sialoprotein and osteocalcin proteins in human dental pulp stem cells, and significantly promoted the proliferative ability of the cells (P < 0.05). These results suggest that curcumin promotes the proliferation and odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells by activating the Wnt signaling pathway.

Key words: dental pulp stem cells, curcumin, Wnt signaling pathway, odontogenic differentiation, osteogenic differentiation, dental regeneration, cell proliferation

中图分类号:

陈冬梅，徐丽丽，周建伟 . 姜黄素通过Wnt信号通路调节人牙髓干细胞的成牙本质分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(25): 4018-4024.

Chen Dongmei, Xu Lili, Zhou Jianwei.

Curcumin regulates odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells through Wnt signaling pathway

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(25): 4018-4024.

图/表（结果） 4

2.1 姜黄素对人牙髓干细胞增殖活力的影响 与正常对照组比较，诱导分化7 d后，中、高浓度姜黄素组细胞的增殖活性升高，诱导分化14 d后，低、中、高浓度姜黄素组细胞的增殖活性均升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与低浓度姜黄素组比较，诱导分化7 d和14 d后，中、高浓度姜黄素组细胞的增殖活性升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与中浓度姜黄素组比较，诱导分化7 d和14 d后，高浓度姜黄素组细胞的增殖活性升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与诱导分化7 d比较，诱导分化14 d低、中、高浓度姜黄素组细胞的增殖活性升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2，提示姜黄素可提高人牙髓干细胞增殖活性，且作用呈时间和剂量依赖性。

2.2 姜黄素对人牙髓干细胞碱性磷酸酶活性的影响 诱导分化7 d和14 d后，高浓度姜黄素组细胞的碱性磷酸酶活性高于其他3组，差异有显著性意义(P < 0.05)；与诱导分化7 d比较，诱导分化14 d各组细胞碱性磷酸酶活性增高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3，提示姜黄素可提高人牙髓干细胞碱性磷酸酶活性。

2.3 姜黄素对人牙髓干细胞成牙本质分化能力的影响 RT-qPCR检测结果显示，诱导分化7 d后，高浓度姜黄素组细胞的牙本质涎磷蛋白、碱性磷酸酶mRNA表达高于其他3组，诱导分化14 d后，中、高浓度姜黄素组细胞的牙本质涎磷蛋白、碱性磷酸酶mRNA表达高于其他2组，差异有显著性意义(P < 0.05)；与诱导分化7 d比较，中、高浓度姜黄素组诱导分化14 d后牙本质涎磷蛋白、碱性磷酸酶mRNA表达升高，差异有显著性意义(P < 0.05)。

Western blot 检测结果也显示，诱导分化7 d后，高浓度姜黄素组细胞的牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1、骨唾液酸蛋白和骨钙蛋白表达高于其他3组，诱导分化14 d后，中、高浓度姜黄素组细胞的牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1、骨唾液酸蛋白和骨钙蛋白表达高于其他2组，差异有显著性意义(P < 0.05)；与诱导分化7 d比较，中、高浓度姜黄素组细胞诱导分化14 d后牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1、骨唾液酸蛋白和骨钙蛋白表达升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。以上结果提示姜黄素对人牙髓干细胞的成牙本质分化发挥促进作用。

2.4 姜黄素对人牙髓干细胞Wnt信号通路相关蛋白表达的影响 Western blot 检测结果显示，诱导分化7，14 d后，高浓度姜黄素组细胞中Wnt5a和β-catenin蛋白的表达高于其他3组，差异有显著性意义(P < 0.05)；与诱导分化7 d比较，高浓度姜黄素组诱导分化14 d后细胞中Wnt5a和β-catenin蛋白的表达升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。以上结果提示姜黄素可促进人牙髓干细胞Wnt信号通路相关蛋白的表达。

2.5 姜黄素对抑制Wnt信号通路的人牙髓干细胞增殖和成牙本质分化的影响 为了进一步明确Wnt信号通路在姜黄素促进人牙髓干细胞增殖和成牙本质分化中的作用，应用Wnt信号通路抑制剂处理人牙髓干细胞，RT-qPCR和Western blot检测结果显示，与正常对照组比较，IWR-1组人牙髓干细胞中Wnt5a mRNA和Wnt5a、β-catenin、牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1、骨唾液酸蛋白及骨钙蛋白的表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；IWR-1+姜黄素组人牙髓干细胞中Wnt5a mRNA和Wnt5a、牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1、骨唾液酸蛋白及骨钙蛋白的表达高于IWR-1组和正常对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。CCK-8检测结果显示，与正常对照组比较，IWR-1组人牙髓干细胞增殖活性降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；与IWR-1组比较，IWR-1+姜黄素组人牙髓干细胞增殖活性增高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。以上结果提示姜黄素通过激活Wnt信号通路促进人牙髓干细胞的增殖与成牙本质分化。

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引言

由感染、创伤和理化刺激引起的牙髓炎或根尖周炎是导致患牙丧失的主要原因之一^[1]。目前，临床上仍以根管治疗为主，主要是控制感染和促进根尖周病愈合，均不能恢复牙髓牙本质复合体的活性与功能^[2]。随着再生性牙髓治疗的深入研究，牙髓血运重建实现了患牙的根尖周组织愈合、牙根继续发育以及根管壁增厚，但仍无法从组织学意义上实现真正的牙髓牙本质复合体再生^[3]。鉴于此，基于组织工程的牙源性干细胞实现牙髓再生成为研究热点。

牙源性干细胞主要有牙髓干细胞、牙周膜干细胞和根尖牙乳头干细胞等^[4]。牙髓干细胞是存在于牙髓组织中的一种成体干细胞，具有与间充质干细胞相似的生物学特性，被认为是牙周组织再生的理想种子细胞^[5-6]。在健康牙髓组织和感染牙髓组织中均能提取出增殖活性较高的牙髓干细胞^[7]。体外实验研究证实，牙髓干细胞可被定向诱导分化为成牙本质细胞同时具有成骨分化能力。体内实验研究也表明，种植于支架上的牙髓干细胞可形成牙髓牙本质复合体^[8]。实验研究已明确Wnt信号转导通路对牙髓干细胞的成牙本质分化发挥调节作用^[9]。

Wnt信号通路是保持组织内细胞同源性、促进组织损伤修复与再生的重要通路之一^[10]。研究表明，Wnt信号通路不仅调控牙齿的生长发育，参与牙冠、牙根及牙周膜的形成，还调节牙髓干细胞的增殖与分化^[11]。因此，寻找激活Wnt信号通路的药物将使牙髓干细胞在组织再生工程中有较好的应用前景。

姜黄素是一种从天然植物姜黄的根茎中提取的酚类色素，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等多种生物活性作用^[12]。近来的研究发现，姜黄素在干细胞增殖、凋亡、成骨分化和旁分泌等方面发挥调节作用^[13]。体外细胞实验已证实，姜黄素可通过激活Wnt信号通路促进神经干细胞的增殖与分化^[14]，促进骨髓间充质干细胞的成骨分化^[15]。Chauhan等^[16]将姜黄素附着于可生物降解交联明胶薄膜上用于治疗牙周炎，效果良好。姜黄素还可保护牙周炎大鼠牙周支持组织的炎症性破坏^[17]，但其对牙髓干细胞Wnt信号通路表达的影响尚不明确。因此，该研究用不同浓度姜黄素处理人牙髓干细胞，观察姜黄素对牙髓干细胞成牙本质分化和Wnt信号通路的影响，以期为牙髓干细胞的再生应用寻找辅助治疗药物。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞干预实验。

1.2 时间及地点 2018年2至9月在西南医科大学实验室完成。

1.3 材料 人牙髓干细胞购于上海研生实业有限公司。722型数显可见分光光度计(上海光学仪器五厂有限公司)；低温离心机(Thermo公司)；凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；姜黄素(Sigma公司)；Wnt信号通路抑制剂IWR-1(Selleck公司)；CCK-8细胞活性检测试剂盒(Dojindo公司)；碱性磷酸酶检测试剂盒、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、牛血清白蛋白(北京索莱宝科技公司)；Trizol试剂(Invitrogen公司)；Titanium一步法RT-PCR 试剂盒和SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ试剂盒(北京宝日医生物公司)；全细胞蛋白提取试剂盒(Amresco公司)；兔抗人Wnt5a、骨唾液酸蛋白、牙本质涎磷蛋白、骨钙蛋白、牙本质基质蛋白1、β-catenin、Wnt5a单克隆抗体和兔抗人β-actin多克隆抗体(PeproTech公司)；增强型ECL化学发光试剂盒(Gene公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞分组与处理方法 将第3代人牙髓干细胞分为6组：①正常对照组：无药物处理的人牙髓干细胞；②低浓度姜黄素组：用50 nmol/L姜黄素处理人牙髓干细胞7 d和14 d；③中浓度姜黄素组：用250 nmol/L姜黄素处理人牙髓干细胞7 d和14 d；④高浓度姜黄素组：用500 nmol/L姜黄素干预细胞7 d和14 d；⑤IWR-1组：用0.1 μmol/L Wnt信号通路抑制剂IWR-1干预细胞14 d；⑥IWR-1+姜黄素组：用1 μmol/L Wnt信号通路抑制剂IWR-1和500 nmol/L姜黄素共同干预细胞14 d。

1.4.2 人牙髓干细胞成牙分化诱导 根据文献[18]报道的方法进行改良，将第3代人牙髓干细胞以5×10⁷ L^-1细胞浓度接种于培养皿，按实验分组向成牙本质诱导培养基(每100 mL DMEM培养基中加入体积分数为10%胎牛血清、0.1 U/L青霉素、100 mg/L链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10 nmol/L地塞米松和50 mg/L抗坏血酸)中加入干预药物，每隔2 d换液，于培养7 d和14 d后进行下列检测。

1.4.3 CCK-8方法检测人牙髓干细胞增殖活性 根据文献[18]报道，取成牙本质诱导分化的各组人牙髓干细胞，应用CCK-8细胞活性检测试剂盒检测各组细胞的增殖活力。步骤如下：收集各组细胞，制成浓度为1×10⁷ L^-1的细胞悬液，加入96孔培养板，每孔100 μL，常规培养5 h，向各孔中加入10 μL CCK-8工作溶液，轻轻混匀，37 ℃孵育30 min，每组设3个复孔，酶标仪检测450 nm波长处各孔吸光度值，吸光度值越大说明活细胞数量越多。

1.4.4 人牙髓干细胞碱性磷酸酶活性检测 根据文献[18]报道，取成牙本质诱导分化的各组人牙髓干细胞，应用碱性磷酸酶检测试剂盒采用磷酸苯二钠比色法检测各组细胞的吸光度，分析碱性磷酸酶活性。步骤如下：收集各组细胞，PBS漂洗后用全细胞裂解液冰上裂解10 min，1 000 r/min 4 ℃离心5 min，吸取上清液，严格按照说明书操作，向上清液中依次加入缓冲液、显色液，722型数显可见分光光度计检测510 nm波长处的吸光度值。以试剂盒中标准曲线工作液的吸光度值和相对应的蛋白浓度值绘制线性标准曲线，根据待测样品吸光度值计算出该样品的浓度，用样品测定值与标准蛋白测定值的比值表示碱性磷酸酶活性。

1.4.5 RT-qPCR方法检测人牙髓干细胞中Wnt5a、碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白mRNA的表达 根据文献[19]报道，取成牙本质诱导分化的各组人牙髓干细胞，应用RT-qPCR方法检测成牙本质相关基因的表达。步骤如下：收集各组细胞，用Trizol试剂4 ℃裂解，提取细胞总RNA，凝胶电泳法检验所提取RNA的质量，用Titanium一步法RT-PCR试剂盒将随机引物反转录获得cDNA，10 μL反转录反应体系进行扩增反应；应用SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ试剂盒进行实时荧光定量PCR，20 μL荧光定量PCR反应体系的反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃预变性30 s，94 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共40个循环，GAPDH为内参对照，其相对表达值设为1，实验结果以目标基因表达与内参基因表达的相对倍数来表示。引物序列见表1。

1.4.6 Western blot方法检测人牙髓干细胞中成牙本质相关蛋白和Wnt信号通路相关蛋白的表达 根据文献[20]报道，取成牙本质诱导分化的各组人牙髓干细胞，应用Western blot方法检测成牙本质相关蛋白和Wnt信号通路相关蛋白的表达。步骤如下：收集各组细胞，应用全细胞蛋白提取试剂盒冰上裂解细胞，用低温离心机10 000 r/min离心5 min，小心吸取上清液，应用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测量蛋白浓度，超纯水将各组蛋白浓度调平；将各组细胞提取的蛋白放入100 ℃沸水中煮5 min使其变性，蛋白上样量均为40 μg，12%凝胶电泳，将电转后的PVDF膜用5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，分别加入兔抗人Wnt5a、骨唾液酸蛋白、牙本质涎磷蛋白、骨钙蛋白、牙本质基质蛋白1、β-catenin、Wnt5a单克隆抗体和兔抗人β-actin多克隆抗体，4 ℃避光孵育12 h后漂洗，应用增强型ECL化学发光试剂盒将膜在凝胶成像系统中显影，Quantity One软件半定量分析显影条带，以目的条带与β-actin条带的积分吸光度比值进行统计学分析。

1.5 主要观察指标 ①各组人牙髓干细胞的增殖活性；②各组人牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性；③各组人牙髓干细胞中Wnt5a、碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白mRNA的表达；④各组人牙髓干细胞中Wnt5a、β-catenin、骨唾液酸蛋白、牙本质涎磷蛋白、骨钙蛋白和牙本质基质蛋白1的表达。

1.6 统计学分析所有样品重复测量3次，计量资料采用 x(_)±s表示，应用SPSS 19.0软件进行实验数据分析，组间比较用单因素方差分析，两两比较用多重比较检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

牙髓干细胞在组织工程领域受到研究人员的广泛关注。临床研究人员从阻生齿、正畸牙以及多生牙的牙髓组织中提取牙髓干细胞，体外培养传代后仍维持良好的间充质干细胞特性^[2¹^]。体内研究也发现，牙髓干细胞可迁移到轻、中度损伤的牙齿部位，并分化为成牙本质细胞，参与反应性牙本质的形成与修复^[2²^]。由于牙髓干细胞的增殖能力与机体生长阶段有关，为了获得足够数量的种子细胞，更多研究致力于促进牙髓干细胞的增殖。多项研究表明，姜黄素可通过激活Notch、PI3K/AKT信号通路或抑制糖皮质激素受体促进神经干细胞的增殖^[2³^-2⁵^]，通过激活血红素加氧酶1信号通路促进脂肪干细胞的增殖^[2⁶^]，还能促进骨髓间充质干细胞增殖^[2⁷^]。还有研究证实，姜黄素与神经干细胞的Wnt信号通路密切相关^[2⁸^]，并通过激活Wnt信号通路减少脊髓损伤时神经细胞的丢失^[²⁹^]。该研究应用不同浓度的姜黄素处理在成牙向诱导分化过程中的人牙髓干细胞，观察姜黄素对分化过程中人牙髓干细胞增殖活性的影响，CCK-8检测结果显示，随着姜黄素浓度增高和作用时间的延长，人牙髓干细胞的增殖活性升高，呈剂量和时间依赖性，提示姜黄素具有促进人牙髓干细胞增殖的作用。

Wnt信号通路作为生物进化过程中的一条极为保守的通路，广泛存在于真核生物的生命活动中^[3⁰^]。根据信号通路是否依赖β-catenin蛋白发挥作用而分为经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路^[3¹^]。经典Wnt信号通路调控干细胞增殖与分化时，启动于β-catenin蛋白被激活，由胞质内转移到细胞核内与转录因子结合，调节下游靶基因的表达，从而发挥作用^[3²^]。Wnt5a介导的非经典Wnt信号通路，不仅能够调控细胞的增殖、迁移和极化^[3³^]，还能调节间充质干细胞、胚胎干细胞的自我更新和分化^[3⁴^-3⁵^]，而且Wnt5a在一定条件下对经典Wnt信号通路起协同作用，调节干细胞的增殖与分化^[3⁶^]。Wnt5a在调节牙齿发育、牙源性干细胞增殖分化以及维持牙周组织稳态方面发挥重要作用。Wnt5a基因敲除小鼠的牙发育不良，形成小而形态异常的牙齿。此研究应用Wnt信号通路抑制剂下调Wnt5a和β-catenin，观察姜黄素对人牙髓干细胞增殖的影响。RT-qPCR结果显示，Wnt信号通路抑制剂IWR-1作用于人牙髓干细胞后，Wnt5a mRNA的表达下调，应用姜黄素进行干预后，Wnt5a mRNA表达上调。Western blot结果也显示，IWR-1下调了Wnt5a和β-catenin蛋白的表达，姜黄素则上调了Wnt5和β-catenin蛋白的表达，提示姜黄素可能激活经典与非经典Wnt信号通路促进人牙髓干细胞的增殖。

研究表明，Wnt5a在牙乳头细胞向成牙本质细胞分化过程中发挥重要作用，Wnt5a下调可导致牙本质发育缺陷^[3⁷^]。此研究观察了抑制Wnt信号通路对人牙髓干细胞成牙向分化能力的影响以及姜黄素的调节作用。RT-qPCR结果显示，姜黄素可促进成牙向诱导分化过程中正常人牙髓干细胞中牙本质涎磷蛋白、碱性磷酸酶mRNA表达，抑制Wnt信号通路后，人牙髓干细胞中牙本质涎磷蛋白、碱性磷酸酶mRNA表达降低，姜黄素可逆转Wnt信号通路抑制剂的作用。牙本质涎磷蛋白基因是干细胞成牙本质分化的标志基因，碱性磷酸酶基因则是成骨化的标志基因。此研究中关于姜黄素可通过激活Wnt信号通路促进人牙髓干细胞的成骨分化的结果与包幸福等^[³⁸^]报道的Wnt5a促进小鼠成牙骨质分化的结果一致。同时，此研究还发现，姜黄素可通过激活Wnt信号通路上调人牙髓干细胞中成牙本质分化相关基因的表达。Western blot结果显示，Wnt信号通路抑制剂可下调牙本质涎磷蛋白和牙本质基质蛋白1的表达，姜黄素可逆转Wnt信号通路抑制剂的下调作用，提示姜黄素可通过激活Wnt5a和β-catenin蛋白促进人牙髓干细胞的成牙本质分化，可能原因是提高β-catenin蛋白的表达促进与下游蛋白的结合。此外，碱性磷酸酶活性检测和成骨分化相关蛋白检测结果显示姜黄素也可通过激活Wnt信号通路促进人牙髓干细胞的成骨分化，提示姜黄素对人牙髓干细胞成骨分化与成牙本质分化具有相同的促进作用，不存在逆向作用。

综上所述，此研究发现经典Wnt信号通路和非经典Wnt信号通路均参与姜黄素对人牙髓干细胞增殖和成牙本质分化的调控。由于此研究只应用Wnt信号通路抑制剂对相关机制进行初步探讨，今后将应用RNA干扰技术对Wnt信号通路上下游分子进行精确沉默，深入研究姜黄素的作用机制，为其临床应用提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

姜黄素通过Wnt信号通路调节人牙髓干细胞的成牙本质分化

Curcumin regulates odontogenic differentiation of human dental pulp stem cells through Wnt signaling pathway

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