纳米组织工程化脊髓修复脊髓损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3069

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (10): 1550-1554.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3069

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纳米组织工程化脊髓修复脊髓损伤

周继辉1，姚猛2，王岩松3，李新志1，周游1，黄卫1，陈文瑶1

1三峡大学附属仁和医院骨科，湖北省宜昌市 443001；2哈尔滨医科大学附属第二医院脊柱外科，黑龙江省哈尔滨市 150086；3哈尔滨医科大学附属第一医院脊柱外科，黑龙江省哈尔滨市 150007

收稿日期:2020-02-17 修回日期:2020-02-26 接受日期:2020-03-24 出版日期:2021-04-08 发布日期:2020-12-18
通讯作者: 姚猛，教授，哈尔滨医科大学附属第二医院脊柱外科，黑龙江省哈尔滨市 150086 王岩松，教授，哈尔滨医科大学附属第一医院脊柱外科，黑龙江省哈尔滨市 150007
作者简介:周继辉，男，1974 年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，2012 年哈尔滨医科大学毕业，博士，主任医师，主要从事脊髓组织工程研究。

Spinal cord injury repaired by using nano tissue-engineered spinal cord

Zhou Jihui1, Yao Meng2, Wang Yansong3, Li Xinzhi1, Zhou You1, Huang Wei1, Chen Wenyao1

1Department of Orthopedics, Affiliated Renhe Hospital of China Three Gorges University, Yichang 443001, Hubei Province, China; 2Department of Spinal Surgery, Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China; 3Department of Spinal Surgery, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150007, Heilongjiang Province, China

Received:2020-02-17 Revised:2020-02-26 Accepted:2020-03-24 Online:2021-04-08 Published:2020-12-18
Contact: Yao Meng, Professor, Department of Spinal Surgery, Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, Heilongjiang Province, China Wang Yansong, Professor, Department of Spinal Surgery, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150007, Heilongjiang Province, China
About author:Zhou Jihui, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Renhe Hospital of China Three Gorges University, Yichang 443001, Hubei Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
纳米组织工程化脊髓：支架以胶原为原料，应用电子纺丝技术制备纤维平行排列及交错排列的纳米纤维膜，种子细胞为SD大鼠脊髓源性神经干细胞，神经干细胞已被证实为优质种子细胞，通过共培养7 d使神经干细胞贴附于纳米纤维膜表面，二者共同构建组织工程化脊髓。
脊髓损伤模型：实验采用了脊髓半切损伤模型，显露脊髓中央动脉作为中线标志，以预先定位的T8棘突位置为中心，沿中线右侧切除一矩形长3-5 mm的半横断脊髓缺损区域，胸髓损伤不会危及生命中枢，损伤结果确切，动物出现后肢功能障碍及尿便障碍，修复术后通过行为学/组织学及免疫组化结果进行综合分析，得出结论。

背景：应用组织工程修复脊髓损伤是近年来的研究热点，多数研究仍停留在体外实验阶段。
目的：将新型胶原纳米纤维膜与神经干细胞复合构建组织工程化脊髓，探寻其修复脊髓损伤的效果。
方法：以胶原为原料，应用电子纺丝技术制备纤维平行排列及交错排列的纳米纤维膜；将新生大鼠脊髓源性神经干细胞分别接种于两种纳米纤维上培养7 d，构建组织工程化脊髓。建立SD大鼠脊髓半横断动物模型，随机分5组干预：空白对照组未植入任何材料；平行组织工程组与交错组织工程组植入对应的组织工程化脊髓，交错组与平行组植入对应排列的纳米纤维膜。术后1-8周进行改良行为学BBB评分；术后8周取术区脊髓组织，进行苏木精-伊红染色与免疫组化染色。实验获得哈尔滨医科大学实验动物福利和伦理管理委员会批准。
结果与结论：①平行组织工程组术后各时间点的改良行为学BBB评分均高于其余4组(P < 0.05)，交错组织工程组、平行组、交错组各时间点的评分高于空白对照组(P < 0.05)，交错组织工程组术后2-8周的评分高于平行组、交错组(P < 0.05)，平行组术后1，2周的评分高于交错组(P < 0.05)；②苏木精-伊红染色显示，空白对照的损伤区域几乎无细胞结构，可见大量瘢痕组织形成；平行组、交错组抑制了瘢痕组织形成，组织修复不明显，邻近组织瘢痕形成，损伤区与周围未建立细胞联系；两组织工程组支架降解区域内有大量细胞成分，局部有较多组织再生，细胞数量较多，细胞沿支架方向分布，彼此相关并与正常组织相连；③免疫组化染色显示，两组织工程组可见神经元细胞；④结果表明，纳米组织工程化脊髓修复脊髓损伤的效果良好，以平行纳米纤维膜构建的组织工程化脊髓修复效果更佳。

https//orcid.org/0000-0002-2646-5343 (周继辉)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 脊髓, 材料, 纳米纤维, 脊髓损伤, 组织工程, 纳米支架, 实验, 鼠

Abstract: BACKGROUND: The application of tissue engineering in the repair of spinal cord injury is a focus of research in recent years, and most of the studies are still in vitro stage.
OBJECTIVE: To explore the effect of repairing spinal cord injury with tissue-engineered spinal cord that was composed of new collagen nanofiber membrane and neural stem cells.
METHODS: Collagen was used as raw material, and the nanofiber membrane with parallel arrangement and staggered arrangement of fibers was prepared by electronic spinning technology. The spinal cord derived neural stem cells of neonate rats were cultured on two kinds of nanofibers for 7 days to construct the tissue-engineered spinal cord. Sprague-Dawley rat models of spinal cord hemisection were randomly divided into five groups. In the blank control group, any material was not used. In the parallel tissue engineering group and cross tissue engineering group, corresponding tissue-engineered spinal cord was used. In the parallel group and cross group, corresponding nanofiber membrane was used. At 1-8 weeks after the operation, modified BBB scores of the rats were recorded. At 8 weeks after operation, the spinal cord was taken and stained with hematoxylin and eosin and received immunohistochemistry. The experiments were approved by experimental animal welfare and Ethics Management Committee of Harbin Medical University.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The BBB scores in the parallel tissue engineering group were higher than those in the other four groups (P < 0.05). The BBB scores in the staggered tissue engineering group, the parallel group and the staggered group were all higher than those in the blank control group (P < 0.05). The BBB scores in the staggered tissue engineering group were higher than those in the parallel group and the staggered group at 2-8 weeks after operation (P < 0.05). The BBB scores in the parallel group were higher than those in the staggered group at 1 and 2 weeks after operation (P < 0.05). (2) Hematoxylin-eosin staining showed that there was almost no cell structure in the injury area of the blank control, and a large number of scar tissue formation was seen. The formation of scar tissue was inhibited in the parallel group and the staggered group, and the tissue repair was not obvious; the scar formation in the adjacent tissue and no cell connection was established between the injury area and the surrounding area. There were a large number of cell components in the scaffold degradation area of the two tissue engineering groups, and there were obvious tissue regeneration, more cells distributed along the direction of the scaffold; connections were built among the cells and with normal tissues. (3) Immunohistochemistry staining showed that neurons were seen in the two tissue engineering groups. (4) The results showed that the effect of nano tissue engineering on the repair of spinal cord injury was good, and the effect of parallel nano fiber membrane was better.

Key words: spinal cord, material, nanofiber, spinal cord injury, tissue engineering, nano scaffold, experiment, rat

中图分类号:

周继辉, 姚猛, 王岩松, 李新志, 周游, 黄卫, 陈文瑶. 纳米组织工程化脊髓修复脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1550-1554.

Zhou Jihui, Yao Meng, Wang Yansong, Li Xinzhi, Zhou You, Huang Wei, Chen Wenyao. Spinal cord injury repaired by using nano tissue-engineered spinal cord[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(10): 1550-1554.

图/表（结果） 4

2.1 纳米纤维膜的表征以扫描电镜观察并应用专用图像计算系统(哈尔滨林业大学提供)进行测量，平行排列纳米纤维膜的纤维直径为(694±157)nm，纤维排列方向大致平行；交错排列纳米纤维膜纤维的直径为(785±177)nm，纤维排列方向纵横交错[5]。
2.2 神经干细胞的培养和鉴定脊髓源性神经干细胞初次接种后以单个存在为主，在显微镜下呈圆形(图2A)，培养一两天仍以单个细胞为主，镜下可见因细胞聚集形成不规则的细胞团，经吹打即可散开。3 d后，经细胞分裂增殖形成神经球，多呈椭圆形悬浮于培养液中，不易吹散，边界清晰，5-7 d神经球经增殖明显，细胞数可达数百个，中心细胞因营养供应不良出现坏死表现(图2B)，进行机械传代后细胞以单个及较小神经球存在，传代后细胞的增殖速度无明显变化。

经传代培养的脊髓源性神经干细胞标记后在荧光显微镜下即可见明亮的绿色荧光，又可见明亮的橙红荧光，两种荧光可合成于同一细胞。说明神经干细胞表达神经干细胞的特有标志物巢蛋白，同时表达BrdU。
2.3 脊髓半横断及术后动物情况实验中脊髓切除范围采用宁多毋少的原则，中线右侧切除一矩形长3-5 mm的半横断脊髓缺损区域，切除时可略过中线，尽量切除彻底，避免神经残留。术后动物双侧后肢及尾部的活动能力完全丧失，脊髓休克期后左后肢活动能力逐渐恢复，约2周恢复自主排尿，20%-30%的动物因营养不良、自残等原因死亡，其余动物可长期存活，为进一步实验奠定了基础。
2.4 改良BBB评分检测结果自术后第1周开始，各组间改良BBB评分存在明显差异(P < 0.05)，由优至劣的顺序为平行组织工程组、交错组织工程组、平行组、交错组、空白对照组。平行组织工程组术后各时间点的改良BBB评分高于其余4组(P < 0.05)，交错组织工程组、平行组、交错组术后各时间点的评分高于空白对照组(P < 0.05)；术后第1周，交错组织工程组评分高于交错组(P < 0.05)，自第2周开始评分高于平行组、交错组(P < 0.05)；平行组术后第1，2周的评分高于交错组(P < 0.05)，见表1。组织工程化脊髓组功能恢复较早且恢复程度较好，各组至第8周起评分无改变，脊髓功能恢复出现停滞。

2.5 灌注及取材情况灌注过程中右心耳流出液体逐渐谈澄清透明，可见大鼠肢体抽搐，腹部隆起，身体变硬，取出的脊髓标本呈白色，包括损伤区及其远近端部分，脊髓可见半横断处脊髓变细，纳米纤维膜与再生脊膜完全融合。
2.6 苏木精-伊红染色结果术后8周取材行苏木精-伊红染色，空白对照组损伤区域几乎无细胞结构，可见大量瘢痕组织形成，并有较多空泡出现；单纯纳米纤维膜植入后，纳米支架抑制了瘢痕组织形成，组织修复不明显，局部形成较大腔隙，邻近组织瘢痕形成，细胞稀少，损伤区与周围未建立细胞联系；纳米组织工程化脊髓植入后，可见支架降解区域内有大量细胞成分，局部有较多组织再生，细胞数量较多，细胞沿支架方向分布，彼此相关并与正常组织相连，见图3，细胞成分有待进一步鉴定。

2.7 新生组织中细胞成分检测结果在DAB显色的免疫组化实验中，阳性细胞胞浆呈黄褐色，在两组织工程化组实验动物的新生组织中存在神经元细胞，而在空白对照组、平行组、交错组中未发现阳性细胞，见图4。

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学观察及随机分组动物实验。
1.2 时间及地点实验于2010年3月至2011年4月在哈尔滨医科大学附属第二医院实验中心完成。
1.3 材料
实验主要试剂：Ⅰ型胶原蛋白、胎牛血清、1，1，1，3，3，3-六氟代-2-丙醇、巢蛋白(Nestin1∶500)多克隆抗体、BrdU(1∶100)多克隆抗体、山羊抗兔IgG二抗(TRITC标记)及山羊抗鼠IgG二抗(FITC标记)、BrdU(SigmaeAldrich USA)；0.01%木瓜蛋白酶、脱氧核糖核酸酶，DMEM/F12 (Invitrogen，CA)；0.13%胰蛋白酶、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(Chemicon，CA)；0.002%肝素(Stem cell Technology)。
实验动物：新生SD大鼠，平均体质量10.26 g，购自哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心。成年SD大鼠，体质量(236.89±18.65) g，购自哈尔滨医科大学附第二医院实验动物中心，清洁级。实验获得哈尔滨医科大学实验动物福利和伦理管理委员会批准。
1.4 实验方法
1.4.1 纳米纤维膜的制备原料为Ⅰ型胶原蛋白，溶剂为1，1，1，3，3，3-六氟代-2-丙醇，Ⅰ型胶原蛋白质量浓度为80 g/L，制备装置由接地电极、输液泵和高电压电源组成。溶液在7 000 V电压作用下，以0.5 mL/h的速率在输液泵中推注，通过平板收集器收集交错排列的纳米胶原纤维，通过鼓状收集器收集平行排列的纳米胶原纤维，收集过程中转速为3 000 r/min，收集后的纤维膜在室温并真空条件下自然干燥12 h。
1.4.2 神经干细胞的培养和鉴定将新生SD大鼠经乙醇浸泡消毒，取出脊髓并剥离脊膜，在完全培养液中剪碎，培养液含体积分数0.02%胎牛血清、10 µg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 µg/L表皮生长因子及0.002%的肝素，基质为DMEM/F12[3]。每两三天半量换液，每 5-7 d 进行机械分离传代。以鼠抗BrdU (1∶100)多克隆抗体及兔抗巢蛋白(Nestin 1∶500)多克隆抗体作为检测一抗，以山羊抗兔 IgG (TRITC标记)及山羊抗鼠 IgG (FITC标记)为二抗，对神经干细胞进行双标免疫组化鉴定。
1.4.3 构建组织工程化脊髓将平行及交错排列的纳米纤维膜根据培养瓶大小裁剪成适当尺寸，进行紫外线消毒，浸泡于细胞培养液中使其充分溶胀，无菌条件下置于25 mL培养瓶的底面。吹打传代后的神经干细胞，尽量制成单细胞悬液，取1×108 L-1的神经干细胞悬液4.0-5.0 mL加于培养瓶中。每两三天半量更换培养液，7 d后取出纳米纤维膜进行后续实验。
1.4.4 实验分组干预与造模将125只成年SD大鼠随机分为 5组，即空白对照组、平行组、交错组、平行组织工程组、交错组织工程组，每组手术操作后至少存活 20只进行实验，术后8周处死动物。

大鼠脊髓半横断动物模型的制作：将大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，以肋骨为标志定位T8的棘突，术区备皮，以T8棘突为中心点，取4.0-5.0 cm的纵形皮肤切口，逐层充分暴露下胸段脊髓，以纤维器械小心地切开硬脊膜，显露脊髓中央动脉作为中线标志，以预先定位的T8棘突位置为中心，沿中线右侧切除一矩形长3-5 mm的半横断脊髓缺损区域(图1A)。空白对照组不做进一步处理；将纳米纤维膜以PBS充分溶胀并经紫外线照射消毒后剪成适当大小并卷成圆柱状，平行组将平行排列的纳米纤维膜植入脊髓半横断处(图1B)，交错组将交错排列的纳米纤维膜植入脊髓半横断处，平行组织工程组将平行排列纳米纤维膜构建的组织工程化脊髓植入脊髓半横断处，交错组织工程组将交错排列纳米纤维膜构建的组织工程化脊髓植入脊髓半横断处，冲洗，止血，逐层缝合。

1.5 主要观察指标
功能评估：术后第 1，2，4，6，8 周，以改良BBB 评分法评估所有动物的运动功能，于上午8点排空动物的膀胱，观察时间为上午10点，由3名检测者根据改良 BBB评分系统进行评测，每只动物观察5 min，以数码摄录机进行记录，将3个检测者平均值作为每只动物的分值。改良BBB评分根据大鼠双后肢及尾部的活动能力进行评测，分数与功能恢复水平呈正相关，分值范围0-21，0分为完全瘫，21分为正常功能[4]。
组织学形态学检查：沿原切口逐层暴露原术区，观察局部大体情况，包括移植物与脊髓组织的融合程度，有无感染、瘢痕形成范围等。心室灌注固定法脊髓取材，取固定后的脊髓标本，常规石蜡包埋，连续切片，切片厚度为8 μm，进行苏木精-伊红常规染色，其中苏木精染色3 min，0.5%伊红溶液染色5 min，中性树胶封固，显微镜下观察。
新生组织中细胞成分检测：取制备好的石蜡切片，常规进行脱蜡，灭活，抗原修复处理，检测一抗包括兔抗微管相关蛋白2(MAP2)单克隆抗体(1∶100)、兔抗人胶质原性纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体(1∶200)、兔抗环核苷酸-3’磷酸水解酶(CNPase)单克隆抗体(1∶100)，每张切片滴加一抗约100 µL，4 ℃孵育过夜，以PBS取代一抗重复实验作为阴性对照，每张切片滴加约50 µL生物素标记的鼠抗兔二抗(1∶100)，37 ℃作用2 h，在 1 mL蒸馏水中加入A、B、C试剂各一滴，混匀后于室温下行DAB显色，防荧光萃灭剂封固，光学显微镜下观察结果，选合适的视野拍照。
1.6 统计学分析以 SPSS 16.0作为统计学软件，术后第1，2，4，6，8周的改良BBB 评分结果以x±s 表示，采用方差分析，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

脊髓损伤的修复是众多学者的研究热点，各种临床治疗手段难以获得满意效果，多数研究仍处于体外研究阶段[6]。脊髓组织工程需要种子细胞与支架材料有机结合，再通过再生因子等的调节作用重建脊髓组织，达到修复目的。实验中组织工程化脊髓被应用于SD大鼠体内，期望证实其修复脊髓损伤的动物实验效果，为进一步的研究奠定基础。
近年来纳米技术飞速发展，纳米支架材料的性能得到实质性的优化[7]。胶原是良好的组织工程支架原料，应用纳米技术制备或处理可使胶原的机械性能及对种子细胞的调节作用得到很大改善[8-9]。电子纺丝技术因精确性高、可控性强等优点逐渐成为制备纳米级支架的首选方法 [10]，使纳米支架的制备技术及性能得到了飞跃[11]。天然的生物体内基底膜结构大多是胶原构成的纳米级三维拓扑结构，应用静电纺丝技术制备的纳米纤维膜与天然生物体内的基底膜结构相似 [12]，新型的纳米支架可能通过其表面的结构影响种子细胞的生物学行为，促进其增殖及分化，达到神经修复的目的。
通过优选原料及制造技术，应用电子纺丝技术制备以Ⅰ型胶原为原料的纳米纤维膜，电镜测试表征符合设计需要，纤维直径及走行方向符合实验设计要求[13]。良好的性能是优质组织工程用支架的先决条件 [14]。前期实验已经证实好该支架具有良好的物理学特性与生物相容性[13]，能够促进神经干细胞的增殖，具备了构建优质组织工程化脊髓的先决条件。
脊髓组织工程构建需要优质的种子细胞，种子细胞修复脊髓损伤的机制可能为：为损伤部位补充功能性细胞成分，减少瘢痕形成，弥补了内源性修复细胞不足；分泌营养因子等递质改善局部微环境，促进神经再生，诱导神经纤维的形成及延伸，有利于功能性连接的建立；分化形成少突胶质细胞进而形成髓鞘，包裹在神经纤维周围，使神经传导功能得到良好的恢复[15]。实验选用的 SD大鼠脊髓源性神经干细胞具有高度增殖和分化能力，符合优质种子细胞的要求，通过培养及鉴定后可应用于构建脊髓组织工程。纳米纤维膜提供的微环境对种子细胞能否在体内存活并发挥进一步的修复作用至关重要 [16]。
神经组织本身再生能力差，以瘢痕为主，继发性损伤使脊髓修复的局部环境更加恶劣[17]，损伤脊髓难以得到结构重建及功能恢复，是目前临床治疗效果不佳的主要原因。新型纳米支架制植入体内后可发挥的积极作用包括：有效填充损伤缺损区，阻止炎细胞等进入，阻碍瘢痕形成，减轻继发性损伤程度，为神经再生创造有利的微环境；为种子细胞提供良好的载体，为其增殖及定向分化创造有利的微环境，细胞存活并增殖后导引细胞迁移至所需位置，同时为内源性修复细胞提供栖息场所，并为其发挥修复功能创造条件；引导神经纤维的再生方向，随着在设定时间内逐步降解，新生组织逐渐长入，神经纤维则按其三维空间结构导向长入，重建神经连接，恢复功能[18-20]，进而为种子细胞创造良好脊髓修复条件，在内在及外源性调节因子作用下发挥作用，增强脊髓修复效果，使动物的肢体功能可得到一定程度的恢复[21]。
体外实验已证实支架对神经干细胞增殖的促进作用，纳米支架在体内是否能够为神经干细胞存活、迁移及分化创造有利条件，二者构建的组织工程化脊髓修复效果需要进一步证实。组织学观察发现，纳米纤维膜与周围组织及种子细胞的相容性良好，无炎症及异物反应，种子细胞在体内支架微环境中存活良好，支架及周围区域细胞较多。免疫学检测说明局部可能存在一定数量的功能性神经元，表明纳米纤维膜为脊髓修复提供了良好的微环境，神经干细胞在体内良好地发挥修复功能，沿支架方向走行，细胞之间关联紧密，一部分细胞分化为神经元，为功能恢复带来希望。空白对照组模拟了无干预状态下的脊髓损伤过程，组织缺失、瘢痕组织增生、较多空泡的形成印证了自然状态下脊髓脆弱的修复能力。没有附和种子细胞的支架虽然阻碍了瘢痕的形成，但由于内源性修复细胞数量不足，细胞早期处于支架边缘区，不能与支架良好的结合而发挥作用，导致新生组织较少，修复效果欠佳。采用改良的BBB评分对动物肢体功能进行了跟踪检测，结果显示应用纳米组织工程化脊髓的实验动物恢复快速，肢体功能明显优于其他各组，与组织学及免疫学结果相对应，进一步证实了纳米组织工程化脊髓的体内修复作用是明显的。
组织工程化脊髓明显促进了实验动物脊髓损伤的修复，支架材料及种子细胞在体内均能发挥其积极的作用，使脊髓重建及功能恢复达到最佳水平。与大鼠相比，人类的神经系统极为复杂，修复过程更加难以调控，脊髓损伤的治疗任重而道远，干细胞治疗已被应用于脊髓损伤的治疗中，与支架结合是否能够对人类脊髓损伤的修复带来希望将成为众多学者关注的焦点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

纳米组织工程化脊髓修复脊髓损伤

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